Функциональный анализ структурных элементов промотора гена udp Escherichia coli

Актуальность темы

Изучение транскрипции прокариотических генов является важным направлением развития молекулярной биологии. Несмотря на то, что этот процесс достаточно хорошо изучен, особенно на модели Е. coli, интерес к исследованиям в этой области не ослабевает, т.к. именно на этапе транскрипции осуществляется наиболее эффективная регуляция экспрессии генов. В результате становится возможным произвольное изменение уровня активности промоторов и создание штаммов-продуцентов различных биологически активных веществ. Кроме того, возможность направленного изменения активности клеточных белков на уровне экспрессии их генов создает предпосылки для разработки узкоспециализированных химиотерапевтических агентов, например, для лечения онкозаболеваний. Так известно, что в раковых клетках резко возрастает количество белка группы фосфоролиза нуклеозидов — уридинфосфорилазы (Vita А., 1986, Bose R., 1974), продукта гена udp (Walton L., 1989), что часто приводит к метастазированию опухоли (Liu М., 1998). В связи с этим проводились работы по клонированию соответствующих генов и изучению свойств уридинфосфорилаз из различных прои эукариотических организмов (Kouni М.Н., 1988, Takehara М., 1995, Watanabe S.-I., 1995, Watanabe S.-I., Uchida T. 1995, Avraham Y., 1990, Sounders B.P., 1969). Изучение регуляции транскрипции этого гена позволит в дальнейшем создать агенты, способные целенаправленно регулировать концентрацию уридинфосфорилазы в клетке.

Транскрипция любого гена является многостадийным и многофакторным процессом белок-белкового и белок-нуклеинового взаимодействия. Изучению этого процесса на модели гена udp Е. coli посвящены многие работы (Mironov А, 1979, Brikun I., 1996), в которых рассмотрены основные этапы транскрипции и определены основные регулирующие белковые факторы. Однако имеющиеся данные не позволяют пока составить полного представления о процессах, происходящих на промоторе udpP. Например, оставалась неясной функция поли-Т структуры в области старта транскрипции, которая является характерной особенностью этого гена и присутсвует также у udp S. typhimurium. Кроме того, сравнительный анализ генов udp Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae выявил высокую. консервативность структурных элементов промотора (Zolotukhina М., Ovcharova L, 2003). Однако, наблюдающиеся различия в эффективности экспрессии гена udp у этих бактерий, свидетельствуют о сложности и неоднородности взаимодействий различных регуляторных белков с промоторной областью udpP. В связи с этим представляется актуальным проведение функционального анализа структурных элементов этого промотора.

Ген udp входит в состав так называемого CytR-регулона, контролирующего экспрессию генов катаболизма и транспорта нуклеозидов в клетке. Важно подчеркнуть, что, по меньшей мере, три промотора deoP2, cddP, nupG обладают сходной с промотором гена udp структурой. Поэтому уточнение механизмов транскрипции гена udp позволит создать более полное представление о регуляции всех генов этой группы.

В классической работе (Jacob F., 1961), ставшей основой для создания концепции оперона, указывалось, что регуляция синтеза белка на уровне транскрипции гена повышает уровень жизнеспособности клетки и приводит к экономному использованию ресурсов. Следовательно, можно предположить, что на начальных этапах эволюции до появления элементов регуляции, большинство бактериальных генов находилось под контролем промоторов, экспрессия которых осуществлялась конститутивно и не зависела от дополнительных белковых факторов. В процессе эволюции генома Е. coli в структуре промоторов могло происходить накопление спонтанных мутаций, снижающих его активность и одновременно обусловливающих зависимость экспрессии промотора от присутствия специфических регуляторных белков, которые, в свою очередь, модулировали активность промотора в зависимости от условий среды обитания. В связи с этим представлялось актуальным проведение направленной поэтапной модификации строго регулируемого природного промотора гена udp в конститутивный путем сайт-направленного мутагенеза различных структурных элементов промотора. Другими словами, мы попытались реконструировать процесс, обратный тому, который, по-видимому, происходил в процессе эволюции бактериальных промоторов, с целью выявления возможных причин и способов, используемых клеткой для создания регулируемых промоторов.

Цель и задачи исследования

Настоящая работа выполнялась с целью проведения функционального анализа структурных элементов регуляторной области гена udp Е. coli и уточнения механизмов ее позитивной и негативной регуляции, а также процесса инициации транскрипции. Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач: проведение направленного мутагенеза в области старта транскрипции, для получения набора мутантных промоторов, позволяющего изучить механизм функционирования этой области;

— проведение направленного мутагенеза пентамерных мотивов 5'-TTGCG-3' и 5'-CGAAAA-3' и получение коллекции мутантных промоторов, позволяющих проследить функциональную взаимосвязь между-10 и — 35 областью;

— проведение направленного мутагенеза в участках связывания белка-активатора и —35 области, для получения мутантных промоторов, позволяющих изучить взаимодействия между RNAP и CRPопределение стартов транскрипции генов udp Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae.

Научная новизна. Проведен систематический анализ структурных элементов промотора гена udp с помощью сайт-специфического мутагенеза. Выявлено функциональное перекрывание этих элементов как на стадии узнавания промотора RNAP, так и на стадии инициации транскрипции. При сравнении эффективности экспрессии мутантных промоторов с различными заменами в -10 области выявлено наличие конкуренции между белками CytR и RNAP за связывание в промоторной области гена udp с белком-активатором CRP. На основе мутантных промоторов с модифицированной —35 областью впервые показана способность RNAP конкурировать с комплексом cAMP-CRP за связывание с промотором при наличии близкой к консенсусу -35 области. Изучение мутантных вариантов промотора udpP с модифицированными сайтами связывания белка CRP позволило доказать, что присутствие белка-активатора на сайте CRP2, на фоне поврежденного CRPl-сайта, способствует повышению уровня экспрессии промотора udpP.

Проведение экспериментов по изучению транскрипции гена udp на стадии инициации позволило сделать вывод о способности единственной замены — 15С—>Т на фоне консенсусной -10 области приводить к независимой транскрипции промотора.

Установлено, что инициация транскрипции гена udpP сопровождается ярко выраженным слипадж-эффектом. При этом в качестве старта транскрипции могут использоваться несколько соседних тиминовых нуклеотидов. Выявлено, что самым эффективным при этом является остаток тимина в положении -1. Также показано, что остаток гуанина в положении +3 может выступать и в качестве дополнительного старта, и выполнять функцию структурного стабилизатора транскрипта, способствуя переходу транскрипционного комплекса к стадии элонгации.

Обнаруженная нами способность структуры СЯР2-сайта оказывать влияние на выбор RNAP стартового нуклеотида, выявленная на фоне близких к консенсусным -10 и —35 областей, подтверждает факт функционального перекрывания структурных элементов промотора udpP на стадии инициации транскрипции.

Практическая значимость. Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция штаммов, содержащих промоторы с мутациями в различных элементах структуры, которая может быть использована для дальнейших исследований в этой области.

Установлен факт наличия конкуренции между регуляторными белками и RNAP за связывание с промотором.

Показано, что выбор RNAP инициирующего нуклеотида зависит от присутствия в структуре промотора элементов, ответственных за положительную регуляцию. Полученные результаты могут быть использованы при изучении генов, обладающих подобной структурой, учитывая, что ген udp является членом CytR-регулона, в котором несколько промоторов имеют сходную структуру.

В результате работы установлено, что промотор гена udp в условиях дерепрессии является не менее эффективным, чем имеющие большую практическую и научно-исследовательскую значимость промоторы lacZ и lacUV5, и может быть использован для создания высокоэффективного экспрессионного вектора. Так, в ходе исследований на основе мутантных промоторов создан набор рекомбинантных плазмид, позволяющих осуществлять экспрессию гена реперного белка с требуемой эффективностью.

Структура работы. Диссертация изложена на 131 листе машинописного текста, включая 19 рисунков и 7 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей: описание материалов и методов, изложение и обсуждение результатов, выводов и списка используемой литературы.

Список литературы

включает 245 работ отечественных и зарубежных авторов.

выводы.

1. Проведен сайт-направленный мутагенез -10 области промотора гена udp E.coli. Показано, что негативная регуляция промотора udpP под действием белка-репрессора CytR существенно снижается при внесении мутаций, улучшающих -10 область промотора, а также при наличии «удлиненной области Прибнова» .

2. Создана коллекция мутантных вариантов промоторной области гена udp Е. coli, содержащих замены в —35 области, а также в сайтах связывания белка CRP. Показана способность РНК-полимеразы конкурировать с комплексом cAMP-CRP за связывание с промотором udpP при наличии близкой к консенсусу -35 области. Установлено, что введение мутаций, приводящих к формированию канонических последовательностей в -10 и -35 областях промотора, практически полностью устраняет как позитивную (комплекс cAMP-CRP), так и негативную (CytR) регуляцию промотора.

3. Анализ мутантных вариантов промотора udpP с модифицированными сайтами связывания белка CRP показал, что на фоне поврежденного CRP1-сайта присутствие белка-активатора на сайте CRP2 обеспечивает примерно 2-кратное усиление уровня экспрессии промотора udpP.

4. Показано, что инициация транскрипции гена udp происходит с нескольких тиминовых нуклеотидов. Наиболее часто используемым стартом транскрипции является остаток тимидина в положении -1. Установлено, что остаток гуанина в положении +3 может выступать в качестве дополнительного старта и одновременно выполнять функцию структурного стабилизатора транскрипта, способствуя переходу транскрипционного комплекса к стадии элонгации.