Идентификация B вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала

Хризантемы сегодня входят в список наиболее популярных цветочных культур, которые распространены по всему миру. Для потребителя предлагаются как срезочные, так и горшечные, садовые и тепличные растения. По объему продаж хризантемы уступают только розам. Более чем за 2000;летнию историю культуры создано около 7000 сортов хризантем, часть из которых используют в кулинарии, в фармацевтической промышленности, а также в качестве инсектицидов.

В настоящее время существует много различных сортов хризантем отечественной и зарубежной селекции, которые являются перспективными для использования их в озеленении, особенно в южных районах Российской Федерации. Для выращивания в средней полосе европейской части России предпочтение отдают финским, немецким, английским, голландским и местным сортамфранцузские и китайские используют на юге.

Выращивание хризантем часто связано с физиологическими проблемами. Например, культивирование растений в условиях ограниченного пространства питания часто приводит к угнетению роста, нарушению образования бутонов и развитию дегенеративных цветков, поражению листьев. Данные физиологические отклонения могут привести к гибели растения (Миронова, 2006).

Вегетативное размножение хризантем связано с существенным накоплением в их искусственных популяциях различных заболеваний. Основной урон цветочной продукции наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил В вирус хризантем (ВВХ), который приводит к снижению качества товарной продукции и привлекательности для покупателя. По прогнозам ученых в XXI веке роль вирусных заболеваний будет возрастать, поэтому обнаружение, идентификация, изучение строения и экспрессии генома вирусов, а также получение оздоровленного посадочного материала является актуальной проблемой не только для цветоводства, но и для всего растениеводства.

Цели и задачи исследований: идентификация в растениях хризантем ВВХ и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала. В задачи исследований входило:

1. Подбор оптимального метода выделения тотальной РНК из тканей хризантем.

2. Подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.

3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в тепличных условиях.

4.

Введение

полевых клонов хризантем в культуру in vitro.

5. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем in vitro.

6. Изучение зависимости микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания.

7. Создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала и тестирование пробирочных растений на наличие вируса.

Научная новизна и значимость. Оптимизирована методика диагностики ВВХ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода PCR. Выявлены сорта (Помпон сиреневый и Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем. Установлена степень гомологии между штаммом ВВХ, распространенным на территории Главного Ботанического сада, и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 94%-95% соответственно. В результате проведенных экспериментов усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла независимо от сроков' введения в культуру in vitro. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях неравномерное, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

Проведенные исследования показали, что использование в качестве транспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхней части пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение или осуществлять оздоровление посадочного материала.

Практическая ценность исследований. Полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения. Обнаружены два сорта (Помпон сиреневый, Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем, которые являются перспективными для дальнейшего их применения в селекционном процессе. Усовершенствованная технология клонального микроразмножения хризантем направлена на повышение эффективности их производства. Разработанная схема получения оздоровленных растений хризантем может быть применена для производства качественного посадочного материала, а также при проведении селекционных работ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н. И. Вавилова — фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), на Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008), на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), на Международной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие инноваций в аграрной науке» (Москва, 2009).

ВЫВОДЫ.

1. Оптимизирована методика диагностики ВВХ на основе метода RT-PCR, позволяющая идентифицировать вирус в интактных и пробирочных растениях хризантем. Оптимизация заключалась в подборе оптимального метода выделения тотальной РЕК из тканей хризантем, в подборе праймеров и температурных условий для проведения RT-PCR, а также в определении оптимальной концентрации РЕК для проведения обратной транскрипции. Методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения.

2. Из 13 исследуемых сортов хризантем ВВХ обнаружен в. Ы, среди которых симптомы поражения вирусом в полевых условиях не проявлялись у двух сортов (Академик Жеримунский и Аметист). Исследуемые сорта Помпон сиреневый: и Лучистая являются перспективными для дальнейшего их включения в, селекционном процессе, так как вирус в них не идентифицирован.

3. В результате изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей ДНК установлена степень гомологии между обнаруженными в исследованных сортах штаммах ВВХ и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 95% и 94% соответственно.

4. Усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла, независимо от сроков введения в культуру in vitro при выращивании растений в условиях теплицы. Оптимальной питательной средой на этапе размножения хризантем была среда Мурасиге и Скуга с добавлением 0,5 мг/л ИУК, 15 г/л сахарозы, и культивирование при температуре 20−25°С.

5. Выявлено, что распространение В вируса^ хризантем в пробирочных растениях имеет выраженный ярусный характер, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

6. Проведенные исследования показали, что использование в качестве экспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхнего яруса пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) позволяет получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение, или, как в случае с сортом Лебединая песня, осуществлять оздоровление посадочного материала.