Структура лекарственно-устойчивого туберкулеза в Минской области в 2008-2011 гг

Структура лекарственно-устойчивого туберкулеза в Минской области в 2008 — 2011 гг.

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1.1 Особенности строения и функционирования возбудителятуберкулеза

1.2 Туберкулез как инфекционное заболевание

1.2.1 Классификация ТБ

1.2.2 Пути заражения ТБ

1.2.3 Источник заражения ТБ

1.2.4 Возможные исходы заражения

1.3Методы выявления и подтверждения диагноза туберкулеза

1.3.1 Инструментальные методы исследования

1.3.2 Лучевые исследования

1.3.3 Туберкулинодиагностика

1.3.4 Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза

1.3.5 Микроскопическое исследование для выявлениякислотоустойчивых МБТ

1.3.6 Метод посева или культуральный метод выявления M. tuberculosis

1.3.7 Культуральная диагностика туберкулеза с помощью автоматизированной системы BACTEC

1.3.8 Методы исследования лекарственной чувствительности микобактерий

1.3.9 Серологические методы диагностики туберкулеза

1.3.10 Иммунологические и молекулярно-биологические исследования

1.4 Лекарственная устойчивость

1.5 Клинико-фармакологическая характеристика противотуберкулезных препаратов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ВЫВОДЫ ЛИТЕРАТУРА

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Антибактериальные препараты — АБП

Бактерия Кальметта-Герена — БЦЖ

Вирус иммунодефицита человека — ВИЧ

Всемирная организация здравоохранения — ВОЗ

Гидразиды изоникотиновой кислоты — ГИНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота — ДНК

Изониазид — H / INF

Иммуноферментный анализ — ИФА

Кислотоустойчивые микобактерии — КУМ

Число колониеобразующих единиц — КОЕ

Лекарственная устойчивость — ЛУ

Лекарственная чувствительность — ЛЧ

Матричная РНКмРНК

Микобактерии туберкулеза — МБТ

Множественная лекарственная устойчивость — МЛУ

Минимальная подавляющая концентрация — МПК

Мультидрагрезистентность — MDR

Никотинамидадениндинуклеотид — НАД

Полимеразная цепная реакция — ПЦР

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов — ПДРФ

Противотуберкулезные препараты — ПТП

Рибонуклеиновая кислота — РНК

Рифампицин — R /RIF

Синдром приобретенногоиммунодефицита — СПИД

Стрептомицин — S /SM

Транспортная РНК — тРНК

Туберкулез — ТБ

Этамбутол — Е / EMB

С конца 80-х годов XX века во всем мире отмечается повышение заболеваемости туберкулезом (ТБ) (Balter, 1999; Perelman, 2000). Признанная во всем мире стандартная контролируемая химиотерапия ТБ препаратами первого (основного) ряда является эффективной при лечении случаев заболевания, вызываемых чувствительными формами возбудителей. В противоположность этому устойчивость микобактерий туберкулеза (МБТ) к наиболее активным препаратам (изониазид (H) и рифампицин ®) — множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) — в значительном числе случаев предопределяет неудачный исход терапии и высокую вероятность рецидива (Coates, 1983; Mitchison, 1986). Даже среди впервые выявленных больных в 35−50% случаев имеется первичная лекарственная устойчивость к одному и более препаратам, а среди хронических больных практически у всех 100% (Манкеев, 2001).

Для лечения больных туберкулезом, выделяющих МЛУ-возбудителей, необходимо не менее 3 (предпочтительно 4 или 5) лекарственных препаратов, к которым является чувствительной данная бактериальная популяция.

Ухудшение эпидемиологических показателей сопровождается резким нарастанием лекарственной устойчивости (ЛУ) МБТ и неблагоприятными изменениями в ее структуре за счет преобладания мультирезистентных форм (Дорожковаи др., 2000; Viljanenetal., 1998). Высокий уровень мультирезистентности микобактерий туберкулеза приводит к снижению эффективности лечения туберкулеза, что требует использования противотуберкулезных препаратов (ПТП) второго ряда (Maranetra, 1999).

Повышение эффективности лечения впервые выявленных больных и пациентов после неэффективного основного курса является актуальной задачей современной фтизиатрии. Результативность химиотерапии во многом зависит от создания эффективной концентрации препарата в зоне основной микобактериальной популяции (Хоменко, 1996).

Целью работы является проведение мониторинга чувствительности штаммов Mycobacteriumtuberculosis, выделенных в период с 2008 по 2011 год в Минском областном противотуберкулезном диспансере, к противотуберкулезным препаратам, используемым в клинической практике.

1.1 Особенности строения и функционирования возбудителя туберкулеза

Микобактерии туберкулеза — факультативные внутриклеточные паразиты.

МБТ относятся к порядку Actinomycetalis, семейству бактерий Mycobacteriacae, роду Mycobacterium. Род Mycobacteriumнасчитывает свыше 100 видов, большинство из которых являются сапротрофными микроорганизмами, широко распространенными в окружающей среде (Кошечкин, Иванова, 2007).

Возбудитель туберкулеза занимает промежуточное положение между бактериями и низшими грибами. Он был открыт немецким ученым Робертом Кохом 24 марта 1882 г. МБТ имеет форму слегка изогнутой палочки длиной 1−6 мкм и шириной 0,2−0,6 мкм (рис.1). Бактериальная клетка состоит из микрокапсулы, многослойной оболочки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с органеллами (гранулы, вакуоли, рибосомы), ядерной субстанции. Клеточная стенка является барьером, препятствующим проникновению лекарств внутрь клетки МБТ, ограничивает клетку снаружи, обеспечивая механическую защиту. Биополимер пептидогликан, полисахарид арабиногалактан, молекулы миколовых кислот, тесно связанные между собой, образуют своеобразный каркас, составляющий основу клеточной стенки МБТ. В клеточной стенке находятся специфические антигены, вызывающие у макроорганизма развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа и образование антител. В ней же находится корд-фактор, состоящий из липидов и высокомолекулярныхкислот (тригалоза-6,6-димиколат — производноемиколовой кислоты), определяющий вирулентность МБТ.

Рис. 1 -Электронно-микроскопическое исследование МБТ (Ерохин и др., 2008).

В состав цитоплазматической мембраны входят липопротеидные комплексы. С ней связаны различные ферментные системы, в частности окислительно-восстановительные. В бактериальной клетке мембрана является основным осмотическим барьером. Путем инвагинации в цитоплазму она образует мезосомы, имеющие важное значение в жизнедеятельности микробной клетки (например, в синтезе клеточной стенки и др.).

Цитоплазма имеет гранулярные включения, основную часть которых составляют рибосомы, где завершается синтез белка, есть и другие гранулярные структуры.

Ядерная субстанция ответственная за синтез белка и передачу наследственных признаков. Основной способ размножения — деление клетки на две дочерние. Носителем генетической информации кроме хромосомы могут быть и плазмиды, которые благодаря малому размеру способны проникать из клетки в клетку. Основными биохимическими компонентами МБТ являются туберкулопротеиды, липиды и полисахариды. Белковая фракция — основной носитель антигенных свойств микобактерий. Липидные фракции способны стимулировать специфическую воспалительную реакцию макроорганизма с образованием элементов туберкулезной гранулемы (эпителиоидных и гигантских клеток).

Туберкулез вызывают три вида бактерий: человеческий — M. tuberculosis, бычийM. bovis, африканский — M. africanum. В Беларуси и России почти у всех больных выявляют M. tuberculosis. В Западной и Центральной Африке от 40 до 80% случаев легочного туберкулеза вызываются M. africanum, он выделен и у обезьян. У крупного рогатого скота преобладает M. bovis. Однако животные могут болеть и туберкулезом, вызванным человеческим видом. Заболеваемость крупного рогатого скота в личном хозяйстве бактериовыделителей в пять раз выше, чем в семьях, где проживают здоровые лица.

В настоящее время расшифрован геном МБТ, состоящий из 400 генов, 4 111 529 пар нуклеотидов с большой способностью к мутации (рис. 2). Известны гены, определяющие лекарственную устойчивость, системы превращения противотуберкулезных препаратов в безвредные вещества. Особенностью генома МБТ является наличие генов, дублирующих функционирование ключевых ферментных систем, т. е. процессы, на которые действует химиопрепарат, могут перестать быть необходимыми клетке для ее жизнедеятельности. В настоящее время установлено влияние генома МБТ на клинические особенности и течение туберкулеза. Так, при туберкулезе, вызванном штаммами семействами Beijing, отмечаются более выраженная клиническая симптоматика и более тяжелое течение, чем при наличии МБТ других (индивидуальных) генотипов (Гельберги др., 2009).

На внешнем (цветном) кольце указан масштаб (каждая градация соответствует 106 пар нуклеотидов) и начало транскрипции (0). На первом (после масштабного) кольце показаны позиции стабильных ДНК генов и прямых повторов; на втором — кодирующие рамки; на третьем — инсерционные повторы; на четвертом — семейства генов кислых белков; на пятом — гены белков, богатых глицином; на шестом — множественные копии полиморфных повторов; в центре — содержание гуанина и цитозина.

Рис. 2- Генетическая карта хромосомы M. tuberculosis H37Rv (Coleetal., 1998).

Кроме МБТ существует много атипичных микобактерий, которые мало вирулентны для человека. Однако у ослабленных людей, особенно ВИЧ-инфицированных, они могут вызвать заболевания, называемые микобактериозами. Клинически и рентгенологически они сходны с туберкулезом, но считаются незаразными. Атипичные микобактерии, по Раньяну, делятся на четыре группы: Й — фотохромогенные, образующие пигмент на свету; ЙЙ — скотохромогенные, образующие пигмент в темноте; ЙЙЙ — нефотохромогенные, не образующие пигмента; ЙV — быстрорастущие. Чаще в патологии человека имеют значение комплексы M. avium — intracellulare (ЙЙЙ группа), M. kanssi (Й группа), M. scrofulacum (ЙЙ группа), M. fortuitum (ЙV группа) и другие, хотя большинство микобактерий ЙV группы относится ксапротрофам. Атипичные микобактерии устойчивы к ряду противотуберкулезных препаратов, поэтому лечение микобактериозов подчас затруднено. Микобактериоз, как и туберкулез, считают ВИЧассоциированной инфекцией, при которой могут возникнуть распространенные, иногда генерализованные процессы.

Для микобактерий туберкулеза характерен полиморфизм: бывают зернистые, ветвистые и другие формы. Особое значение имеют L-формы, у которых нарушено образование клеточной стенки, снижена способность к размножению. Эта форма существования микобактерий в виде «дремлющей» инфекции называется персистированием. В таком виде они могут сохраняться годами, поддерживая противотуберкулезный иммунитет, но при неблагоприятных для человека условиях способны переходить в обычные формы и приводить к эндогенной реактивации туберкулезного процесса. Микобактерии противотуберкулезной вакцины БЦЖ также могут переходить в L-формы. Отсутствие типичных МБТ в мокроте больных не исключает наличия L-форм. Встречаются также ультрамелкие формы МБТ, проходящие через бактериальные фильтры. В процессе химиотерапии их удельный вес возрастает. Некоторые ученые придают им значение в этиологии саркоидоза (Гельберг и др., 2009).

Морфология и размеры микобактериальных клеток, а также их способность к кислотоустойчивому окрашиванию подвержены значительным колебаниям и во многом зависят от возраста микроорганизма и особенно от условий его существования и состава питательной среды (рис. 3).

Обычно в патологическом материале микобактерии туберкулеза наблюдаются либо единично, в виде маленьких групп по 2−3 палочки, а иногда небольшими группами, в которых палочки расположены беспорядочно (рис. 4) (Ерохин и др., 2008).

Рис. 3 — Измененная МБТ в макрофаге из туберкулезной гранулемы (электронно-микроскопическое исследование) (Ерохин и др., 2008).

Рис. 4 — КУМ при окраске по Цилю-Нильсену. Увеличение Ч1000(Ерохин и др., 2008).

Микобактерии (к которым относятся и микобактерии туберкулеза) являются кислото-, щелочеи спиртоустойчивыми и объединены общим признаком — способностью стойко сохранять воспринятую окраску даже после воздействия кислот и кислого спирта. Данное свойство имеет первостепенное значение для микобактерий, так как на нем основаны практически все методы микробиологического выявления и идентификации этих микроорганизмов. Способность к кислотоустойчивому окрашиванию используется в клинической микобактериологии при специфической окраске диагностического материала при микроскопии, устойчивость к кислотам и щелочам — при селективной обработке диагностического материала с целью элиминации нетуберкулезной микрофлоры перед посевом.

Необходимо отметить, что способность к кислотоустойчивому окрашиванию не является исключительным свойством микобактерий туберкулеза: это свойство в той или иной степени присуще и другим, в том числе сапрофитным микобактериям, а также другим бактериям и живым объектам, например представителям родов Corinebacteriumи Nocardia, спорам B. cereus.

Способность микобактерий к кислотоустойчивому окрашиванию — это устойчивость к обесцвечиванию кислым спиртом или минеральными кислотами в высоких концентрациях (например, 25% серная кислота) после проведения окраски микобактерий анилиновыми красителями (основным фуксином или аурамином О) в 5% растворе фенола (то есть карболовым фуксином или карболовым аурамином).

Кислотоустойчивость микобактерий туберкулеза связана с большим содержанием липидов в их цитоплазме, а также с целостностью их клеточной структуры и определяется двумя важнейшими факторами: во-первых, наличием в цитоплазме кислотоустойчивых липидов типа миколовой кислоты и ее производных (миколовая кислота является единственным обладающим кислотоустойчивостью веществом у микобактерий туберкулеза), а во-вторых — особыми свойствами клеточной оболочки, затрудняющими обратный выход красителя при воздействии кислоты и алкоголя.

Таким образом, кислотоустойчивость микобактерий туберкулеза имеет двойственную природу и обусловлена, во-первых, удержанием красителя внутри бактериальной клетки и, во-вторых, связыванием красителя с остатками миколовых кислот клеточной стенки. Связывание красителя с пептидогликолипидами клеточной стенки увеличивает ее гидрофобность и способствует удержанию красителя в цитоплазме, что определяет яркость окраски. Кислотоустойчивость выявляется с помощью только специальных методов окраски с использованием карболовых производных анилиновых красителей. Одним из таких методов является метод окраски по Цилю-Нильсену (Ерохин и др., 2008).

МБТ хорошо переносят низкую температуру. Могут годами храниться в холодильнике, оставаясь жизнеспособными. Установлено, что при длительном нахождении при температуре -70⁰С МБТ сохраняли 100% выживаемость и биологические свойства. В темных сырых помещениях МБТ сохраняются несколько месяцев, на белье, мебели и одежде, на рассеянном свету, в высохшей мокроте — в течении месяца. На страницах книг МБТ могут оставаться жизнеспособными до трех месяцев. Они погибают при кипячении, воздействии хлорсодержащих (хлорамин, хлорная известь) препаратов, используемых для дезинфекции, а также под влиянием ультрафиолетовых лучей, в частности, прямого солнечного света. В настоящее время применяются новые дезинфекционные средства, не содержащие хлора (полидез, септоцид, триацид и др.), действующие на МБТ. Из других физических факторов губительное действие на микобактерии проявляет ультразвук.

Микобактерии туберкулеза являются факультативными аэробами, т. е. могут существовать и при незначительном доступе воздуха. Размножаются они медленно. Если время деления E. coliinvitroсоставляет около 20 минут, то дляM. tuberculosisна плотных средах оно достигает 24 часов. Это свойство патогенных микобактерий обуславливает, с одной стороны, длительные сроки их микробиологической диагностики, а с другой — продолжительность развития инфекциии длительность курсов химиотерапии.

Видимый рост на плотных питательных средах проявляется на 14−20 сутки после посева материала; в жидких — на 6−8 сутки при посеве лекарственно-чувствительных и на 12−14 сутки — устойчивых штаммов МБТ. Для их нормального развития требуются сложные многокомпонентные питательные среды. Рост наблюдается обычно в виде шероховатых (R-вариантов) колоний.

О наличии корд-фактора свидетельствует своеобразный рост в микроколониях. Он характеризуется параллельным (склеенным) расположением бактериальных клеток с формированием «жгутов, кос, веревок», их переплетений (Гельберги др., 2009).

1.2 Туберкулез как инфекционное заболевание

Туберкулез (ТБ) является инфекционным заболеванием, вызываемым микобактериями туберкулезного комплекса. Микобактерии способны поражать любой орган, однако чаще всего заболевание имеет легочную локализацию (рис. 5). Туберкулез легких чаще других форм туберкулеза приводит к смерти пациента.

Рис. 5 — Формы туберкулеза (по данным Rieder, 1985).

1.2.1 Классификация ТБ

Согласно классификации, принятой в 1974 г., различают следующие формы туберкулёза органов дыхания:

1) первичный туберкулёзный комплекс;

2) туберкулёз внутригрудных лимфатических узлов;

3) диссеминированный туберкулёз лёгких;

4) очаговый туберкулёз лёгких;

5) туберкулома лёгких;

6) кавернозный туберкулёз лёгких;

7) инфильтративный туберкулёз лёгких;

8) фибриозно-кавернозный туберкулёз лёгких;

9) цирротический туберкулёз лёгких;

10) туберкулёзный плеврит;

11)туберкулёз верхних дыхательных путей, трахеи, бронхов;

12)туберкулёз органов дыхания, комбинированный с пневмокониозами.

1.2.2 Пути заражения ТБ

Несмотря на то, что известны случаи энтеральногозаражения туберкулезом и заражения через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки, основным путем распространения инфекции является воздушно-капельный путь. Больные туберкулезом с бактериовыделением образуют при кашле, разговоре или пении аэрозоль с инфицирующим агентом — микобактерией туберкулеза в аэрозольном ядре (рис. 6).

Образовавшиеся аэрозольные частицы имеют различные размеры. Наиболее крупные быстро оседают. Частицы размером 5 мкм, содержащие в себе возбудитель инфекции, могут сохраняться во взвешенном состоянии несколько часов. При вдыхании они проникают в глубокие отделы легких через мелкие бронхи, и содержащиеся в них микобактерии могут, внедрившись в легочную ткань, образовать первичный очаг заболевания.

Рис. 6 — Образование аэрозоля при кашле, разговоре, пении (Loudon, 1968).

1.2.3 Источник заражения ТБ

Основной источник заражения ТБ— больной открытой формой туберкулеза, то есть выделяющий туберкулезную инфекцию. Такие больные составляют от 50 до 75% среди всех впервые выявленных больных ТБ. Один бациллярный больной за год может инфицировать около 10 человек. При средней продолжительности жизни такого больного, в случае отсутствия лечения в течение двух лет, он инфицирует до 20 человек и более (Манкеев, 2001).

1.2.4 Возможные исходы заражения

В условиях нашей страны впервые заражаются ТБ, как правило, в детстве. Большинство остается здоровыми, но инфицированными. Заражение в большинстве случаев не приводит к заболеванию в связи с наличием у человека высокой степени врожденной резистентности к ТБ. При обратном развитии образовавшегося туберкулезного воспаления формируется петрификат. Инфицирование проявляет себя появлением впервые в жизни положительной реакции на туберкулиновую пробу Манту. При этом в организме формируется приобретенный иммунитет, поддерживаемый пожизненно живой инфекцией. В этом положительная роль инфицирования. Отрицательная роль его заключается в опасности активации инфекции в петрификатах и развитии заболевания. Заболевание, развивающееся в результате первичного инфицирования, называется первичным туберкулезом. Опасность заболевания первичным ТБ сохраняется до завершения обратного развития морфологических туберкулезных изменений с формированием петрификата. От момента заражения до обратного развития изменений проходит не менее 3 лет, иногда этот период затягивается до 5 лет. Считается, что заболевает первичным туберкулезом около 5% от числа инфицированных. Первичным туберкулезом преимущественно болеют дети.

Заболевание, развивающееся в результате активации инфекции в петрификатах или повторного заражения, называется вторичным. Такой туберкулез развивается чаще у взрослых через годы и десятки лет после первичного заражения МБТ. При этом на протяжении оставшейся жизни заболевает еще 5−10%. В современных неблагоприятных эпидемиологических условиях нередко вторичным ТБ заболевают и дети старшего возраста, подростки. Преобладающее большинство заболевающих туберкулезом среди населения в нашей стране составляют больные вторичным туберкулезом.

Таким образом, наличие туберкулезной инфекции в организме является обязательным, но далеко не единственным условием развития заболевания (Копылова и др., 2007).

1.3 Методы выявления и подтверждения диагноза туберкулеза

1.3.1 Инструментальные методы исследования

Ведущее значение в инструментальной диагностике туберкулеза принадлежит эндоскопическим исследованиям.

Бронхоскопическое обследование обязательно для больных с любым патологическим процессом в легочной ткани и/или внутригрудных лимфатических узлах, что обусловлено как ценностью визуального осмотра, так и возможностью проведения в ходе исследования различных биопсий.

Показанием к прямой биопсии скусыванием или соскобом является патологический процесс (бугорки, бляшки, инфильтраты) в трахее и бронхах I-III порядка.

Катетер-биопсия — катетеризация мелких бронхов с аспирацией материала для цитологического, гистологического и микробиологического исследований; ее проводят при округлых образованиях в легочной ткани, полостях, инфильтратах, реже — при диссеминациях. Информативность метода невысока (25−30%) (Кошечкин, Иванова, 2006).

Браш-биопсия (щеточная) выполняется в аналогичных случаях с помощью управляемой нейлоновой или капроновой щеточки через канал фибробронхоскопа и позволяет получить материал высокого качества для цитологического исследования. Биопсии следует подвергать наиболее дистально расположенные бронхи.

Трансбронхиальную пункцию внутригрудных лимфатических узлов через стенку трахеи или бронхов проводят прямой, снабженной мандреном иглой длиной 50−55 см, имеющей над рабочей частью ограничительную шайбу на расстоянии 2−2,5 см. Эффективность метода зависит от степени гиперплазии лимфатических узлов средостения (чем больше их размеры, тем результативнее пункция) и в целом составляет несколько более 50%.

Трансбронхиальную биопсию легких проводят при помощи щипцов из стандартного набора инструментов через фибробронхоскоп под местной анестезией с одной стороны (чтобы избежать опасности двустороннего пневмоторакса). Процедура проходит под контролем ощущений больного.

Для полноценного морфологического исследования необходимо не менее четырех биоптатов. Эффективность метода достигает 80−85% (Кошечкин, Иванова, 2006).

Медиастиноскопия с биопсией лимфатических узлов средостения — безопасный, надежный и эффективный метод, диагностическая эффективность которого составляет более 90%, а количество осложнений — не более 2% (Кошечкин, Иванова, 2006). Исследование производят с помощью ларингоскопа под интубационным наркозом.

Медиастиноплевроскопия позволяет биопсировать как лимфатические узлы средостения, так и легочную ткань, но сложнее в техническом отношении.

Торакоскопическое исследование с биопсией легкого и плевры сочетает высокую информативность и сравнительно малую инвазивность. Возможно использование торакоскопа или фибробронхоскопа, но наибольшие возможности дает использование современных видеоэндоскопических комплексов. Биопсия измененных участков париетальной и висцеральной плевры проводится скусыванием щипцами с коагуляцией дефекта в легком диатермокоагулятором. При биопсии легкого с помощью щипцов из стандартного набор инструментов можно получить биоптат объемом до 10 мм, а при использовании электрохирургической петли типа «овал» или «серп» -3−9 см. Эффективность метода при этом превышает 90% (Кошечкин, Иванова, 2006).

Несмотря на высокую результативность эндоскопических методов исследования, в диагностике туберкулеза сохраняют значение и хирургические методики биопсии, что связано с описываемыми ниже пределами морфологического метода исследования.

Парастернальнаямедиастинотомия имеет некоторые преимущества перед медиастиноскопией (лучше обзор, имеется возможность иссечения кусочка легочной ткани, надежнее гемостаз и прочее), однако более травматична.

Открытая биопсия легкого является высокоэффективным методом диагностики и заключается в иссечении кусочка легочной ткани при небольшой по протяженности межреберной торакотомии. Но помимо несомненных достоинств (диагностическая эффективность не менее 95%), открытая биопсия имеет и недостатки. Выполняемая под интубационным наркозом, она приводит к усилению рестриктивных нарушений функции внешнего дыхания, что повышает риск вмешательства. Отмечается и довольно высокое (до 5%. и более) число осложнений (длительное накопление в плевральной полости экссудата, развитие пневмоторакса, гемоторакса и проч.) (Кошечкин, Иванова, 2006).

Трансторакальную биопсию проводят при локализации патологических изменений в наружных (кортикальных) отделах легкого с помощью обычных тонких игл (аспирационная биопсия), либо более толстых игл специальной конструкции, позволяющих получить образцылегочной ткани и плевры не только для цитологического, но и для гистологического исследования (трепанационная или пункционная биопсия).

Обязательным методом исследования при наличии у больного жидкости в плевральной полости является плевральная пункция.

При диагностике туберкулеза органов дыхания могут производиться также биопсии иных органов (периферических лимфатических узлов, кожи, мягких тканей и др.).

1.3.2 Лучевые исследования

По мере снижения распространенности туберкулеза и увеличения удельного веса иных заболеваний органов дыхания выявились пределы рентгенологических методов диагностики туберкулеза. Рентгенологические методы позволяют хорошо выявить и детализировать структурные изменения в пораженном органе, но определяемые скиалогические признаки не могут однозначно определить этиологию процесса.

Для выявления лиц с подозрительными на туберкулез органов дыхания изменениями при массовых обследованиях населения используют флюорографию (фотографирование изображения с рентгеновского экрана на фотопленку). В зависимости от аппарата получают кадры размером 70×70 или 100×100 мм. Метод обладает высокой производительностью, однако имеет ряд технических ограничений (в частности, недостаточно четко отображает патологические образования небольших размеров). Поэтому точное установление диагноза туберкулеза на его основании невозможно. Принципиально новые возможности открывает развитие цифровой лучевой техники, позволяющей получить изображение высокого качества и значительно снизить лучевую нагрузку. Преимуществом цифровой флюорографии перед традиционной пленочной является широкий динамический диапазон и высокая контрастная чувствительность, а также возможность компьютерной обработки изображения, что позволяет надежно выявлять даже незначительные изменения в биологических тканях различной плотности. Все это достигается при снижении лучевой нагрузки на пациента в 10 и более раз по сравнению со стандартной пленочной флюорографией и в 2−3 раза в сравнении с крупноформатной рентгенографией. Эффективность метода определяется быстротой получения изображения (несколько секунд), полным отсутствием брака изображения (при пленочной флюорографии — 8−15%), исключением использования дорогостоящей фотопленки, фотолабораторного оборудования и реактивов, надежностью архивации результатов (Кошечкин, Иванова, 2007).

Рентгенография, проводимая в различных проекциях, является основным первичным лучевым методом подтверждения диагноза туберкулеза органов дыхания. Метод при соблюдении технических требований отличается высокой степенью стандартизации, позволяет наглядно и быстро представлять и надежно архивировать результаты исследования. Достоинством является и относительная дешевизна исследования при высокой информативности. У части больных метод обеспечивает получение информации, достаточной для установления диагноза. Для уточнения характера выявленных при рентгенографии изменений применяется томография — получение послойных отображений легочной ткани и органов средостения, что позволяет уточнить структуру патологических изменений (Кошечкин, Иванова, 2007).

1.3.3 Туберкулинодиагностика

Туберкулинодиагностика является ценным методом, дополняющим клинический диагноз туберкулеза. Она указывает на наличие специфической сенсибилизации организма, обусловленной вирулентными МБТ или вакциной БЦЖ.

Для туберкулиновых проб применяют туберкулин. Впервые туберкулин был выделен из продуктов жизнедеятельности микобактерий туберкулеза Р. Кохом в 1890 г. Он представляет собой водно-глицериновый экстракт из бульонной культуры туберкулезных бактерий. Туберкулин не обладает полными антигенными свойствами, т. е. не сенсибилизирует здоровый организм и не вызывает образования противотуберкулезного иммунитета. Его действующим началом является туберкулеопротеин. Главным термостабильным компонентом туберкулина считается антиген А60. Туберкулин вызывает ответную реакцию только у людей, предварительно сенсибилизированных МБТ или вакциной БЦЖ. На месте внутрикожного введения туберкулина через 24−48 ч развивается специфическая аллергическая реакция замедленного типа в виде формирования инфильтрата. Патоморфологически инфильтрат характеризуется отеком всех слоев кожи с мононуклеарной и гистиоцитарной реакцией. Эта реакция характеризует степень аллергии — изменение чувствительности или реактивности организма на туберкулин, но не является мерой иммунитета (Кошечкин, Иванова, 2007).

1.3.4 Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза

Лабораторная диагностика обеспечивает выполнение главной задачи диагностики и лечения туберкулеза — выявление у больного МБТ. В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики:

1) сбор и обработка диагностического материала;

2) микроскопическая идентификация МБТ в выделяемых субстанциях или тканях;

3) культивирование;

4) определение резистентности к препаратам;

5) серологические исследования;

6) использование новых молекулярно-биологических методов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (Кошечкин, Иванова, 2007).

1.3.5 Микроскопическое исследование для выявления кислотоустойчивых МБТ

Для микроскопического исследования мазок приготавливают непосредственно из необработанного диагностического материала или осадка жидкого материала (метод прямой микроскопии), либо из материала, подготовленного путем гомогенизации, обеззараживания и центрифугирования (метод микроскопии мазка из осадка). Метод микроскопии мазка из осадка более информативен, поскольку обеспечивает обогащение материала за счет освобождения микробов из окружающей их слизи и их осаждения при центрифугировании.

При подозрении на туберкулез органов дыхания необходимо исследовать не менее трех проб мокроты, поскольку результативность микроскопической диагностики повышается при исследовании второго мазка на 10−14%, а при исследовании третьего мазка — еще на 5−8% (Перельман, 2001).

Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте большинства больных содержится меньше микобактерий, чем может выявить микроскопия. Микроскопия мазка, окрашенного по методу Циля-Нильсен, является наиболее распространенным методом выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ). Приготовление мазка включает фиксацию, окраску фуксином (при нагревании и действии карболовой кислоты краситель проникает в микробную клетку, особенно в клеточную стенку), обесцвечивание (в 25% растворе H₂S0₄ или 3% растворе солянокислого спирта обесцвечивается краситель, проникший в структуры, не обладающие достаточной кислотоустойчивостью), контрастирующую окраску (метиленовым синим для придания препарату контрастности).

Окрашенные по Цилю-Нильсен мазки исследуют с помощью светового микроскопа (бинокулярного или оснащенного бинокулярной насадкой). Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза (1−10 мкм в длину и 0,2−0,6 мкм в ширину) видны обычно в виде тонких изящных палочек (иногда изогнутых или извитых) малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Они располагаются поодиночке, парами или в виде групп и хорошо выделяются на голубом фоне препарата. Характерным считается расположение бактериальных клеток в виде римской цифры «V». Внутри микробных клеток можно обнаружить более интенсивно окрашенные участки, что делает их похожими на «бусы» (слабо окрашенные участки видны в виде «полос»).

При выявлении измененных форм возбудителя (скопления кислотоустойчивых зерен, округлые, L-трансформированные или ветвистые мицелиеподобные структуры) положительный ответ об обнаружении кислотоустойчивых микроорганизмов должен быть подтвержден дополнительными методами исследования, иначе результат должен быть расценен как отрицательный.

Люминесцентная микроскопия основана на том, что специальные красители (аурамин, родамин и др.) связываются с воскоподобными структурами М. tuberculosis и окрашенные клетки при ультрафиолетовом облучении определенного спектра начинают светиться оранжевым или ярко-красным светом на черном или темно-зеленом фоне. Образующийся за счет свечения ореол увеличивает видимые размеры клеток, поэтому люминесцентную микроскопию можно проводить при увеличении 250х-450х, что увеличивает поле зрения и существенно сокращает время, необходимое для просмотра мазка. Поиск микобактерий облегчает также значительная резкость и контрастность картины, что особенно ценно при исследовании олигобациллярного материала. По чувствительности люминесцентная микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), незначительно уступает методу посева, но применение ее целесообразно в лабораториях, выполняющих большое число исследований (50 и более ежедневно).

Во всех сомнительных случаях мазок, окрашенный люминесцентными красителями, следует исследовать повторно, перекрасив его по Цилю-Нильсен.

Опыт фтизиатров всего мира доказал, что «золотым стандартом» диагностики туберкулеза является сочетание культурального и микроскопического методов исследования, которые остаются актуальными, несмотря на появление большого числа альтернативных методов (Браженко, 2006).

1.3.6 Метод посева или культуральный метод выявления M. tuberculosis

Достоверно подтвердить туберкулезную природу заболевания и изучить биологические свойства выделенного можно только при выделении культуры M.tuberculosis. Культуральное исследование следует проводить во всех случаях подозрения на туберкулез, используя не менее двух разных по составу питательные среды (Левенштейна — Йенсена и Финна-П). Жидкие питательные среды используют для нейтрализации рН посевного материала, при изучении лекарственной чувствительности и т. д. (чаще используется среда Школьниковой).

При исследовании на плотных питательных средах ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий дают при появлении характерных колоний не ранее 3−4 недель инкубации и только после подтверждения кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при микроскопииокрашенного по Цилю-Нильсен мазка из выросших колоний. Величина КОЕ (число колониеобразующих единиц) высчитывается как среднее из числа колоний, выросших на всех пробирках. Интенсивность роста обозначают следующим образом:

+ 1−20 КОЕ «скудное» бактериовыделение;

++ 21−100 КОЕ «умеренное» бактериовыделение;

+++ > 100 КОЕ «обильное» бактериовыделение.

Затем изучают биологические свойства выросшей культуры, ее идентифицируют и определяют принадлежность к комплексу M. tuberculosis, а также определяют чувствительность к противотуберкулезным препаратам.

В качестве методов, альтернативных классическому культуральному исследованию, возможно использование автоматизированных и полуавтоматизированных систем ускоренной культуральной диагностики: ВАСТЕС, MGIT (ручная и автоматическая), МВ/ВасТ. Все они используют жидкие питательные среды и различаются по способу индикации роста микобактерий (Голышевская и др., 2008).

1.3.7 Культуральная диагностика туберкулеза с помощью автоматизированной системы BACTEC

Система ВАСТЕС 460 — радиометрический метод быстрого определения роста МБТ путем регистрации уровня меченого СО₂, образующегося в процессе утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный ¹⁴С. Для роста МБТ в данной системе используют флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную среду Middlebrook 7H9, содержащую радиоактивный¹⁴С. При размножении МБТ утилизируют ¹⁴С и выделяют ¹⁴СО₂, в этом случае учет идет по нарастанию ¹⁴СО₂(Мишин, 2009).

Система ВАСТЕС MGIT 960 — индикаторные пробирки MGIT (M. GrowthIndicatorTube) с той же средой Middltbrook 7H9, содержат в придонной части флюоресцирующий индикатор (трис-4,7-дифенил-1,0-фенантролин рутениум хлорид пентагидрат), «погашенный» высокими концентрациями О₂. В процессе роста МБТ поглощают О₂, что сопровождается усилением свечения индикатора, интенсивность которого оценивают при помощи трансиллюминатора.

Рост МБТ в системе ВАСТЕС регистрируют на 4−5-й день от момента посева мокроты.

Культуральный метод и систему ВАСТЕС применяют также для определения лекарственной устойчивости МБТ (Мишин, 2009).

При положительных данных бактериоскопическогоисследования рост МБТ обнаруживали радиометрически на 7−10-й день и на 14−21-й дни при отрицательных данных.

К недостаткам этого метода, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся:

· высокая себестоимость исследования;

· необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радиометрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией;

· необходимость дополнительного посева на плотную питательную среду при возникновении проблем с идентификацией или интерпретацией результатов (Бардисявичене, Сосновская, 1996).

туберкулез возбудитель заражение лекарственный

1.3.8 Методы исследования лекарственной чувствительности микобактерий

Для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБТ должны использоваться только стандартизованные методы исследования, что позволяет:

· правильно вести лечение пациентов;

· интерпретировать и сравнивать данные, полученные из различных источников;

· проводить оценку уровней лекарственной устойчивости и тенденций, наблюдаемых в разных регионах или странах.

В настоящее время нет единого универсального метода определения ЛЧ МБТ. Имеются культуральные методы с использованием плотных и жидких питательных сред, с полуавтоматической и автоматической детекцией роста микобактерий, а также молекулярно-генетические экспрессные методы.

Все имеющиеся методы определения ЛЧ МБТ можно условно разделить на 2 категории:

· методы прямого определения ЛЧ МБТ;

· методы непрямого определения ЛЧ МБТ.

При использовании методов прямого определения ЛЧ МБТмокрота или другие клинические материалы, предварительно обеззараженные и прошедшие гомогенизацию, высеваются непосредственно на среды, содержащие и не содержащие соответствующий препарат. Количество инокулята определяется в зависимости от количества КУМ, определенного при микроскопии мазка.

Методы прямого определения ЛЧ имеют ряд недостатков:

1) для исследования нельзя использовать образцы диагностического материала, имеющие отрицательный результат микроскопии;

2) при проведении данного исследования повышается риск контаминации;

3) может наблюдаться недостаточный рост культуры, не позволяющий сделать достоверные выводы.

При использовании методов непрямого определения ЛЧ МБТпроводится выделение микроорганизмов из клинических образцов при культивировании, а затем на контрольную и содержащую препарат яичную или плотную агаровую среду высевается гомогенная суспензия или культура, выросшая на бульоне.

В литературе описаны три основных классических микробиологических метода непрямого определения ЛЧ МБТ:

1) Метод пропорций, предложенный в 1963 г. Canetti, RistandGrosset и детализированный в 1985 г. MiddlebrookandCohn;

2) Метод коэффициента устойчивости, разработанный в 1961 г. Mitchison и др.

3) Метод абсолютных концентраций на плотных и жидких средах, модифицированный в 1970 г. Meissener (Севастьянова, 2009).

В Беларуси наиболее распространенным и традиционно используемым методом определения ЛЧ МБТ является непрямой метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена. Остальные методы тестирования ЛЧ МБТ являются альтернативными.

1.3.9 Серологические методы диагностики туберкулеза

Серологические методы изучения компонентов плазмы крови при туберкулезе разрабатывались на протяжении всего XX столетия. Особый интерес исследователей концентрировался на использовании серологических методов при изучении внелегочных форм туберкулеза. Однако, в отличие от многих инфекционных болезней, для которых серодиагностика оказалась эффективным инструментом, для туберкулеза этот тип исследования не достиг достаточного уровня чувствительности и специфичности, что определяло бы обоснованность его использования в клинической практике.

Таким образом, пока эти методики не позволяют в значительной степени повысить диагностическую и экономическую способность традиционных методов обнаружения туберкулеза (микроскопия МБТ и культуральные методы выявления МБТ). Однако в результате быстрого прогресса в разработке сложных молекулярно-биологических методов, несомненно, в скором времени будет создан новый, эффективный и дешевый серологический тест выявления туберкулеза (Кошечкин, Иванова, 2006).

1.3.10 Иммунологические и молекулярно-биологические исследования

Определение противотуберкулезных антител для диагностикитуберкулеза было начато еще в 20-е гг. XX века (лейкогглютинация, лейкоцитолиз, пассивная гемагглютинация). С конца 70-х гг. развиваются методы иммуноферментного анализа (ИФА), широко распространенные в клинической практике (например, для диагностики вирусных гепатитов или ВИЧ-инфекции). В диагностике туберкулеза серологические методы, в том числе ИФА, не оправдали всех возлагавшихся надежд, поскольку не удалось обнаружить специфичных антигенов М. tuberculosis, на которые у большинства больных вырабатываются соответствующие антитела.

Существующие иммуноферментные тест-системы обладают специфичностью на уровне 90−94% (6−10% ложноположительных результатов у здоровых лиц или больных нетуберкулезными заболеваниями), тогда как чувствительность (число положительных результатов у больных активным туберкулезом) составляет, в среднем, около 70% (Вишневская, 1998). Поэтому говорить о самостоятельном значении данного метода для дифференциальной диагностики туберкулеза органов дыхания пока не представляется возможным. Предложенные в последние годы для определения противотуберкулезных антител иммунохроматографические тесты хотя и отличаются простотой и быстротой выполнения, но обладают теми же недостатками, что и традиционный ИФА.

Для определения антигенов М. tuberculosis используются аффинно очищенные антисыворотки против микобактерий. Для определения антигенов в сыворотке крови необходимо диссоциировать иммунные комплексы, но в плевральной и в спинномозговой жидкости антигены можно определять методом непрямого твердофазового иммуноферментного анализа. Главной проблемой является получение антител, обеспечивающих достаточную специфичность и чувствительность исследования, особенно при непосредственном использовании клинического диагностического материала.

Молекулярно-генетические методы обнаружения М. tuberculosis основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип метода состоит в циклическом повторении трех стадий реакции:

1) денатурации ДНК при нагревании;

2) гибридизации искусственно синтезированных олигонуклеотидов с фланговыми участками цепей амплифицируемого фрагмента ДНК (так называемых «праймеров» или «затравочных» фрагментов);

3) синтеза (достройки) цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Многократное удвоение цепей ДНК (30−40 циклов) позволяет в течение нескольких часов умножить (амплифицировать) специфический участок ДНК в геометрической прогрессии, а затем идентифицировать его (при электрофорезе в агарозном геле в присутствии красителя бромидэтидия синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы) (Вишневская, 1998).

Высокая чувствительность (теоретически возможно определять единичные М. tuberculosis в образце) и быстрота проведения анализа (1−2 дня) чрезвычайно ценны для клинической практики. Метод эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (в том числе L-форм), определение которых требует длительного культивирования и сложныхпитательных сред. Однако метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.

Метод ПЦР перспективен для дифференциации М. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий (в том числе и после культивирования микобактерий, особенно на жидких питательных средах с использованием систем типа ВАСТЕС) и для быстрого определения лекарственной устойчивости. Штаммовая идентификация М. tuberculosis позволяет определять внутривидовые различия возбудителя туберкулеза и представляет интерес для эпидемиологических исследований и определения роли суперинфекции при рецидивах туберкулеза. Проблема специфичности ПЦР в диагностике туберкулеза обусловлена высоким риском ложноположительных результатов, поскольку продукты амплификации (фрагменты ДНК) легко могут попасть в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций. Это определяет очень жесткие требования к технологии проведения анализов, в том числе — раздельные помещения для каждой из трех стадий анализа. Проблема может быть решена за счет инактивации загрязняющих молекул специальными реагентами и совершенствования технологии подготовки клинических образцов (выделение ДНК на микропористых частицах стекла, иммуномагнитная сепарации микобактерий и проч.).

Использование методов, основанных на амплификации фрагментов генома микобактерий (ПЦР), допускается как дополнительный метод ускоренной дифференциальной диагностики туберкулеза при обязательном параллельном применении классических микробиологических методов (Вишневская, 1998).

1.4 Лекарственная устойчивость

Чувствительность микобактерий к ПТП определяется неспособностью штамма расти в среде, содержащей препарат, при стандартных условиях постановки опыта. Чувствительными к препарату считаются те штаммы микобактерий, на которые этот препарат в критической концентрации оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие в соответствии с принятым критерием устойчивости.

Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации.

Наряду с понятиями «чувствительность» и «устойчивость» к ПТП в настоящее время используются также термины, определяющие различные аспекты ЛУ.

Монорезистентность — штаммы МБТ резистентны только к одному из пяти ПТП первого ряда (рифампицин, изониазид, этамбутол, пиразинамид, стрептомицин).

В случае наличия устойчивости к двум или более лекарственным препаратам данный штамм микобактерий определяется как полирезистентный.

Особое место среди полирезистентных занимают микобактерии, у которых обнаруживается ЛУ к двум основным ПТП (изониазиду и рифампицину): штаммы, обладающие ЛУ одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия устойчивости к другим ПТП, обозначаются как штаммы с множественной лекарственной устойчивостью. Им уделяется особое внимание, так как лечение пациентов, у которых патологический процесс вызван такими штаммами, сопряжено с большими трудностями. Оно длительное, дорогостоящее и требует использования препаратов резервного ряда, многие из которых также дорогостоящи и могут вызывать тяжелые побочные реакции. Кроме того, некоторые штаммы обладают повышенной способностью к распространению и вызывают тяжелые прогрессирующие формы заболевания, нередко приводящие к неблагоприятному исходу.

Наряду с перечисленными видами спектра ЛУ микобактерий в международной практике принято различать первичную и приобретенную ЛУ.

Первичная ЛУ определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, который никогда не принимал ПТП или получал такое лечение менее одного месяца. В данном случае подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчивыми штаммами микобактерий. Первичная ЛУ характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей на данной территории, и ее показатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации.

Приобретенная (вторичная) ЛУ определяется как устойчивость микобактерий, выявленных у больного туберкулезом, получавшего лечение ПТП в течение месяца и более. Является косвенным показателем эффективности проводимой химиотерапии.

Уровень устойчивости штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество микрограммов в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий (определяется по числу колоний на плотных средах).

Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата и в такой среде, которые оказывают на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное действие (Голышевская, 2006).

1.5 Клинико-фармакологическая характеристика противотуберкулезных препаратов

Группа противотуберкулёзных препаратов включает ряд природных и полусинтетических соединений, общим свойством которых является активность в отношении микобактерий туберкулёза. Согласно общепринятой классификации, противотуберкулёзные препараты разделяются на препараты I ряда (основные) и II ряда (резервные) (табл. 1).

Таблица 1 — Классификация противотуберкулёзных препаратов (Страчунский, Козлов, 2002).