Особенности структуры субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у долгожителей: По данным цитометрии

Увеличение доли пожилых людей в обществе стало особенно заметно в последней четверти XX века. Это значительно повышает интерес к геронтологии и, прежде всего, к изучению первичных механизмов старения организма и факторов, определяющих продолжительность жизни. В принятой на Второй Всемирной ассамблее ООН по проблемам старения «Программе ООН по исследованиям старения в XXI столетии» (апрель 2002 г., Мадрид) отмечается, что лучшее понимание фундаментальных механизмов старения и факторов долголетия имеет первостепенное значение для реализации полного потенциала здорового старения [20, 30].

Процесс старения охватывает все уровни структурной организации человека — молекулярный, субклеточный, тканевой, органный. Суммарный результат многочисленных частных проявлений старения на уровне целостного организма заключается в нарастающем с возрастом снижении жизнеспособности его, уменьшении эффективности приспособительных, гомеостатических механизмов [40].

Важную роль в защите организма и поддержании его гомеостаза играет иммунная система, старение которой в нормальных условиях начинается раньше, чем в других системах и связано с инволюцией тимуса [35].

Поэтому многими исследователями старость рассматривается как Т-иммунодефицит, сопровождающийся ослаблением реакций иммунитета и часто изменением их характера. В результате развиваются аутоиммунные, онкологические процессы и хроническое течение заболеваний, что составляет основу полиморбизма в старости [25, 36, 78].

Вместе с тем иммунная система имеет значительный запас прочности, который создается в процессе формирования защитных сил организма с момента его рождения [78].

В связи с этим, с научной точки зрения, долгожители представляют интерес для исследователя как своеобразная модель сохранения защитных свойств организма до глубокой старости и его адаптации к существованию в измененных условиях стареющего организма на фоне полиморбидности.

Поэтому тщательное исследование параметров иммунной системы долгожителей является актуальным, поскольку открывает возможности не только для оценки иммунного статуса этого возраста, но и определения потенциальных и адаптационных способностей стареющей иммунной системы, как ключ к увеличению продолжительности жизни человека.

Цель работы.

Выявление количественных изменений в показателях иммунитета и определение набора признаков, позволяющих оценить иммунореактивность организма долгожителей.

Задачи исследования.

1. Определить среднестатистические показатели иммунитета, частоту их отклонений от нормы у долгожителей г. Москвы и выделить для дальнейшего анализа показатели с наибольшими отклонениями от нормы.

2. Выявить и доказать наличие связи между численностью Т-клеток с фенотипом СБЗ+С04'С08″, изменениями уровня сывороточной тимической активности (СТА) и количества СЭЗ+С08+ Т-клеток.

3. Разработать метод двухцветной цитометрии для выявления Т-клеток с фенотипом С03+С04″ С08″ и дополнительного уточнения их фенотипа.

4. Определить прогностическую значимость изменений уровня СТА, количества СЭЗ+С08+ и С03+СБ4'С08' Т-лимфоцитов у долгожителей.

Научная новизна.

Впервые дана характеристика иммунитета у долгожителей, особенностью которого является снижение уровня СТА, количественный дефицит субпопуляции СЭЗ+С08+ Т-лимфоцитов и увеличение численности Т-клеток с фенотипом С03+СВ4″ С08″ у значительного процента долгожителей.

Впервые выявлены варианты связи между этими показателями: реципрокное и обратимое изменение количества С03+С04ТЮ8″ Т-лимфоцитов по отношению к количеству СВЗ+СЭ8+ Т-клеток и уровню СТА и необратимое снижение количества СОЗ+СБ8+ Т-клеток и уровня СТА при отсутствии в периферической крови СОЗ+СБ4″ СВ8″ Т-клеток. Показано, что первый вариант изменений согласуется с сохранением иммунореактивности, второй является предвестником летального исхода.

Впервые при первичном иммунологическом обследовании в двухцветной цитометрии с использованием двух флюорохромов фикоэритрина (ФЭ) и флюоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ), с помощью разработанных нами комбинаций моноклональных антител (МКАТ) С03ФЭ/(С04+СБ8)ФИТЦ и С03ФЭ/(С04+С08+С016)ФИТЦ были выявлены два типа клеток среди С03+С04″ С08″ Т-лимфоцитов, которые различались экспрессией поверхностной молекулы СБ 16 и интенсивностью свечения СЭЗ-рецептора, и показано, что дефицит СОЗ+СБ8+ Т-клеток восполнялся за счет Т-клеток с фенотипом С031спуСВ4″ СВ8″ С016.

Научно — практическая ценность работы.

Разработанные дополнительные комбинации МКАТ.

СБЗ ФЭ/(СБ4+СО 8) ФИТЦ и С03ФЭ/(С04+С08+С016)ФИТЦ позволяют уже на уровне первичного обследования методом двухцветной цитометрии выявить минорные группы С03Ь|СВ4ХЛЖС0161спу (естественные Т-киллеры) и СВ31туСБ4'СВ8Ч1Т)16″ Т-лимфоцитов и по типу количественных изменений субпопуляций СОЗ+СЭ8+ и СО310№СО4″ СО8'СО16″ прогнозировать жизненный потенциал и эффективность лечения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У значительной части долгожителей на фоне полиморбидности и снижения гормональной функции тимуса, определяемой по уровню СТА, наблюдали количественный дефицит СБЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов и появление Т-клеток, лишенных субпопуляционных маркеров (С03+С04*С08″).

2. Появление и исчезновение СОЗ+СБ4″ СВ8″ Т-лимфоцитов связано с изменениями уровня СТА и количества С03+С08+ Т-лимфоцитов. Выявлено два варианта изменений:

— обратимые и реципрокные количественные изменения С03+С04*С08″ Тлимфоцитов по отношению к уровню СТА и количеству С03+С08+ Т-лимфоцитов, что является благоприятным прогностическим тестом;

— необратимое снижение всех трех показателей, что расценивается как маркер риска близкого смертельного исхода.

3. Популяция Т-клеток с фенотипом СВЗ+С04'С08″ является гетерогенной, что показано с помощью разработанного метода двухцветной цитометрии и включает СОЗыСЭ4'СВ8-СВ 1 б1&trade- (естественные киллерные Т-клетки) и С031(ПУСВ4″ СВ8″ С016″ Т-клетки. Именно численность последнего типа клеток изменяется в зависимости от уровня СТА и количества СОЗ+СЭ8+ Т-лимфоцитов. * *.

Благодарим главного врача клиники РНИИ геронтологии МЗ РФ Маргариту Георгиевну Филатову и заведующих отделениями: Наталью Викторовну Журавлеву (терапия), Светлану Ильиничну Муромову (кардиология), Валентину Васильевну Лопатину (гастроэнтерология), Зинаиду Степановну Митину (неврология), заведующую лабораторией возрастной гематологии Регину Николаевну Шишину, заведующую лабораторией иммуномодуляторов Веру Леонидовну Голубеву, заведующую лабораторией лазерных методов лечения Ольгу Матвеевну Карпенко за возможность работы с историями болезней пациентов клиники и использовании в нашем исследовании диагнозов и сотрудничество.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Гипотезы, объясняющие механизмы старения.

Механизмы и последовательность событий, развивающихся при старении, мало изучены и остаются предметом научных исследований. В связи с этим существует множество формулировок, как самого процесса старения, так и гипотез (теорий), пытающихся объяснить его причины и характер происходящих при этом в организме изменений.

Большинство теорий не выдержало проверку временем и представляет чисто исторический интерес.

Суть гипотез, ценных с научной точки зрения изложена и проанализирована в ряде обзоров [1, 2, 36], на основании которых можно сделать следующие обобщения:

• Старение организма есть, безусловно, системный процесс, базирующийся на взаимодействии стареющих с разной скоростью клеточных ансамблей.

• Причиной старения, в конечном счете, признается дисбаланс биологических структур и выполняемых функций.

• Первичная роль в старении отводится изменениям свойств белковых молекул и внутриклеточных структур.

• Структурные дефекты обусловливают функциональные расстройства на метаболическом, клеточном, тканевом, органном уровнях, свойственны всем физиологическим системам организма и служат основой развития множественных патологий (полиморбидность) старческого возраста.

• Процесс старения может быть выражен рядом алгоритмов, отражающих характер и динамику изменений на молекулярно-генетическом, метаболическом, клеточном, гомеостатическом, органном, системном, организменном и видовом уровне с учетом ятрогенных факторов.

Основное разногласие в гипотезах старения касается первичных механизмов, запускающих деструктивные изменения, которые ведут, в итоге, к гибели организма.

Авторы эпигенетических теорий рассматривают старение как стохастический процесс накопления с возрастом «ошибок», инициированных случайными во времени и локализации внутренними (спонтанная мутация) и внешними (ионизирующая радиация, химические мутагены, УФ-излучение) факторами.

Генетические теории рассматривают старение как запрограммированный процесс, который развивается в плановом порядке, подобно другим стадиям онтогенеза, при этом в процесс старения всегда вовлечены носители наследственной информации, заключенные в ДНК. Существуют разногласия относительно существования специальных генов старения или генетических программ [17].

Все теории старения, несмотря на некоторые противоречия, не являются взаимоисключающими, вполне совместимы, дополняют друг друга и используют зачастую одни и те же факты для их подтверждения.

Наиболее приемлемыми и интересными на современном этапе развития геронтологии остаются гипотезы соматических мутаций [2], свободнорадикального окисления, износа структур [12], фонтанная теория [19].

Согласно теории соматических мутаций, старение является результатом постепенного накопления случайных мутаций в геноме соматических клеток, что является также основным фактором, определяющим развитие возрастной патологии [131].

В научной литературе имеются многочисленные доказательства в поддержку этой теории.

Так, при обследовании двух групп людей (в возрасте от 4 до 85 лет) доноров и лиц, подвергшихся облучению в низких дозах за 1−4 года до исследования, установлено более быстрое увеличение с возрастом стабильных повреждений в хромосомах лимфоцитов облученных людей [134].

Весьма важен вывод о частоте и скорости накопления соматических мутаций в различных органах и тканях. На мышах LacZ было установлено, что увеличение частоты соматических мутаций в печени происходит равномерно с рождения до 27-месячного возраста, после чего их число резко увеличивается, тогда, как в головном мозге нарастает частота мутаций только до 4−6 месяцев жизни, а затем не изменяется [61, 62].

Ряд исследователей связывают начальные изменения старения организма с мутационными изменениями физико-химических и биологических свойств макромолекул: ДНК, РНК, белков хроматина, цитоплазматических и ядерных белков, ферментов.

Так, в нормальных тканях человека с возрастом накапливаются клонально распространяющиеся мутации митохондриальной ДНК (мДНК) [109]. Выявлена также существенная тенденция к увеличению частоты мутаций антионкогена р53 в тканях человека по мере старения [98].

Одной из причин накопления повреждений ДНК с возрастом может быть снижение эффективности систем ее репарации [52]. Установлена прямая корреляция между продолжительностью жизни вида и скоростью репарации ДНК, поврежденной ультрафиолетовым светом или ионизирующей радиацией [91]. Полагают, что системы репарации ДНК при старении чаще ошибаются, что приводит к накоплению мутаций [131].

Радиационная поврежденность ДНК стволовых клеток кишечного эпителия мышей разного возраста одинакова, но скорость репарации этих повреждений с возрастом снижается. Способность фибробластов человека к репарации индуцированных у-излучением однонитевых разрывов ДНК снижается с увеличением возраста доноров [119].

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что ряд возрастных изменений в структуре и функции ДНК вовлечен в процесс естественного старения.

Согласно свободнорадикалъной теории старения активные формы кислорода, продуцируемые, главным образом, в митохондриях, вызывают повреждения клеточных мембран, коллагена, ДНК, хроматина, структурных белков, регуляции внутриклеточного уровня кальция и т. д. 86, 120, 121]. В ряде исследований показано, что мишенью свободных радикалов являются липидный слой клеточных мембран [59, 87].

Сбои в работе рецепторов, в частности клеточных оболочек, нарушают эффективность регуляторных механизмов, что приводит к рассогласованию процессов жизнедеятельности.

У крыс линии OXYS с ускоренным старением выявлено усиление окислительного стресса, который сопровождался дисфункцией митохондрий, развитием нейродегенеративных заболеваний и нарушением поведенческих рефлексов [11, 18].

Видовая продолжительность жизни млекопитающих прямо коррелирует с состоянием антиоксидантной системы и устойчивостью клеток к окислительному стрессу [91]. Витамин Е, мелатонин и некоторые синтетические антиоксиданты увеличивают продолжительность жизни дрозофил, мышей и крыс [44]. На модели ишемии мозга установлено, что применение карнозина, обладающего свойствами антиоксиданта, существенно уменьшает смертность и улучшает функцию мозга у крыс [4].

К рассматриваемому направлению относятся также гипотезы, усматривающие первооснову старения в нарастающем с возрастом износе структур в диапазоне от макромолекул до организма в целом, приводящем, в конце концов, к состоянию, не совместимому с жизнью [77, 131]. Но возникновению и накоплению мутационных изменений в ДНК противостоят природные антимутационные механизмы, а вредные последствия образования свободных радикалов снижаются благодаря функционированию антиоксидантных механизмов [9]. В итоге скорость возникновения возрастных изменений организма является следствием преимущественного преобладания разрушительных или защитных процессов и зависит от таких факторов, как генетическая предрасположенность, условия и даже образ жизни.

Второе направление представлено генетическими гипотезами. Генетический контроль, согласно одним взглядам, осуществляется с помощью специальных генов. В настоящее время в соответствии с каталогом генов человека Мак-Кьюсика со старением связывают 133 гена [26].

По мнению H.A. Малыгиной и А. И. Потапенко [14, 22], на продолжительность жизни влияют гены, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями и причинами их возникновения. При анализе полиморфизма генов липопротеинлипазы (ЛПЛ) и аполипопротеина Е (АроЕ), контролирующих липидный обмен, была выявлена связь аллелей Н+ЛПЛ и ЕУ АроЕ с инфарктом миокарда. Напротив, у долгожителей чаще встречались генотипы, имеющие протектиновые аллели Н-ЛПЛ и Е2 АроЕ, в связи с чем была снижена вероятность нарушений липидного обмена, развития атеросклеротических изменений в сосудах и инфаркта миокарда [13,14, 70].

По другим предположениям, старение связано с наличием специальных генетических программ, как это при других стадиях онтогенеза, например эмбриональной.

Некоторые программные гипотезы основаны на допущении, что в организме функционируют биологические часы, в соответствии с которыми происходят возрастные изменения. Роль «часов» приписывают, в частности, вилочковой железе (тимусу), прекращающей полноценное функционирование при переходе организма в зрелый возраст [7].

В пользу запрограммированности старения приводят следующие доказательства. В природе существуют виды, у которых вслед за размножением бурно нарастают изменения, приводящие животных к гибели. Типичный пример — тихоокеанские лососи, погибающие после нереста, что связано с изменением режима секреции половых гормонов. Однако кастрированная горбуша не нерестится и живёт в 2−3 раза дольше. Именно в эти дополнительные годы жизни следует ожидать появления признаков старения и в клетках и в тканях [40].

Другим примером, противоречащим запрограмированности старения, является продолжительность жизни синиц в природе (2 года) и в лабораторных условиях (7−8 лет) [40].

Считают, что генетические программы, в том числе и индивидуального развития, являются результатом эволюции, закрепляемым в генофонде вида вследствие естественного отбора.

По мнению одних авторов, естественный отбор должен благоприятствовать увеличению продолжительности жизни.

По мнению других авторов, основной целью естественного отбора является обеспечение воспроизводства вида, в связи с чем генетические программы ограничивают жизнь репродуктивным периодом [89, 117, 122].

В обоих вариантах приобретение видом в ходе эволюции генетической программы старения, ведущей к неизбежной смерти, представляется маловероятным.

Изложенное выше не исключает зависимости скорости старения и времени наступления старческих изменений от генетических факторов, однако этими факторами, по мнению большинства ученых, не являются специальные гены или программа. Это хорошо видно на примере такого заболевания, как хорея Гентингтона. Для нее типичным признаком служит сильный тремор головы, конечностей (пляска святого Витта). Симптомы этого наследственного заболевания обычно появляются в возрасте 35−39 лет, причём у мужчин позднее, чем у женщин. Различие в сроках появления болезни объясняется особенностями эволюции мужского и женского генотипов. У мужчин, имеющих по сравнению с женщинами большую продолжительность репродуктивного периода, давление отбора против соответствующего признака угасает с возрастом более медленно. Неблагоприятное фенотипическое действие гена, лежащего в основе хореи Гентингтона, в юношеском и зрелом возрасте подавлялось благодаря присутствию в геноме генов-модификаторов [15, 27].

Рассматривается также возможность связи между более быстрым старением и наличием генов системы НЬА [25].

Согласно фонтанной теории [19] в процесс старения эукариотических клеток вовлечен особый механизм модуляции уровня экспрессии генов, который зависит от поступления ионов из перинуклеарного пространства внутрь ядра через каналы ядерной мембраны. Механизм действия таких ионных каналов, по аналогии с работой гейзера, можно назвать гейзерным или фонтанным. К числу ионных каналов можно отнести кальцевые и цинковые каналы. Каждый из них открывается на очень короткий срок в результате комплементарного взаимодействия так называемой фонтанной РНК (фРНК) с участком ДНК, находящимся вблизи соответствующего гена.

Предполагают, что кратковременная активация ионного фонтана (в случае формирования его вблизи определенного гена) изменяет локальную продуктивность соответствующего гена.

Когда теломеры делаются в стареющих клетках слишком короткими, фРНК — зависимые ионные каналы, вероятно, на стадии перехода в Б-фазу клеточного цикла, становятся недоступными для субтеломерных генов.

В связи с этим автор рассматривает процесс старения как «болезнь количественных признаков».

По-видимому, адаптационные механизмы, сформировавшиеся в процессе эволюции, имеют большой запас прочности, обеспечивая существование вида в пострепродуктивном периоде.

Большую роль в сохранении жизнеспособности вида играют специальные структуры, поддерживающие гомеостаз. Одной из них является иммунная система организма.

В связи с этим особый интерес представляет иммунологическая теория старения.

Основная функция иммунной системы, сформировавшаяся в процессе эволюции и естественного отбора, — защита организма от внешней (инфекции) и внутренней (измененные клетки собственного организма) биологической агрессии [35]. Эта защита осуществляется с помощью разнообразных механизмов, лежащих в основе естественного и приобретенного (адаптивного) иммунитета. Многочисленные исследования показали, что наступление старости генетически запрограммировано для каждого индивидуума и является отражением спада иммунной функции, в первую очередь, в связи с инволюцией тимуса. Поэтому наиболее значимые возрастные сдвиги наблюдаются в адаптивном иммунитете и связаны с нарушением функционирования Т-клеток [10].

Глава 2. Структурно-функциональные изменения в системе адаптивного.

ВЫВОДЫ.

1. Определены среднестатистические параметры количественных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов, концентрации I иммуноглобулинов классов в, А и М и уровня СТА у долгожителей г. Москвы, и выявлены особенности структуры субпопуляционного состава Т-лимфоцитов периферической крови, характеризующиеся количественным дефицитом субпопуляции СЭЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов и появлением Т-лимфоцитов с фенотипом С03+СО4″ СО8″ на фоне сниженного уровня СТА.

2. Установлены типы взаимосвязанных изменений величин показателей уровня СТА, СОЗ+СБ8+ и С03+С04″ СБ8″ Т-лимфоцитов:

— обратимые и реципрокные изменения количества СЭЗ+С04″ С08' Т-лимфоцитов по отношению к уровню СТА и численности субпопуляции СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов;

— необратимое снижение всех трех показателей.

3. Обратимые и реципрокные изменения свидетельствовали о сохранении иммунореактивности у долгожителей, что подтверждено положительной динамикой иммунологических показателей после курса лазеротерапии. Необратимое снижение всех трех показателей являлось маркером летального исхода.

4. Уточнен фенотип С03+С04″ С08″ Т-лимфоцитов, которые в отличие от естественных киллерных Т-лимфоцитов (С03Ь,'С04″ С08'С01 б'&trade-) характеризовались слабой экспрессией СЭЗ-рецептора, отсутствием молекулы СБ 16 и изменением их численности реципрокно количеству СБЗ+С08+ Т-клеток.

5. Предложена дополнительная комбинация МКАТ СБЗФЭ/ (С04+С08+С016)ФИТЦ, с помощью которой уже при первичном обследовании в двухцветной цитометрии могут быть выявлены Т-клетки с фенотипом С031туС04'С08″ С016 6. Характер изменений в структуре субпопуляций Т-лимфоцитов СОЗ+СЭ8+ и С031ота>4″ С08'С016″ может быть использован в качестве прогностического теста для оценки состояния иммунореактивности и жизненного потенциала долгожителей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В результате проведенных исследований показано, что у долгожителей на фоне полиморбидности средние арифметические значения для большинства иммунологических показателей (лимфоциты, общее количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов, ЕКК, В-лимфоцитов, концентрация IgM, G и А) статистически не отличались от норм, принятых для практически здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет.

Вместе с тем прослеживалась тенденция сдвига средних значений для Т-хелперов и В-лимфоцитов к нижнему пределу нормы, для ЕКК, IgA и IgMк верхней границе нормы. В то же время статистически достоверно были снижены средние значения относительного и абсолютного количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (20±3% и 310±60 кл/мкл, соответственно) (глава 4, табл.4).

Нами впервые была выявлена особенность структуры субпопуляционного состава лимфоцитов у долгожителей, характеризующаяся статистически достоверным уменьшением количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и повышением количества CD3+CD4″ CD8″ Т-лимфоцитов на фоне снижения уровня СТА. Сдвиг этих средних величин за пределы нормы был вызван увеличением процента долгожителей с количественным дефицитом CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, низким уровнем СТА и избыточным количеством CD3+ Т-лимфоцитов, лишенных субпопуляционных маркеров CD4 и CD8 (CD3+CD4'CD8″) (глава 4, табл.5).

Данные литературы по поводу изменения численности субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов весьма противоречивы. Возможно, это связано с определением общего количества CDS-положительных лимфоцитов без учета существования субпопуляции CD16+CD8+ киллерных клеток, которые действительно, по нашим неопубликованным данным, увеличиваются у старых людей и у детей, проживающих в районах, загрязненных радионуклидами. Возможно также, что увеличение CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в старческом возрасте относится к клеткам с отсутствием корецептора CD28, которые выполняют супрессорную функцию в иммунитете.

В обзоре литературы по старению иммунной системы, однако, отмечено, что количественные изменения основных субпопуляций Т-лимфоцитов наступают лишь в глубокой старости [104, 115], что соответствует нашим данным [26].

Известно, что гормоны тимуса регулируют функцию периферических CD3+CD8+ Т-лимфоцитов [35]. Поэтому естественно было ожидать снижение количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов при гормональной дисфункции тимуса у долгожителей. Нами подтверждено, что дефицит CD3+CD8+ Т-лимфоцитов наблюдался, как правило, у долгожителей с низкими показателями СТА (глава 4, табл.5).

Также в наших исследованиях впервые выявлены варианты связи между тремя упомянутыми выше показателями: реципрокное и обратимое изменение количества CD3+CD4″ CD8″ Т-лимфоцитов по отношению к количеству CD3+CD8+ Т-клеток и уровню СТА и необратимое снижение количества CD3+CD8+ Т-клеток и уровня СТА при отсутствии или уменьшении в периферической крови CD3+CD4″ CD8″ Т-клеток. Показано, что первый вариант изменений согласуется с сохранением иммунореактивности, второй является предвестником летального исхода (глава 5, рис. 2, 3, 4, табл.7).

По литературным данным, известно, что лица старческого возраста со сниженной активностью клеток-супрессоров имеют меньшую продолжительность жизни по сравнению с нормальным возрастным контролем [5]. По нашим данным, на фоне количественного дефицита CD3+CD8+ Т-лимфоцитов прослеживалась тенденция увеличения срока жизни при наличии в организме CD3+CD4″ CD8″ Т-лимфоцитов. Можно предположить, что эти клетки являются резервом иммунной системы для восполнения количественного недостатка и, возможно, цитотоксической функции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов.

Для доказательства существования связи между естественным процессом снижения гормональной функции тимуса, количественным дефицитом CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и появлением CD3+CD4″ CD8″ Т-лимфоцитов у долгожителей мы проанализировали эти же показатели у лиц в ситуациях, когда под действием внешних факторов один из параметров был искусственно снижен.

При обследовании детей, проживающих в течение 6 лет на территориях, загрязненных радионуклидами после аварии на ЧАЭС, нами выявлено, что на фоне сниженного уровня СТА у детей, родившихся как до, так и после аварии, отмечалась тенденция к снижению количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Нами впервые было показано, что у детей на фоне дефицита СТА и CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови появлялись Т-клетки с фенотипом CD3+CD4″ CD8″ в количествах, превышающих норму (см. глава 6, табл.9).

Исследованиями A.A. Ярилина [35, 37] показано, что последствиями радиации является снижение уровня секреции гормонов тимуса. Воздействие радиации на клетки эпителия тимуса осуществляется опосредованно через выработку аутоантител к ним и между пострадиационным синдромом, различными иммунодефицитными и аутоиммунными состояниями и старением организма есть много общего. Так, при обследовании населения, проживающего на загрязненных территориях, наблюдали формирование вторичных иммунодефицитов и резкое понижение уровня регуляторного сывороточного тимусного фактора [36].

Таким образом, мы считаем правомочным наше заключение, что причиной снижения численности CD3+CD8+ Т-лимфоцитов у долгожителей является нарушение секреции гормонов тимуса.

По-видимому, появление в периферической крови CD3+CD4'CD8″ Т-клеток может быть связано как со снижением уровня СТА, так и численности CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Мы предположили, что искусственное подавление числа CD3+CD8+ Т-клеток при лечении больных аутоиммунным заболеванием апластическая анемия может служить моделью для доказательства вероятности появления на этом фоне Т-клеток с фенотипом CD3+CD4″ CD8.

При лечении апластической анемии в мировой практике используется в качестве иммунодепрессанта препарат антилимфоцитарной сыворотки [фирмы-производители: Pharmacia & Upjohn Company, СШАFresenius, Германия], в частности, в клинике ФГУ РНИИ геронтологии Росздрава успешно применяют отечественный антитимоцитарный глобулин козий (АТГ-Кз). Этот препарат, как показали наши исследования, избирательно снижал количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов.

По-видимому, это связано с тем, что в антигенном материале (тимус, удаленный у детей при операциях на сердце) преобладают CD3'CD4+CD8+ тимоциты (80 — 90%), в связи с чем действие АТГ-Кз направлено преимущественно на подавление рецепторов CD4 и CD8.

На циркулирующих периферических хелперных Т-лимфоцитах рецептор CD4, по данным цитометрии, имеет более низкую плотность, чем CD8. Вследствие этого, основными клетками-мишенями АТГ-Кз были Т-лимфоциты, несущие на поверхности рецептор CD8. Интересно, что количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов активнее снижалось после курса АТГ-Кз на фоне низких значений СТА.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что численность субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови находится под контролем гормонов тимуса, а снижение количества CD3+CD8+ Т-клеток на низком гормональном фоне, в свою очередь, сопровождается появлением в периферической крови Т-клеток с фенотипом CD3+CD4″ CD8.

Эти данные могут быть, по нашему мнению, экстраполированы и на изменения субпопуляционного состава у долгожителей.

Особый интерес, с нашей точки зрения представляет факт выявления CD3+CD4″ CD8″ Т-клеток у долгожителей.

При дополнительном фенотипировании этих Т-лимфоцитов с помощью разработанного нами метода было выявлено два типа клеток, различающихся по экспрессии молекулы CD 16 (раздел 6.2.). При этом у подавляющего большинства долгожителей (13 из 14 человек) наблюдали появление в циркулирующей крови Т-лимфоцитов, которые не экспрессировали маркеров CD4, CD8 и отличались от CD3+CD16+ естественных киллерных Т-клеток (ЕКТ) слабым свечением CD3 и отсутствием CD 16 маркеров. Эти клетки мы обозначили CD3lovvCD4″ CD8″ CD16″. Только у одного человека из всех обследованных были выявлены CD3hiCD4″ CD8″ CD16l0W ЕКТ при отсутствии Т-лимфоцитов с фенотипом CD3lowCD4″ CD8″ CD 16″ (глава 7, табл. 10).

Нами уточнено, что у долгожителей увеличивалась частота появления CD3IowCD4'CD8″ CD 16' Т-лимфоцитов, а не ЕКТ. Изменения числа CD3lowCD4″ CD8″ CD16' Т-лимфоцитов было реципрокно количеству CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и ассоциировалось с наличием хронических воспалительных процессов.

Анализ результатов иммуномониторинга 5 долгожителей, в комплексном лечении которых было использовано низкоинтенсивное лазерное излучение, показал, что у лиц с малым количеством CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и наличием CD3|0WCD4″ CD8″ CD16″ Т-лимфоцитов положительный результат лечения совпадал с восстановлением пула CD3+CD8+ до нормальных величин и, соответственно, исчезновением CD3 lowCD4'CD8″ CD 16* Т-лимфоцитов.

Из научных публикаций известно, что группа клеток с фенотипом CD3+CD4″ CD8' является гетерогенной и включает а (3- и у5 Т-клетки [8, 23].

Рецептор CD16 чаще экспрессируется на ар CD3+CD4'CD8″ Т-клетках, в связи с чем можно предположить, что CD3lowCD4″ CD8'CD16' Т-клетки относятся к у5 Т-клеткам [128].

Имеются публикации, согласно которым у8 Т-клетки устойчивы к апоптозу [84], локализуются в эпителиальных тканях желудочно-кишечного тракта, матки, кожи [31, 80], то есть в тех компартаментах организма, которые, как правило, являются очагами воспалительных и деструктивных процессов в старости.

Учитывая все выше сказанное, можно предположить, что выявленные нами CD3lowCD4'CD8″ CD16' Т-лимфоциты, с большой вероятностью, относятся к у8 Т-клеткам.

Согласно гипотезе, ранее высказанной С. Hay day [88] уб Т-клетки прямо или косвенно могут выполнять функцию иммунозащиты в тех случаях, когда отсутствуют зрелые арТ-клетки. Тогда длительный срок жизни человека обеспечивается сохранностью численности и активности этой популяции клеток.

Как показали наши исследования, отсутствие CD3lowCD4″ CD8″ CD16″ Т-лимфоцитов на фоне недостатка CD3+CD8+ Т-клеток наблюдалось перед летальным исходом, как у долгожителей, так и у больных с тяжелой формой апластической анемии.

В этом аспекте наши данные совпадают с информацией о том, что мыши, компрометированные по у8 Т-клеткам, несмотря на наличие зрелых аР Т-клеток погибали от инфекции [115].

По-видимому, CD3lowCD4″ CD8'CD16″ Т-клетки расширяют адаптационные возможности иммунной системы долгожителей.

В связи с обнаруженной способностью у8 Т-клеток регулировать специфический иммунный ответ с помощью секретируемых цитокинов, изменяя соотношения Thl/Th2 [138] возможен и другой механизм контроля реципрокных изменений количества CD3+CD8+ и CD3lowCD4'CD8″ CD16″ клеток по типу обратной связи. Однако ясность в этом вопросе может внести дополнительная характеристика этих клеток и, в первую очередь, определение типа Т-клеточного рецептора.

В своей работе мы лишь отметили факт преобладания у долгожителей С031(ШС04'СЭ8'С016″ Т-клеток.

Такие же клетки мы обнаружили при аналогичных изменениях в структуре субпопуляций Т-клеток у лиц молодого и среднего возраста с диагнозом апластическая анемия после лечения АТГ-Кз и у детей, проживающих на загрязненной радионуклидами территории. В связи с этим остается открытым и ждет своего решения в будущем вопрос, в какой степени появление в периферической кровиклеток связано с самим процессом физиологического старения, и какую роль играют при этом те или иные заболевания.

Характер изменений в структуре субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у долгожителей может быть использован в качестве критерия оценки состояния иммунореактивности, жизненного потенциала и вероятности наличия воспалительных процессов. Важно, что информацию можно получить при рутинном первичном иммунологическом обследовании в специализированной лаборатории.