Карбоангидразы алкалофильной строматолитобразующей цианобактерии Microcoleus chthonoplastes: Идентификация и локализация

В литературных источниках, посвященных истории Земли и происхождению жизни, большое внимание уделяется проблемам становления биосферы, и взаимосвязи этого процесса с историей развития растительных организмов. Некоторые вопросы до сих пор остаются спорными, и среди ведущих специалистов в этой области нет единого согласия, что, конечно же, связано с невозможностью моделирования со стопроцентной точностью процессов, происходивших в далеком прошлом. Но, то же время, существует единодушное мнение, что в формировании биосферы в современном виде большую роль сыграли сине-зеленые водоросли, или цианобактерии.

На начальных этапах истории Земли ее атмосфера состояла в основном из газов, образовавшихся в результате вулканической деятельности, и не содержала молекулярного кислорода — агента, необходимого для ряда физиологических процессов огромной группе живых существ — аэробов. Тайна появления жизни на Земле по сей день остается неразгаданной. Однако с появлением на Земле прокариотного сообщества произошла глобальная перестройка всей геосферно-биосферной системы. Цианобактерии радикально изменили газовые соотношения атмосферы в сторону увеличения концентрации кислорода и уменьшения содержания углекислого газа, связав большое количество СОг в карбонаты и выделяя О2 в процессе фотосинтеза. С появлением кислорода в атмосфере возник озоновый слой, преграждающий путь ультрафиолету. Все это дало возможность появления высокоорганизованных эукариот, использующих энергетически более выгодный процесс кислородного дыхания вместо анаэробного брожения, выхода жизни на сушу, и появления всех основных групп известных ныне животных и растений.

Участие циано-бактериального сообщества в связывании атмосферного СОг на ранних этапах истории Земли подтверждается наличием в осадочных породах строматолитов — слоистых известняковых отложений, представляющих собой литифицированные циано-бактериальные сообщества, аналогичные современным бентосным матам. Строматолитобразование продолжается и по сей день. Однако, в настоящее время это довольно незначительный по своим масштабам процесс. Хотя циано-бактериальные маты существуют во многих районах мира, настоящие строматолиты они образуют довольно редко.

Геомикробиологические процессы, имеющие место при образовании современных строматолитов, до сих пор плохо изучены, в связи с чем затруднена интерпретация тех условий на нашей планете, при которых имело место формирование строматолитов докембрия, а, отсюда, и реконструкция древних биогеохимических процессов на нашей планете. До сих пор неясно, принимают ли участие в формировании строматолитов какие-либо физиологические процессы, или мат лишь структурирует естественное осадконакопление. Нами было выдвинуто предположение, что ключевую роль в сгроматолитобразовании может играть фермент карбоангидраза (КА), устанавливающий обратимое карбонатное равновесие. В настоящее время фермент найден практически у всех групп живых организмов, где он участвует в осуществлении ряда физиологических процессов, среди которых есть и идущие с отложением карбоната кальция. У человека это образование атеросклеротических бляшек, у кораллов и протает — построение известкового скелета. Видится вполне вероятным, что КА может участвовать и в сгроматолитобразовании в циано-бактериальных матах. В то же время, организация КА системы у представителей бентосных сообществ до сих пор не изучена. В качестве объекта использовали способную к отложению СаСОз бентосную цианобактерию Microcoleus chthonoplastes — представителя микробных сообществ циано-бактериальных матов, а также алкалофильных сообществ, считающихся реликтом древней микробиоты, сохранившейся в экстремальных условиях содовых озер.

Целью настоящего исследования являлся поиск у реликтовых цианобактерий внеклеточных КА, имеющих доступ к наружному субстрату, и оценка возможности их участия во внеклеточном отложении карбоната кальция.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность карбоангидразы в различных клеточных фракциях Microcoleus chthonoplastes.

2. Исследовать локализацию карбоангидраз в элементах клеточных оболочек и на тонких срезах клеток М. chthonoplastes.

3. Определить принадлежность внеклеточных карбоангидраз М chthonoplastes к классам этого фермента.

4. Охарактеризовать некоторые свойства внеклеточных ферментов (рН-зависимость, pi, молекулярную массу, пептидный профиль).

выводы.

1. Показано наличие активности КА во фракции клеточных оболочек, а также в интактных клетках Microcoleus chthonoplastes, что свидетельствует о наличии у него внеклеточного фермента, имеющего доступ к наружным СО2/НСО3″ -субстратам.

2. Для наружных КА показана высокая максимальная активность в области высокощелочных рН (около 10), характерных для среды обитания М. chthonoplastes, и пик ферментативной активности в области рН 7.5.

3. С помощью Вестерн блоттинга с афинно очищенными антителами против белка Cah-3 (а — КА), а также антителами против Р — КА из разных организмов, установлено наличие в клеточных оболочках М. chthonoplastes КА, а — и ртипов.

4. Внеклеточная КА, а — типа М. chthonoplastes локализована в гликокаликсе цианобактерии.

5. Cah-З — подобная КА М chthonoplastes характеризуется молекулярной массой около 34 кДа и изоэлектрической точкой в области pi 3.5.

6. Получен пептидный профиль, а — КА с использованием метода MALDI-TOF масс-спектроскопии.

7. Предложена схема участия внеклеточных КА М. chthonoplastes в фотосинтетической ассимиляции углерода и связи этого процесса с отложением СаСОз при минерализации циано-бактериального мата, учитывающая локализацию КА в наружных слоях цианобактерии и градиенты рН в окружающей среде и различных компартментах клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Для того, чтобы понять биологическую роль обнаруженных нами в клеточных оболочках М. chthonoplastes КА аи Р-типа, и оценить их возможное участие в минерализации циано-бактериального мата, необходимо рассмотреть, какие функции могут выполнять КА в клетках цианобактерий.

Участие КА в процессе автотрофной ассимиляции Су цианобактерий является хорошо установленным фактом. Наиболее хорошо изучена функция Р-КА, которая кодируется имеющими высокую степень гомологии генами icfA у Synechococcus РСС 7942 (Fukuzawa et al., 1992) и ссаА у Synechocystis РСС 6803 (So & Espie, 1998). Предполагается, что IcfA и СсаА вместе с РБФК входят в состав карбоксисом, где участвуют в генерации С02 в месте его фиксации.

Вторая функция КА у цианобактерий может быть связана с транспортом Q из среды в клетку. Полагают, что эту роль выполняют внеклеточные КА цианобактерий ЕсаА и ЕсаВ, которые участвуют в образовании С02 и/или НСОз" -субстратов для переносчиков углерода, локализованных в цитоплазматической мембране. Эти ферменты, выполняющие схожие функции, относятся к разным классам: ЕсаА (Synechococcus РСС 7942, Anabaena sp. РСС7120) отнесена к а-КА (Soltes-Rak et al., 1997), a EcaB (Synechocystis PCC 6803) — к p-KA (So et al., 1998).

Обе функции КА, рассмотренные выше, наиболее часто обсуждаются в литературе и касаются в основном ферментов из фотосинтезирующих организмовцианобактерий и микроводорослей. Однако в настоящее время, после обнаружения трех негомологичных классов КА, которые могут присутствовать у одного организма (в том числе и у цианобактерий), все чаще отмечается, что биологическая роль этих ферментов может быть значительно шире и разнообразнее (Smith & Ferry, 2000). Потенциальные возможности КА видят, прежде всего, (1) в регулировании процессов удаления или поставки С02/НС0з* во многих энзиматических реакциях, а также (2) в поставке этих продуктов для переносчиков при их транспорте через клеточные мембраны. Выполняя эти функции, фермент принимает участие, в том числе и опосредованное, в самых разнообразных процессах жизнедеятельности.

Для многих эукариотических водорослей, протист, а также животных организмов известны примеры кальцифюсации с участием КА. Эта функция КА хорошо изучена у кораллов (Lucas & Knapp. 1997; Furla et al. 2000) и на примере транскальцификации у коюсолитофориды Emiliania huxleyi (Quiroga & Gonzalez, 1993; Nimer & Merctt. 1996; Sekino et al., 1996). Известковый кокколит формируется во внутриклеточных цистернах Е. huxleyi и затем выходит па поверхность клетки, образуя ее наружный скелет. У кораллов КА Также функционирует во внутриклеточной среде. У цианобактерий. ответственных за внушительную геологическую летопись строматолитов, ситуация иная. Карбонаты кальция и магния отлагаются вне клетки (Заварзин, 2002) и, следовательно, необходимо действие внеклеточной КА. Представляется вполне вероятным, что КА. локализованные в наружных слоях клетки, могут участвовать в минерализации цианобактерий. Таким образом, ферментативная активность КА могла способствовать и образованию строматолитов докембрия. гликокаликс периплазлштическое пространство.

1-КА карбоксмсомд цитозаль.

Рис. 23. Организация КА системы в клетках алкалофильной цианобактерии М. chthonoplastes.

Установленная нами локализация фермента, а — типа в гликокаликсс М chthonoplastes не вызывает сомнения. Обнаруженные, по крайней мере, две КА |5 типа, могут находиться как в гли кокал иксе, так и в периплазматичееком пространстве клеточных оболочек цианобактерии. В пользу этого предположения свидетельствуют также полученные нами данные о зависимости активности внеклеточных КА от рН внешней среды. В соответствие с представленной ранее.

100 схемой строения наружных оболочек цианобакгерий (рис. 12), и основываясь на полученных нами экспериментальных данных, можно предложить следующую схему организации КА системы в клетках М. chthonoplastes (рис. 23). Показанное па рисунке присутствие внутриклеточной карбокси сом ал ьной КА р — типа является установленным и описанным в литературе фактом (Kaplan & Reinhold. 1999).

Полученные нами данные об активности наружных КА могут подтверждать важную роль экзогенных ферментов в утилизации бикарбоната для фотосинтетической ассимиляции углерода у алкалофшгов, как это представлено нами на рис. 24. При сильнощелочных значениях рН содовых озер (около 10), весь растворенный в воде Q присутствует виде карбоната и бикарбоната. Для цианобакгерий показано существование нескольких систем переноса НС О/ (Badger & Price. 2003). гл и ко кал икс периплазма рН 9.8 рН-8.

СО Ч.

Jfti-KA НСОз'" .

• СО-, ||МА.

НСО3цитоплазма рН 7.

С02.

It.

НС О" .

СО2-*И>фк lt (WA НСОз" карбокси сом а.

Рис. 24. Схема фотосинтетической ассимиляции Cj у М. chthonoplastes при участии наружных КА, а — и р — типа.

Большая часть бикарбоната, утилизированного клеткой вне зависимости от механизма его транспорта, поступает в карбоксисому, где он при помощи внутриклеточной КА р — типа (рис. 24) превращается в СОдля последующей фиксации РБФК. Однако, часть поступившего в клетку НСОз" может спонтанно превращаться в С02 еще до фиксации при фотосинтезе по уравнению Гендерсона-Хассельбаха. вследствие более низких значений внутриклеточного рН по сравнению с окружающей средой (см. раздел 1.2.2). Ранее нами было показано, что цитоплазматический рН алкалофилов находится в нейтральной области (рис. 17).

Образовавшаяся углекислота должна «вытекать» из клетки по градиенту концентрации. Тогда находящиеся в клеточных оболочках КА, а — и р — типа будут препятствовать этой утечке, превращая СО2 обратно в бикарбонат и поставляя его для переносчиков через мембраны цианобактерии (рис. 24).

При рассмотрении связи фотосинтетической ассимиляции Сс отложением кальция необходимо принимать условия обитания, близкие к морским (рН около 8), для которых показаны примеры минерализации М. chthonoplastes (Герасименко, 2002). Как известно, строматолитобразование в содовых озерах не происходит вследствие того, что при сильнощелочных рН кальций исчезает из раствора как макрокомпонент и откладывается на дне в виде химически осажденного СаС03 (Заварзин, Жилина, 2000).

Оба известных для клеток цианобактериЙ механизма утилизации бикарбоната связаны с подщелачиванием околоклеточного пространства (рис. 25). Утилизация бикарбоната может происходить (1) в обмен на выделение гидроксила в окружающую среду (McConnaughey, 1994) (рис. 25, А), и/или (2) быть связанной с симпортом ионов натрия (Badger & Price, 2003) (рис. 25, Б). Последнее приводит к подщелачиванию цитоплазмы и активации вслед за этим №±АТФазы, важного компонента рН-стата цитозоля алкалофилов, осуществляющего обмен Na+ на протон из окружающей среды (Пагис, 2003). Таким образом, оба механизма утилизации бикарбоната ведут в конечном итоге к увеличению рН околоклеточного пространства.

Достижение рН околоклеточных слоев значений, выше 9, будет приводить к образованию гранул карбоната кальция на гликокаликсе цианобактерии, при условии наличия свободного Са2+ в окружающей среде (рис. 25). Таким образом, фотосинтетическая ассимиляция Q клетками М. chthonoplastes будет сопровождаться их минерализацией. Потребление бикарбоната создает физико-химические условия, способствующие образованию щелочного барьера в околоклеточных слоях цианобактерии, что важно, с позиции геохимиков, для понимания осаждения кальция в так называемых биологически опосредованных реакциях биоминерализации цианобактериями. внешняя среда околоклеточный рН8 слой рН >9 нсо3—^ с*2+1 «ч Са<�НС03)2 СаС03 кальцифпкацня (А)) р—онвнешняя среда околоклеточный рН8 слой рН >9 нсо3—J Са2+| —^ Са (НС03)2 «— 1 «.-?, СаСОэ кальцпфнкацпя (Б)) -> Na+? АДФ уА— Na+ / f) ч-* АТФ.

Рис. 25. Возможные механизмы утилизации Cj клетками М. chthonoplastes и связь этого процесса с минерализацией циано-бактериального мата.

При рассмотрении связи между активностью наружных КА и минерализацией следует также учитывать и т"г факг. что клетка в зависимости от стадии своего рос та не всегда осуществляет фотосинтез с равной интенсивностью. В случае молодой культуры и высокой скорости фотосинтеза, утечка в окружающую среду С02, образовавшегося вследствие перехода в него потребленного клеткой бикарбоната, может идти интенсивнее подщелачивания окружающего пространства и приводить к понижению pi 1 в околоклеточных слоях.

В этом варианте может лаже наблюдаться вынос кальция из уже отложившегося строматолита, находящегося иод слоем циано-бактериального мата (рис. 26, А).

При достижении клетками стационарной стадии роста (рис. 26. Б), процесс потребления бикарбоната идет с намного меньшей интенсивностью, вследствие чего в околоклеточных слоях могут преобладать процессы подщелачивания и выпадения кальция в осадок. Однако, из литературы известно, что процессы минерализации скорее всего связаны с активным фотосинтезом (Некрасова с соавт. 1983; Заварзин, 1989; Thompson & Ferris. 1990), что указывает на большую достоверность схемы кальцификации, предложенной на рис. 25. В то же время, в некоторых работах показано, что отложение минералов кальция скорее всего происходит постморталыю (Крылов с соавт., 1989; Заварзин. 2002). что не исключает и механизма, представленного на рис. 26. Б.

Рис. 26. Зависимость кальцификации циано-бактериального мата и связанного с ним строматолитобразования от стадии роста цианобактериальных клеток.

В заключение можно привести общую схему, отражающую работу наружных КА. их роль к клетке М. chthonoplastes. а также связь этих процессов с отложением карбоната кальция (рис. 27). Роль К, А здесь сводится к стабилизации рН в около клеточном пространстве и поддержании концентрации субстрата (НССЬ"), необходимого как для обеспечения фотосинтеза, так и отложения СаС03. внешняя среда околоклеточныи периплазма рН 8 слой рН >9 рН 7.5- 8.

СО- <. fa-KA.

НСОз" — Са2+ Са (НС03)2 I.

СаС03 калышфнкяиин.

— СО, jth-KA.

— нсо3цитоплазма рН 7 сог it нсо3.

С02 > IIM’K.

It.

ЖА нсо3.

— н+.

— онкарбоксисома.

Рис. 27. Роль наружных К, А в фотосинтетической ассимиляции неорганического углерода у М. chthonoplastes и связь этого процесса с внеклеточным отложением карбоната кальция рН внешней среды, равный 8. соответствует морским условия обитания, при которых наблюдается отложение CaCOi на поверхности М. chthonoplastes.

Подобный механизм минерализации циано-бактериальных сообществ мог иметь место и в докембрии при формировании толщ древних строматолитов. Однако остается неясным, происходил ли он при участии наружной, а — К, А или же обеспечивался работой ферментов других классов. Считается, что, а — класс К, А является самым молодым, эволюционировавшим из общего родового гена лишь 0.5−0.6 млрд. лет назад, поскольку он обнаруживается главным образом у млекопитающих (Smith & Ferry. 2000). В то же время, наличие, а — КА у исследуемой нами реликтового организма — М. chthonoplastes, возраст которого, согласно палеонтологическим исследованиям, может составлять более 3.5 млрд. лет (Сергеев. 1992), предполагает такое же древнее происхождение, а — класса КА. как р и у — классов этого фермента.