Клонирование генов, кодирующих синтез лизоцима Staphylococcus aureus и лизостафина Staphylococcus simulans, их экспрессия в гетерологичных хозяевах

Стафилококки представляют собой большую гетерогенную группу грамположительных микроорганизмов. Они широко распространены в окружающей среде, и некоторые виды являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В настоящее время все описанные виды стафилококков делятся на две основные группы — коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Самым же известным среди всех коагулазоположительных видов стафилококков является золотистый стафилококкStaphylococcus aureus, который на протяжении всего XX века был одним из наиболее значимых оппортунистических патогенов в медицинской практике. Основной экологической нишей S. aureus являются апокриновые железы, расположенные в передних отделах носовых ходов человека, а также в подмышечных ямках и паховых складках, что связано с высокой степенью сродства данного вида микроорганизмов к расположенным там эпителиоцитам. Условием для освоения S. aureus данной экологической ниши является способность бактерий противостоять действующим в ней механизмам противоинфекционной резистентности организма хозяина (Дерябин Д.Г., 2000). S. aureus способен вызывать широкий спектр заболеваний — от «малых» кожных инфекций до тяжелых септических состояний с возможным летальным исходом (Grosserode, Wenzel, 1991, Бухарин О. В. и др., 2001).

Золотистый стафилококк характеризуется многообразием факторов патогенности, к которым относятся экзотоксины, факторы адгезии, инвазии и иммунорезистентности. Среди многочисленных экстр ацеллюлярных продуктов стафилококков наибольший интерес представляет бактериолитический лизоцимподобный фермент /ЛПФ/, относящийся к аутолитическим ферментам-гидролазам, и стафилококковый бактериоцин /лизостафин/. Эти два фермента отличаются по механизму действия, спектру и структуре. Если лизоцим стафилококков, представляющий р /1—4/ ацетилглюкозаминидазу, разрывает р /1—4/ глюкозидные связи в полисахаридной составляющей пептидогликана, входящего в состав клеточной стенки, то лизостафин, представляющий глицилглициновый комплекс, воздействует на белки клеточной стенки (Бухарин О.В., Васильев Н. В., Усвяцев В. Я., 1985).

Лизостафин могут синтезировать только стафилококки, а лизоцим является широко распространенным в природе белком, который способны синтезировать не только микроорганизмы, к которым относятся стафилококки, но и высшие организмы. Из всех известных лизоцимов в настоящее время в Латвии налажено промышленное производство только куриного лизоцима из белка куриных яиц. Основное отличие яичного лизоцима от лизоцима бактериального происхождения заключается в том, что несмотря на общий субстрат действия этих ферментовпептидогликан (муреин) клеточной стенки бактерии — они расщепляют его на различные конечные продукты.

У бактериального лизоцима, по сравнению с яичным, выше степень и шире спектр литического действия. Куриный лизоцим не действует на грамположительные бактерии (в частности стафилококки) в отличие от лизоцима S. aureus, который разрушает клеточные стенки коагулазоотрицательных видов стафилококков (Акатов А.К., Зуева B.C., 1983). Кроме того, микробные лизоцимы в отличие от яичного взаимодействуют с другими группами гидролитических ферментов, что приводит к большему суммарному литическому эффекту (Афанасьева Т.И., Леоненко В. А., 1975). В настоящее время промышленное производство препаратов, содержащих стафилоккокковый лизоцим, лизирующий клеточные стенки грамотрицательных видов стафилококков, не разработано, хотя не вызывает сомнения, что во многих случаях практическое применение микробных ферментов гораздо экономичнее, чем применение яичного лизоцима.

Известно, что резкое снижение уровня эндогенного лизоцима свидетельствует о серьезных дефектах систем регуляции гомеостаза, неблагоприятно отражается на морфогенезе и функционировании иммунной системы организма.

Многие условно-патогенные бактерии могут снижать концентрацию лизоцима за счет продукции ангилизоцимного фактора (Бондаренко В.М., Романова Ю. М., Яблочков, А .Я., 1988). Поэтому восполнение дефицита лизоцима является патогенетически вполне оправданным в лечении и профилактике многих заболеваний, в том числе дисбактериозов, тесно взаимосвязанных со вторичными иммунодефицитными состояниями, ослабляющими колонизационную резистентность открытых полостей организма хозяина (Бондаренко В.М., Грачева Н. М., Мацулевич Г. В., 2003). Разработка нового препарата-пробиотика, в основе которого могут быть молочнокислые бактерии, продуцирующие лизоцим, весьма перспективна и нова.

Что касается другого фермента стафилококкового происхождения — лизостафина, который разрушает как грамотрицательные виды стафилококков, так и грамположительные, то он необходим в генетических исследованиях стафилококков для получения протопластов этих микроорганизмов. Но в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих этот фермент, и работа в данном направлении также является актуальной и перспективной. Особенно эффективным и экономичным было бы создание препарата, содержащего оба вышеуказанных фермента стафилококкового происхождения (лизоцим и лизостафин).

Одним из подходов к решению этой проблемы является i J клонирование гена, детерминирующего синтез стафилококкового лизоцима, и передача его представителям нормальной микрофлоры человека, например лактобациллам, и создание таким образом новых j видов пробиотиков. В настоящее время существуют единичные работы по клонированию гена стафилококкового лизоцима и лизостафина в клетках л.

Е. coli, характеризующихся слабым уровнем экспрессии этих генов. Практически отсутствуют данные о клонировании и экспрессии генов стафилококкового лизоцима и лизостафина в других видах бактерий (сенной палочке, лактобациллах), поэтому данное направление в генетике стафилококков является актуальным и перспективным.

Цель работы — клонирование гена, кодирующего синтез лизоцима Staphylococcus aureus, и гена, кодирующего синтез лизостафина Staphylococcus simulans, и изучение экспрессии клонированных генов в гетерологичных хозяевах.

Задачи исследования.

1) изучение коллекции штаммов Staphylococcus aureus с целью выявления штаммов с наибольшей лизоцимной и лизостафиновой активностями;

2) создание геномной библиотеки (банка генов) Staphylococcus aureus и Staphylococcus simulans при помощи вектора pLFi4 в клетках Bacillus subtilis AJ73;

3) отбор рекомбинантных клонов с лизоцимной и лизостафиновой активностями на специально разработанных селективных средах, выделение рекомбинантных плазмид, содержащих вставки стафикокковых генов, кодирующих синтез лизоцима и лизостафина соответственно;

4) перенос гена лизоцима S. aureus, клонированного в клетках В. subtilis в составе вектора pLFj^ в клетки Lactobacillus fermentum методом t t электропорации и создание потенциального штамма-продуцента стафилококкового лизоцима;

5) разработка тест-системы на основе ПЦР для идентификации лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов стафилококков.

Научная новизна.

Впервые в качестве реципиента для клонирования генов стафилококкового лизоцима (ЛПФ) и лизостафина был использован протеазодефицитный мутант В. subtilis AJ73.

Показано, что гены, кодирующие синтез лизоцима и лизостафина стафилококков, стабильно наследуются в клетках В. subtilis AJ73 в составе вектора pLFi4 и экспрессируются. Уровень продукции лизоцима в клетках бацилл в 2,5 раза превышал такавой в исходном штамме S. aureus 118, тагда как уровень продукции лизостафина был сравним с уровнем продукции фермента у исходного родительского штамма S. simulans.

Показана экспрессия гена, кодирующего синтез лизоцима стафилококков в клетках штамма Lactobacillus plantarum 8R-A3, не обладающего собственной лизоцимной активностью. Продукция лизоцима в клетках других гибридных штаммов Lactobacillus fermentum 90Т-С4 и L. fermentum 81Т-В5, характеризующихся различным уровнем собственной лизоцимной активности, превышала исходный уровень продукции фермента.

Впервые были получены гибридные штаммы лактобацилл, несущие ген, кодирующий синтез стафилококкового лизоцима, которые наряду с повышенным уровнем лизоцимообразования, обладали повышенной антагонистической активностью по сравнению с родительскими штаммами, особенно в отношении клеток золотистого стафилококка и.

Гибридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изолятов S. aureus.

Практическая значимость работы.

В настоящее время активно разрабатываются новые виды пробиотиков, включающие в себя генноинженерные штаммы сенной палочки, дрожжей, лактобацилл, кишечной палочки. Сконструированные нами штаммы лактобацилл и сенной палочки, обладающие повышенным уровнем лизоцимообразования и антагонистической активностью против условнопатогенных бактерий, могут быть рекомендованы в качестве потенциальных штаммов для создания высокоэффективных пробиотиков.

Сконструированы штаммы B. subtilis, стабильно наследующие ген, кодирующий синтез лизоцима и лизостафина стафилококков и характеризующиеся повышенным уровнем его продукции, которые могут быть использованы для промышленного получения фермента.

Разработана тест-система на основе ПНР для идентификации и выявления лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов, выделенных от больных, а также из окружающей среды (смывы с медицинских инструментов, мебели, белья, медицинской одежды в поликлиниках, больницах и роддомах). По сравнению с более трудоемкими, требующими больших затрат времени и средств традиционными чашечными методами определения лизоцимной активности, разработанная ПЦР-тест-система значительно ускоряет и упрощает процедуру отбора лизоцимактивных штаммов стафилококков. и.

ВЫВОДЫ.

1. У 150 клинических штаммов S. aureus изучена лизоцимная активность с помощью метода отсроченного антагонизма и лизиса убитых ацетоном микробных клеток Micrococcus luteus var. lysodeikticus. Лизоцимная активность обнаружена у 42 (28%) изолятов, большинство из которых выделено от больных с инфекцией мочевыводящих путей.

2. Получены геномные банки S. aureus штамма 118 и S. simulans в реципиентном штамме В. subtilis AJ73.

3. Тестирование лизоцими лизостафинактивности полученных рекомбинантных клонов В. subtilis в чашечных функциональных тестах с индикаторными штаммами позволило выявить три клона с приобретенной лизоцимактивностью и один клон с приобретенной лизостафинактивностью.

4. Размер вставок ДНК S. aureus и S. simulans в составе клонирующего вектора в выявленных клонах соизмерим с размером генов, кодирующих лизоцим и лизостафин, соответственно.

5. Осуществлена передача гибридной плазмиды, несущей ген синтеза лизоцима в реципиентные штаммы Lactobacillus fermentum и показана экспрессия этого гена в лактобациллах.

6. Диаметр зон угнетения роста тест-штаммов (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis) клетками гибридного штамма Lactobacillus fermentum, несущего плазмиду с геном синтеза лизоцима, превышает диаметр аналогичных зон, образуемых клетками исходного штамма Lactobacillus fermentum в 2,0 — 2,5 раза.

7. Разработана тест-система на основе ПЦР, позволяющая выявлять фрагменты гена Lyt, А в штаммах S. aureus.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Большое значение в настоящее время придается созданию новых видов антибиотиков, замене устаревших и утративших свой лечебный эффект химиотерапевтических препаратов новыми, более эффективными. Исследователей привлекает поиск недорогих источников получения лизоцима, отбор штаммов-продуцентов, регуляция его синтеза и основные характеристики препаратов микробных лизоцимов. Особенно большой интерес вызывает бактериальный лизоцим и генетические механизмы его биосинтеза, регуляция этих процессов в бактериальной клетке. В настоящее время необходим поиск штаммов-продуцентов микробных лизоцимов и лизостафинов, создание на их основе с помощью методов генной инженерии промышленных суперпродуцентов с максимальным уровнем образования этих ферментов и их внедрение в биотехнологию.

Первым этапом исследования был отбор естественного штамма-продуцента лизоцима. Нами было исследовано на лизоцимную активность 150 штаммов S. aureus, являющихся клиническими изолятами, которые были выделены от больных с различной локализацией инфекционного процесса в детской городской поликлинике № 121 г. Москвы и клинической больнице № 12 г. Казани. Среди этих бактерий лизоцимная активность была обнаружена у 42 штаммов, которые, в основном, были выделены от больных с уроинфекцией, причем наибольшей лизоцимной активностью из них обладали 6 штаммов, среди которых самым активным оказался штамм S. aureus 118. Последний и был выбран нами для последующего клонирования гена, кодирующего продукцию лизоцима.

Вторым этапом исследования был выбор векторной системы и соответствующего реципиента для клонирования. В качестве реципиента для будущего клонирования был выбран протеазодефицитный штамм В. subtilis AJ73. Важной особенностью В. subtilis AJ73 является способность выделять большое количество синтезируемых ею белков в культуральную жидкость. В. subtilis широко распространена в окружающей среде и не является представителем нормальной микрофлоры человека, поэтому не может быть использована для создания новых видов пробиотиков. Разнообразие метаболических процессов в В. subtilis и отсутствие патогенности послужили причиной того, что представители этого вида стали широко использоваться в различных отраслях промышленности для получения ферментов, антибиотиков, инсектицидов и пищевых добавок.

В. subtilis уже на протяжении более 30 лет успешно используется в экспериментах по трансформации, и в этом направлении накоплен большой опыт (Spizizen, 1983). В настоящее время В. subtilis является наиболее изученной грамположительной бактерией как в генетическом, так и в физиологическом аспекте. С учетом вышеуказанных свойств, использование промышленного штамма В. subtilis наиболее перспективно для клонирования генов лизоцима и лизостафина золотистого стафилококка. По данным литературы отмечались случаи выделения сенной палочки с лизоцимной активностью (Okada, Satomura, 1968). Нами также было осуществлено тестирование штамма В. subtilis AJ73, выбранного в качестве реципиента для клонирования, на лизоцимную активность и показано, что он не обладает таковой, что соответствует данным литературы (Jomantas, 1989).

Основным этапом исследования было клонирование гена лизоцима S. aureus 118 и лизостафина S. simulans RN3239, которое было осуществлено при помощи бациллярного вектора pLFi4 в клетках В. subtilis AJ73. Оказалось, что в клетках сенной палочки продукция лизоцима превысила продукцию у исходного штамма S. aureus 118 почти в 2,5 раза. Диаметр зоны лизиса индикаторного штамма М. lysodeikticus клетками рекомбинантного клона В. subtilis AJ73 был намного выше, чем клетками s I исходного штамма S. aureus 118. Однако продукция чужеродного белка в.

В. subtilis AJ73 наблюдалась при температуре 30 °C и рН 5,5 на L-arape, тогда как исходные штаммы S. aureus 118 и S. simulans RN3239 продуцировали лизоцим при рН 7,5 и температуре 37 °C.

Таким образом, нам удалось получить определенный уровень продукции лизоцима S. aureus 118 и лизостафина S. simulans RN3239 в клетках В. subtilis AJ73. Из трех лизоцимактивных и одного лизостафинактивного клона В. subtilis нами были выделены рекомбинантные плазмиды, которые были обозначены соответственно pLFi4Lyz+i, pLF14Lyz+2, pLFi4Lyz+3 и pLFi4Lzf+1. С целью определения размеров вставок в этих рекомбинантных плазмидах была осуществлена ПЦР с соответствующими праймерами, фланкирующими полилинкер в векторной плазмиде pLFi4, в которой производилось клонирование.

Анализ продуктов ПЦР из ДНК выделенных клонов показал, что в плазмидах pLFi4L^+i, pLFi4Lyz+2, pLFi4Lyz+3 и pLF14Lzf+i имеются вставки чужеродной стафилококковой ДНК размером 1,2 т.п.н., 1,5 т.п.н., 2,5 т.п.н., 4,5 т.п.н, соответственно. Фенотипические характеристики полученных лизоцимактивных штаммов и размеры вставок в полученных гибридных плазмидах позволяют сделать предположения о том, что в работе удалось клонировать уже описанные в литературе гены lytA и lss. Об этом свидетельствуют и данные о выявлении в штаммах S. aureus 118 фрагмента гена lytA с помощью разработанной нами ПЦР-тест-системы. Однако для доказательства клонирования нами генов lytA и lss следует осуществить секвенирование клонированных фрагментов гибридных плазмид и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями указанных генов. Кстати, разработанная нами ПЦР тест-система для выявления гена lytA S. aureus может быть рекомендована для использования в практике, так как результаты выявления этого гена совпали с данными микробиологического выявления лизоцимактивности.

Следующим этапом наших исследований была передача плазмиды pLFi4Lyz+3, несущей самую большую вставку стафилококковой ДНК и обладающей высокой стабильностью в клетках В. subtilus представителям нормальной микрофлоры человека (лактобациллам). Передача гибридной плазмиды pLFi4Lyz+3 была осуществлена с помощью метода электропорации в клетки трех потенциально-производственных штаммов L. fermentum 90Т-С4, L. fermentum 81Т-В5 и L. plantarum 8R-A3. Все эти штаммы обладали различной степенью собственной лизоцимной активности. L. plantarum 8R-A3 не обладал этим признаком, а у L. fermentum 90Т-С4 и L. fermentum 81Т-В5 она была почти на таком же уровне как у лизоцим активного штамма S. aureus 118. Лизоцимной активностью обладали и фильтраты указанных культур.

После электропорации соответствующей гибридной плазмидой pLFi4Lyz+3, pLFi4Lzf+i были получены рекомбинантные штаммы лактобацилл, причем наследование лактобациллами гибридных плазмид было подтверждено положительными тестами в ПЦР. При исследовании лизоцимной активности фильтратов генно-инженерных штаммов L. fermentum, полученных нами после электропорации, было определено, что зоны лизиса индикаторного штамма М. lysodeikticus 2669 и зоны угнетения стафилококкового роста были намного больше, чем у исходных культур лактобацилл. Сконструированные штаммы лактобактерий подавляли рост практически всех клинических изолятов золотистого стафилококка, а лизоцимная активность их превышала исходные штаммы в 2,5 раза (как у В. subtilis AJ73).

Важным является также то, что рекомбинантные штаммы, полученные в данной работе обладали повышенным уровнем лизоцимообразования, продуцировали лизоцим при условиях, которые являются оптимальными условиями роста лактобацил, т. е. условиями, которые существуют в кишечнике человека (t=37°C, рН=6,6−7). Именно это позволяет применять их как пробиотики. Полученные штаммы обладали также большей антагонистической активностью в отношении стафилококков по сравнению с исходными штаммами.

Известно, что под влиянием лактобактерий усиливается активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы. Особенно важно сейчас не только отобрать из природной среды штаммы-продуценты микробных лизоцимов, но также создать на их основе с помощью методов генной инженерии промышленные суперпродуценты с максимальным уровнем продукции этих ферментов, а на их основе создать новые препараты-пробиотики.

В настоящее время интенсивно разрабатываются новые виды препаратов-пробиотиков, включающие в свой состав те или иные штаммы L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, L. casei и другие. Разные виды лактобактерий, в частности L. acidophilus, стимулировали противоинфекционный иммунитет, а также стимулировали иммунные реакции при остром ретровирусном гастроэнтерите у детей (Ритова В.В., Мурашева Н. С., 1985). Следовательно лактобактерии, являющиеся неотъемлемой частью микрофлоры пищеварительного тракта в норме, стимулируют как системный так и местный иммунитет, препятствуя распространению патогенных штаммов в кишечнике. В настоящее время является перспективным создание новых пробиотиков, содержащих живые культуры лактобацилл.

Одной из задач работы и было создание такого препарата, который бы выгодно сочетал в себе лечебные свойства стафилококкового лизоцима и лактобактерий. Сконструированные нами генно-инженерные штаммы лактобактерий выгодно сочетают в себе антимикробную ' и иммунностимулирующую активность. Использование полученных рекомбинантных штаммов L. fermentum, обладающих повышенной антагонистической активностью в отношении стафилококков, для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов, вызываемых стафилококками, является целесообразным и противопоказаний не имеет. I.