Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард

Одной из важных проблем профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний является разработка методов защиты миокарда от катехоламинового повреждения. К возможным путям снижения кардиотоксического действия этих биологически активных соединений относят в основном фармакологическое воздействие на метаболизм катехоламинов, их захват и освобождение миоцитами, ин-гибирование и активацию ферментов, непосредственно участвующих в процессе гормон-рецепторного взаимодействия, на процесс пере-кисного окисления липидов и транспорт кальция в миокардиальные клетки. На этих принципах частично основано применение^{-блока-торов,} антиоксидантов и антагонистов кальция. Вместе с тем, использование последних не всегда приводит к достаточно высокому лечебному эффекту.

Более перспективным следует признать применение для нейтрализации кардиотоксического эффекта катехоламинов специфических антител. Их использование в качестве антагонистов биологически активных веществ ознаменовалось значительными успехами лишь в последние годы. Результаты работ, выполненных рядом зарубежных исследователей (Dzau et al., 1980; НаЪег, 1982; Butler, 1982), позволяют считать, что антитела способны нейтрализовать специфическое действие физиологически активных веществ. Однако, подобного рода антагонисты были применены в основном к таким соединениям, как лекарственные препараты.

Благодаря интенсивным исследованиям последних лет была доказана принципиальная возможность получения антител к катехо-ламинам (Grota, Brown, 1976; Miwa et al., 1976; Diener et al., 1981; Полевая и соавт., 1981; Geffard et al., 1984a, 1984Ъ). Однако, до настоящего времени известно крайне мало о получении антител к основным катехоламинам — А и НА, а вопросы их влияния на физиологическую активность этих симпатомиметичес-ких аминов до сих пор не изучены.

Учитывая это, основная цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения антител к НА и их использования в предотвращении повреждающего действия этого катехолами на на миокард. Выбор данного биогенного амина был обусловлен его исключительной ролью в регуляции функции миокарда и высокой степенью повреждающего действия на миоциты в условиях целостного организма (Меерсон, Гомазков, 197ХRona et ai., 1975).

Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

1. Разработка условий получения конъюгированных антигенов путем введения НА в белковую матрицу.

2. Разработка условий получения антител к НА путем иммунизации животных.

3. Идентификация сывороточного компонента, связывающего НА.

4. Определение титров, сродства и специфичности антител к НА.

5. Определение валентности антител путем титрования связывающих участков гаммаглобулина спин-меченным НА.

6. Исследование возможности ингибирования повреждающего действия избыточных концентраций НА на миокард с помощью антител к этому катехоламину.

Результаты проведенной работы позволяют вынести на защиту следующие положения. Получены конъюгаты, содержащие разное количество НА в пересчете на макромолекулу носителя, который был связан путем сочетания этого катехоламина с такими белками, как ГУ, БТ и БСА. Предложена схема иммунизации животных, в результате применения которой у кроликов образуются антитела, взаимодействующие с НА. Получены данные, подтверждающие принадлежность связывающего сывороточного компонента к классу гаммагло-булинов. Установлено, что сродство антител и их титры зависят от вида применяемого при иммунизации конъюгированного антигена и длительности иммунизации. Показано, что антитела обладают высокой специфичностью по отношению к НА при взаимодействии с другими катехоламинами. Результаты, полученные путем титрования связывающих мест антител спин-меченым НА, указывают на бивалентный характер связывания антителами этого катехоламина. В опытах на модели изолированного сердца крысы показано, что мембрано-повреждающее действие НА, документированное по утечке внутриклеточной ЛДГ в перфузат, может быть специфическим образом предотвращено с помощью антител к НА.

Таким образом, существует перспектива использования полученных в работе результатов для широкого применения в клинической практике, в частности для решения ряда практических задач кардиологии.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА I.

ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ НА МИОКАРД И.

СУЩЕСТВУЮЩИЕ СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ИХ КАРДИОТОК-СИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ.

Катехоламинам принадлежит исключительно важная и многогранная роль в регуляции процессов жизнедеятельности организма в физиологических и патологических условиях. Они являются медиаторами симпатических нервных импульсов центральной и периферической нервной системы и оказывают сильное влияние на физиологические системы и метаболические процессы в органах и тканях при действии на организм различных экстремальных факторов (Мат-лина, Меньшиков, 1967).

Установлено, что 80% всех катехоламинов, синтезированных в мозговом слое надпочечников, составляет А, примерно 20% НА и не более 2% - ДА. В органах, имеющих развитую сеть симпатических нервных волокон, таких, например, как сердце, обнаружена более высокая по сравнению с другими органами концентрация НА (Euler, 1961; Axelrod, Weinshilboum, 1972). Так, максимальное содержание его составляет 70−80% от общего содержания катехоламинов в сердечной мышце (Говырин, Леонтьева, 1964; Euler, 1967).

Введение

3Н-НА показало, что 80% эндогенного НА синтезируется непосредственно в сердце, а 20% поступает из крови (Ко-pin, Gordon, 1963). При перфузии сердца катехоламинами в высоких концентрациях они поглощаются не только нервной тканью, но и клетками сердечной мышцы (salt, iversen, 1972).

Уровень катехоламинов в миокарде определяется функциональным состоянием его иннервационного аппарата. Раздражение симпатических нервов вызывает увеличение в миокарде общего количества катехоламинов, главным образом НА. При этом скорость освобождения НА и поступление его в кровь возрастает (Кассиль, Парин, 1970).

Установлено, что физиологическое действие катехоламинов на ткани осуществляется при взаимодействии их со специфическими ад-ренергическими структурами эффекторного органа. Выделяют два основных типа адренергических рецепторовл и ^ -рецепторы (Ману-ХИН, 1968; Axelsson, 1971; Baron et al., 1972; Levitzki, 1978). Результат действия катехоламинов на, сердечно-сосудистую систему зависит от того, с какими адренорецепторами они взаимодействуют. Физиологические эффекты катехоламинов реализуются преимущественно путем воздействия адреномиметика на £-рецепторы миокарди-альных клеток (Atlas, 1977; Могап, 1963).

А и НА обладают J. истимулирующим действием. Стимулируя jb-рецепторы миокарда, НА влияет на силу и частоту сердечных сокращений, однако, инотропное влияние, А более выражено, чем у НА (Furnival et al., 1971). Функциональное, состояние адрено-рецепторов имеет чрезвычайно важное значение для величины и характера реакций эффекторного органа, которые при патологических состояниях могут быть изменены (Манухин, 1968; Меньшиков, 1970).

В настоящее время установлено, что катехоламины участвуют в метаболизме сердца и других органов путем их взаимодействия с аденилциклазной системой, локализованной в клеточной мембране (Levitzki, 1978,1981).

Катехоламины оказывают выраженное и многостороннее действие на сердечно-сосудистую систему. В обычных условиях введение, А или НА вызывает тот же эффект, что и раздражение симпато-адреналовой системы. При их введении наблюдается увеличение частоты и силы сердечных сокращений, ударного и минутного объема работы левого желудочка (Furnival et al., 1971).

При действии катехоламинов на сердце наблюдается повышение его возбудимости, увеличение скорости проведения импульсов и повышение автоматизма сердечной мышцы, что может привести к возникновению различного рода аритмий (Федоров, 1968).

Известно, что катехоламины влияют на потребность сердца в кислороде, стимулируя окислительные процессы в миокарде (chal-loner, Steinberg, 1965). В физиологических условиях это может быть компенсировано усилением скорости коронарного кровотока и увеличением потребления тканями сердца кислорода. При стимуляции симпато-адреналовой системы и высоких концентрациях катехоламинов в крови потребность миокарда в кислороде значительно возрастает и в нем обнаруживаются электрофизиологические и патоморфо-логические признаки гипоксии (Райскина, 1964; Challoner, 1968; Чечулин, 1967). Raab (1962) считает, что в этих условиях увеличение потребления кислорода миокардом не восполняется возросшим увеличением коронарного кровотока и может привести к развитию инфарктоподобных повреждений миокарда.

НА вызывает в миокарде изменения, сходные с адреналиновыми. Так, в некоторых работах (Shahab et al., 1969; Staszewska-Barezak, Ceremuzynski, 1968) показано, что НА, освобождаясь в ише-мизированной зоне миокарда при экспериментальной ишемии сердечной мьппцы, играет важную роль в развитии её повреждения.

Более детально характер и особенности катехоламинового повреждения миоцитов изучались в исследованиях группы Rona et al. (Chappel et al., I959- Dusek et al., 1971,1973; Rona et al., 1959,1973).

Исследование повреждающего действия катехоламинов на миокард осуществлялось также в «чистых» экспериментах с использованием модели изолированного сердца крысы (Kannengiesser et al., 1975; Waldenstrom et al., 1978; Opie et al., 1979). Waldenstrom et al.(I978) изучали влияние НА на сердечную мышцу, перфу-зируя сердца крыс по Neely et al. (1967). Повреждающее действие НА на миокард оценивалось в этих опытах по динамике выхода в перфузат внутриклеточного фермента — КФК. На основании полученных результатов, авторы пришли к выводу, что при воздействии НА в концентрации >10 М возникают повреждения миоцитов, идентичные изменениям, которые наблюдаются в околоинфарктной зоне развивающегося инфаркта миокарда. Это послужило обоснованием высказанной гипотезы о возможной роли НА в генезе инфаркта миокарда у человека.

Позднее Opie et al. (1979) в опытах на работающих моделях перфузируемых сердец крыс установили, что морфологические изменения в сердечной мышце, вызванные А, сопровождаются значительным выходом внутриклеточной ЛДГ в перфузат.

Считается доказанным, что катехоламины являются физиологическими регуляторами метаболизма сердечной мышцы, а чрезмерное повышение их концентрации приводит к кардиотоксическому эффекту независимо от того, введен ли катехоламин экзогенно или имеет место избыточная продукция эндогенных катехоламинов, возникшая в результате различных неадекватных воздействий. Механизмы повреждения мышечных клеток сердца при избытке катехоламинов еще во многом не ясны, хотя исследования последних лет приближают нас к пониманию происходящих при этом процессов.

Ныне все очевиднее становится тот факт, что все некорона,-рогенные поражения сократительных клеток сердца возникают вследствие перегрузки их кальцием (Меерсон, Уголев, 1980; Farber t 1981). Токсическое действие катехоламинов с самого начала связано с неконтролируемым проникновением внешнего кальция внутрь кардиомиоцитов (Fleckenstein et al., 1975). С увеличением притока кальция через мембрану во время действия^{-адренерги-ческих} соединений имеет место падение концентрации макроэргичес-ких фосфатов (Takenaka, Higuchi, 1974), что приводит к энергетическому дефициту. Длительный дефицит АТФ и креатинфос-фата может в свою очередь вызвать повреждение миокардиальных клеток, феноменологически выражающееся в изменении их ультраструктуры и сопровождающееся потерей внутриклеточных ферментов (Fleckenstein, 1970).

Известно также, что структура мембран может разрушаться под действием продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов, а активация перекисного окисления липидов происходит при воздействии на клеточные структуры высоких концентраций катехоламинов (Коган и соавт., 1979). На возможность возникновения такого механизма катехоламинового повреждения указывает Меерсон с соавторами (1980) в опытах при экспериментальном воспроизведении эмоционально-болевого стресса.

Применение мелкоструктурных меток-трейсеров внесло важный вклад в изучение ультраструктурных изменений мембран миоцитов при кальциевых повреждениях клеток (Rona et al., 1975; Шаров и соавт., 1980).

Rona et al. (1975) впервые обнаружили, что токсические дозы^{-адренергических} катехоламинов (изопротеренола и НА) приводят к раннему изменению проницаемости сарколеммы кардиомио-цитов. По их данным, такой трейсер, как пероксидаза проникал в саркоплазму миоцитов, которые не имели видимых ультраструктурных изменений.

Позднее Шаровым и соавт. (I960) путем использования коллоидного лантана были подтверждены данные о раннем нарушении проницаемости сарколеммы для ионов кальция при воздействии токсических доз изопротеренола.

Изменения происходящие в мембранах саркоплазмы под воздействием катехоламинов приводят к утечке внутриклеточных ферментов и субстратов (Lewis, 1967; Brachfeld, 197?), При этом нарастание активности специфических миокардиальных ферментов (КФК и ЛДГ) в кровотоке, либо уменьшение их активности в ткани миокарда может служить показателем степени повреждения сердечной мышцы (Waldenstrom et al., 1978; Opie et al., 1979).

Из представленных экспериментальных работ можно заключить, что изменения в миокардиальных клетках при действии токсических концентраций катехоламинов реализуются через избыточную^{-ад-ренергическую} стимуляцию с последующим увеличением потребности миокарда в кислороде, падением уровня тканевых макроэргов, а также через нарушение мембранной проницаемости и неконтролируемый вход внутрь клетки кальция.

Поскольку катехоламины играют существенную роль в развитии повреждений сердечной мышцы, особое значение приобретает вопрос защиты миокарда от их кардиотоксического действия. Решение его открывает перспективу предотвращения, либо ослабления повреждающего симпатомиметического эффекта путем воздействия на различные звенья этого механизма" Оно реализуется на разных этапах кругооборота катехоламинов в организме: на их захват и освобождение миокардиальными клеткамисинтез катехоламиновингибирование и активацию энзимов, непосредственно участвующих в процессе гормон-рецепторного взаимодействиятранспорт кальция в миокардиальные клетки (Гацура, 1977).

Процессы синтеза и активации катехоламинов в организме к настоящему времени изучены достаточно детально. Известен ряд ингибиторов тирозин —? -гидроксилазы (ароматические Lаминокислоты, катехины и их аналоги, йодированные производные тирозина), ДОФА — декарбоксилазы (L — метилДОФА, монофторметилДОФА), дофамин ^ -гидроксилазы (антабус, фузаровая кислота), фенилэта-ноламин — Nметилтрансферазы (пирогаллол, флавоноиды типа рутина, кварцетина) (Французова, 1973; Muscholl, Spira, 1982). Однако ингибиторы синтеза катехоламинов не обладают необходимой избирательностью действия в отношении катехоламинов.

Динамика содержания катехоламинов в миокарде при ряде физиологических и патологических состояний в значительной мере определяется их обратным захватом (reuptake). Различают эк-странейрональный и нейрональный типы захвата катехоламинов. Особенностью экстранейронального захвата является небольшая прочность связывания катехоламинов. Блокаторы нейронального захвата катехоламинов (дезипрамин, имипрамин, кокаин) не влияют на по-тенциирующий эффект, А и НА при раздражении постганглионарных волокон, тогда как блокаторы экстранейронального захвата (мета-нефрин и НМН) тормозят этот эффект. Блокаторы нейронального захвата повышают чувствительность органов к эндои экзогенному НА, напоминая в этом отношении сдвиги, наступающие при денерва-ции (Гацура, 1977). Существенное влияние на экстранейрональный захват катехоламинов имеет состояние проницаемости мембранных структур нейронов, функция которых нарушается в острый период ишемии миокарда.

Из современной литературы известно, что аденилциклаза является активной частью^{-адренорецептора} (Levitzki, 1981), активация которой связана с возбуждением адренореактивных систем. Ингибирование аденилциклазной активности может быть достигнуто несколькими путями, а именно, угнетением высвобождения аденилциклазы мембранными структурами миокарда, уменьшением содержания катехоламина и действием непосредственно на адреноре-цепторы. Наиболее эффективным методом является блокада ^>-адре-норецепторов с помощью^{,-адреноблока} торов, которые устраняют основные проявления симпатомиметического эффекта — снижают потребление миокардом кислорода (Baker, Potter, 1980), уменьшают липолиз (Lech et al., 1977), т. е. препятствуют возникновению дефицита энергии в клетках. Некоторые из этих препаратов (пропранолол, неталид) снижают кардиотоксическое действие катехоламинов (Brink et al., 1971).

Гиперкатехоламинемия приводит к появлению избытка жирных кислот (Kjekshus, 1975), что в свою очередь вызывает разобщение процессов окисления и фосфорилирования в отдельных органах и тканях. Повышение активности фосфодиэстеразы — основного фермента расщепления цАМФ — представляет наиболее радикальный путь торможения биологического эффекта образовавшегося цАМФ. К фармакологическим средствам, предположительно способным активировать фосфодиэстеразу, относятся имидазол, никотиновая кислота и инсулин (Schultz et al., 1966; Blecher et al., 1968). Однако, вопрос о терапевтическом применении такого рода веществ до сих пор не вышел за рамки экспериментальных исследований.

Для восстановления сократительной функции миокарда, нарушение которой было вызвано эмоционально-болевым стрессом или введением больших доз А, рядом авторов предложено использование антиоксидантов для предупреждения катехоламиновых повреждений сердца (Меерсон и соавт., 1979; Шимкович, Петков, 1984). В частности, было показано, что предварительное введение животным мощного антиоксиданта-ионола предупреждает активацию перекисного окисления липидов в сердце при действии избытка катехоламинов.

Учитывая «кальциевый» механизм катехоламинового повреждения, в последнее время нашли широкое применение такие антагонисты кальция, как верапамил, Д 600, фениламин и васкорил. По экспериментальным данным, они ограничивают поступление кальция через сарколемму и предотвращают тем самым истощение АТФ и креатин-фосфата (Janke et al., 1970; Fleckenstein, 1970; Kohlhardt et al., 1972; Sigel et al., 1975).

Подобное снижение токсического действия катехоламинов на миокард специфическими ингибиторами проводимости кальция через мембрану имеет иной механизм защитного эффекта, чем блокада J&—адренергических рецепторов сердечной мышцы (Fleckenstein et al., 1975).

С целью оценки эффективности защиты миокарда от повреждающего действия НА и, А под воздействием различных фармакологических препаратов рядом авторов были проведены эксперименты на модели изолированного сердца крысы (Waldenstrom et al., 1978; Opie et al., 1979).

Waldenstrom et al. (1978) показали, что кардиоселектив-ный j>-блокатор — метопролол, антагонист кальция — верапамил и мембраностабилизирующий агент-лидокаин оказывают защитное действие на миокард, снижая выход в перфузат таких цитоплазматических ферментов, как ЛДГ и КФК. Выбор авторами лидокаина, как возможного ингибитора токсического действия катехоламинов, вероятно, обусловлен его способностью уменьшать выход НА из зоны ишемии (Staszewska-Barezak, 1971). Однако, механизм мембраностабилизирующего действия такого типа препаратов еще не ясен.

Показано также, что при перфузии сердец такими липолитическими агентами, как DLпропранолол и никотиновая кислота, с с одновременным воздействием токсической дозы, А (ЮМ), заметно снижается выход ДЦГ из миоцитов в перфузат, по сравнению с перфузией только, А (Opie et al., 1979). В то же время, авторы обнаружили, что верапамил, как антагонист кальция, не влиял на потерю фермента клетками и объяснили расхождения в этих данных с результатами Waldenstrom et al. (1978) применением другой системы перфузии сердца крысы. Opie et al. (1979) пришли к заключению, что утечка ферментов из миоцитов под действием, А связана, в основном, с неконтролируемым входом кальция внутрь сердечной клетки и в меньшей степени с липолизом.

Обобщая приведенные в данном разделе сведения, можно заключить, что благодаря действию на различные звенья механизма повреждающего симпатомиметического эффекта, удается частично предотвратить или снизить некрозогенный эффект катехоламинов. В основном такие результаты можно получить путем применения антагонистов кальция, антиоксидантов и ^,-адреноблокаторов.

Таким образом, охарактеризовав основные пути снижения кар-диотоксического эффекта катехоламинов, следует подчеркнуть перспективность поиска и использования различных фармакологических средств для профилактики «катехоламинового» синдрома. Вместе с тем, известные ингибиторе такого эффекта не обладают селективностью в отношении нейтрализации действия избытка какого-то определенного катехоламина. Поэтому изыскание специфических средств предотвращения повреждающего действия катехоламинов представляет безусловный интерес.

ГЛАВА П.

ПРОБЛЕМА ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К КАТЕХОЛАМИНАМ.

В настоящее время интерес к проблеме получения антител к биологически активным соединениям очень велик. Индуцированные специфические антитела можно использовать для решения целого ряда задач, как медицинского, так и биологического характера:

1. Для идентификации различных соединений в биологических жидкостях при помощи радиоиммунологического метода и некоторых других родственных способов (Reuter et al., 1978; Kleimola, 1978; Spector, 1978; Feskar, Peskar, 1977; Voller et al., I978- Iwasa et al., 1978; Montgomery et al., 1975; Wei, Almirez, 1975; Ullman et al., 1976).

2. Для выяснения определенных сторон метаболизма и фарма-кокинетики лекарственных препаратов (Cais et al*, 1975; Col-burn, 1980).

3. Для определения локализации физиологически активных соединений в биологических структурах (Kb aw et al., 1976,1980).

4. Для устранения аллергических реакций на фармакологические препараты (Davis, Meade, 1970).

5. Для изучения взаимодействия гормонов и других биологически активных веществ с соответствующими рецепторами, а также для обнаружения рецепторов (?/renn, НаЪег, 1979;. НаЪег, 1982).

Основная литература по этой проблеме касается получения антител к различным соединениям для использования в радиоиммунологическом методе.

Представляются весьма интересными данные о применении антител для снижения уровня биологически активных веществ в крови и тканях при определений патологии. Известно использование антител как терапевтических средств предотвращения вредного воздействия на организм целого ряда экзотоксинов (Koch et al., 1977; Latifi, Tabatabai, 1979; Ziegler et al., I98I), Также установлено, что антитела к таким биологически активным компонентам организма, как ферменты и рецепторы клеточных мембран, могут подавлять активность ЭТИХ ферментов (Caldwell, Wigger, 1976; McCans et al. 1974; Dzau et al., 1980) или блокировать специфические центры связывания рецепторов (Kahn et al., 1976; Shiu, Friessen, 1976; Heineman et al^X977). В экспериментах, как in vitro, так и in vivo показано специфическое противодействие антител физиологическому эффекту пептидных гормонов (Christlieb et al., 1969; Frantz, Kleinberg, 1970; Goodfriend et al., 1970; Lipshutz et al., 1972; Terry et al., 1976; Woodside, Heimberg, 1976; Hoist et al., 1978).

Возможность получения антител к низкомолекулярным соедине-ниям-гаптенам сыграла значительную роль в развитии неинфекционной имцунологии и иммунофармакологии, а также молекулярной биологии. Такие антитела способны подавлять физиологическое и фармакологическое действие соответствующих гаптенов. Они специфически блокируют стероидные гормоны (Neri et al., 1964; Ferin et al. 1974), простагландины (Fitzpatrick et al., 1978), серотонин (Ranadive, Sehon, 1967; O’Brien et al., 1975), мелатонин (Wiles et al., 1977), гистамин (Davis, Meade, 1970) и различные лекарственные препараты (Berkowitz, Spector, 1972; Wainer et al., 1973; Gunne et al., 1975; Ковалёв и соавт., 1976; Butler et al., 1977; Flynn et al., 1977; Cerreta et al., 1979; Butler 1982).

Чтобы получить антитела к низкомолекулярным соединениям, необходимо связать их прочной ковалентной связью с антигенным белковым или полипептидным носителем, причем сила и стабильность этой связи являются критериями для антигенности образующегося комплекса. Простая ковалентная связь обеспечивает эту стабильность.

В качестве антигенного носителя чаще всего применяют различные белки, например, сывороточный альбумин (Berg, Kuss, 1980), гаммаглобулин (Marton et al., 1977), гемоцианинС Tateishi et al, 1980), а также синтетические полипептиды (Kamel, Gardner, 1978). Эти соединения имеют достаточное количество различных функциональных групп, пригодных для образования ковалентной связи с молекулой гаптена. Получены результаты, свидетельствующие о влиянии молекулы носителя на иммунологическую специфичность и связывающую способность антител на предоминирующую роль носителя в иммунных ответах (Talamo et al., 1968).

Реакции ковалентного связывания гаптенов с белками проводят в водных растворах при пониженной температуре и нейтральных значениях рН раствора, т. е. в условиях, которые позволяют избежать денатурации белков, К настоящему времени разработан синтез большого количества коньюгатов биологически активных соединений С белками (Erlanger, 1973; (Butler, Beiser, 1973). В получении антител, обладающих высокой специфичностью по отношению к данному гаптену, важную роль играют такие факторы, как структура конъюгированного антигена, применяемого при иммунизации, и характер иммунизации.

Гаптены чаще всего содержат одну или несколько функциональных групп, которые можно использовать для ковалентного связывания с реакционноспособными группами носителя. Один и тот же гад-тен можно связать с белковой молекулой различными способами. Установлено, что характер," размер и положение ковалентной связи между гаптеном и носителем существенно влияют на специфичность индуцируемых антител (Taiamo et al., 1968). Кроме того, особое значение приобретает такая характеристика конъюгированного антигена, как количество присоединившихся молекул гаптена к молекуле носителя. Показано, что этот фактор сильно влияет на титры и специфичность полученных антител (Hendel, Sarek, 1977).

Что же касается характера иммунизации, то здесь установлена определенная корреляция между количеством вводимого экспериментальным животным антигена, схемой иммунизации и специфичностью вырабатываемых антител. Так для получения антител, обладающих широким спектром действия по отношению к психотропным средствам, используют в основном внутримышечное введение больших количеств конъюгированного антигена (30−40 мг/кг веса) по кратковременной схеме иммунизации (Полевая и соавт., 1977). Вместе с тем, специфические антитела, практически не дающие перекрестной реакции с родственными гаптену соединениями, чаще всего получают с применением длительных схем иммунизации и с использованием малых доз антигена, вводимых совместно с адъювантом. Для этих целей большинство исследователей применяют способ иммунизации, предложенный Vaitukaitis et al. (1971).

В последние годы предприняты попытки получения антител к катехоламинам. В частности, были получены антитела к некоторым метаболитам этих симпатомиметических аминов (wisser et al., 1978; Faraj et al., 1977,1981; Shirahata et al., 1980). Такие антитела были использованы для разработки методов радиоиммунологического определения соответствующих гаптенов. Конъюгированные антигены были синтезированы на основе монометилированных (Peskar et al., 1972; Lam et al., 1977; Faraj et al., 1977,1981; Shirahata et al. 1980) и диметилированных производных катехоламинов (Riceherg, Van.

Vunakis, 1975; ?/isser et al., 1978). На примере конъюгирован-ных антигенов с такими производными катехоламинов, четко прослеживается влияние способа конъюгации и применения различных носителей на специфичность антител (Wisser et al., 1978).

Известно, что основные катехоламины — НА и, А относятся к классу пирокатехинов. По своим химическим свойствам они отличаются от метилированных производных катехоламинов тем, что легко трансформируются в хиноны под воздействием кислорода воздуха и при изменении рН среды в щелочную сторону.

Однако^ при синтезе конъюгированных антигенов, содержащих метилированные производные катехоламинов, не требуется особое соблюдение мягких условий реакции, так как эти гаптены достаточно устойчивы к действию окислителей.

Исходя ИЗ ЭТИХ соображений Grotа и Brown (1976) удалось получить антитела, реагирующие с индивидуальными катехо-ламинами, используя в качестве антигенов конъюгаты сывороточного альбумина и сходных по структуре с катехоламинами производных моногидроксифенилэтиламинов, структурные формулы которых приведены на рис. 1. Гаптены ковалентно связывали с носителем с помощью формальдегида. При этом они присоединялись к альбумину посредством метиленового мостика, находящегося в орто-положении относительно фенольного гидроксила моногидроксифенилэтиламина. Авторы показали, что при иммунизации конъюгатом, содержащим си-нефрин, и с использованием в качестве трейсера — 3Н-метанефрина перекрестная реактивность полученных антител с, А и НА была порядка 60% и 0,01%, соответственно.

Некоторыми исследователями была предпринята попытка получить конъюгированные антигены, используя в процессе конъюгации непосредственно катехоламины, а не их производные. Так Spector.

КАТЕХОЛАМИНЫ ноА/ дофамин но/ ow норадреналин.

ОчУусн-сн^н.

ОН СН3 адреналин.

ГИДРОКСШЕНИЛЭТИЛАМИНЫ j/-CHfCHfNH2. иоЛ^ тирамин.

Ч-СИ-СИгМН! НОЛ*/ ОН октопамин ноЛи ®-н3 синефрин.

Рис.Х. Структурные различия между катехоламинами и соответствующими им моногидроксифенилэтилами-нами, используемыми при конъюгации с белком.

1972) показал возможность получения антител к НА, иммунизируя кроликов антигеном, в котором катехоламин был ковалентно связан с альбумином или полиглутаминовой кислотой посредством 1-этил-З (-3-диметиламинопропил) карбодиимида. Схема получения такого комплекса показана на рис. 2. Антитела, индуцируемые этими конъю-гатами, распознавали различия в функциональных группах бензольного кольца, но не были чувствительны к изменениям в непосредственной близости к концевой аминогруппе катехоламинов. Они практически одинаково связывали как НА, так и А.

Позднее японскими исследователями (Miwa et al., 1976, 1977; Yoshioka et al., 1976) были синтезированы конъюгированные антигены катехоламин — БСА по реакции Манниха с применением формальдегида. Реакцию проводили в среде инертного газа, исключающей окисление катехоламина. При этом, как видно из рис. 3, на котором представлена схема синтеза, А — содержащего конъюгата, биогенный амин связывался с носителем по положению 5 бензольного кольца. Применяя такие антигены Miwa et al. (1978) получили высокоспецифичные антитела к А, которые связывали НА и ДА в 6 тысяч раз хуже по сравнению с, А и одинаково реагировали с Lи D — А.

Кроме того, авторами была рассчитана константа ассоциации о т комплекса, А — антитело, высокое значение которой (4,4*10 М) указывает на значительное сродство антител к этому катехоламину.

Сравнивая специфичность и титры получаемых различными способами антител Diener et al. (1981) использовали антигены синтезированные ПО Grota, Brown (1976), Miwa et al. (1977) и Wisser et al. (1978). Они пришли к выводу, что антитела, индуцируемые конъюгатами, в которых гаптены связаны с белком через носитель.

О li.

— с-он R-N = C-N-Rl носитель.

— G-0-C-N-R' I.

NH I R H2N-CHrCH-V^yон.

ОН ЧАон о.

II носитель.

— b-N-CHrCH-/)].

Ь Л11.

ОН.

ОН.

Рис. 2. Схема конъюгации НА с белковым носителем при помощи водорастворимого карбодиимида. iO.

H°YVch-C^H + Qo hoAs/ он.

CH,.

H0N/-CH-CHjN-CO-CH=CИ-СОо H hoAJ OH 4 hcho.

HjN-БСА.

HO jjp ch-chjrn-co-chech-cooh hoAs/ OH CH3.

CHfNH-БСА o. oih hc1.

60°, Зч.

HO As/ он Ц снгын-бса.

Рис. 3. Схема получения конъгогата БСА-А по реакции Манниха. боковые цепи, обладают более высокими титрами, чем связанные посредством заместителей бензольного кольца. Что же касается специфичности, то здесь авторы отмечают идентичность собственных результатов с результатами, полученными другими исследователями.

Обобщая приведенные в данном разделе сведения, следует подчеркнуть, что до сих пор проблема получения специфических антител к отдельным катехоламинам не решена, несмотря на предпринимающиеся периодические попытки индукции таких антител. Тем не менее, рассматривая вышеперечисленные примеры по различным способам синтеза конъюгированных антигенов и получения антител к катехоламинам, можно сделать вывод, что характер, размер и положение ковалентной связи, соединяющей молекулы гаптена и носителя, оказывают огромное влияние на специфичность и титры индуцируемых антител. Кроме того, необходимо отметить, что высокой специфичности антител можно добиться не только синтезом конкретного конъюгированного антигена, но и выбором носителя для этого антигена и схемы иммунизации.

Учитывая это, мы исследовали возможность получения специфических антител к НА, выбор которого обусловлен его значительной ролью в развитии повреждений миокарда, и попытались применить эти антитела в качестве ингибитора кардиотоксического действия этого катехоламина.

В соответствии с целью исследования, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить конъюгированные антигены, содержащие НА, и охарактеризовать их структуру.

2. Исследовать влияние носителей, входящих в состав конъюгированных антигенов, на индукцию антител к НА.

3. Охарактеризоватьсвойства полученных антител.

4. Оценить возможность нейтрализации кардиотоксического действия НА с помощью антител к нему.

5. Исследовать специфичность ингибирования кардиотоксического действия НА полученными антителами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА Ш МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ 3.1. Реактивы.

В работе использовали следующие реактивы и препараты: компоненты буферных растворов, раствора Кребса-Хензеляйта, органические растворители, сернокислое железо (П), лимоннокислый натрий, бор-гидрид натрия, нафталин, фенол («Реахим», СССР) — глутаровый альдегид, сульфат аммония («Merck «, ФРГ) — 1,4-ди-2-(5-фенилоксазолил) бензен, 2,5-дифенилоксазол, полный адъювант Фрейнда, ГУ, кроличий гаммаглобулин («Carbiochem», CHIA) — трис, ДОФА гидрохлорид («Неа-nal Венгрия) — ДА гидрохлорид («Ferak Зап. Берлин) — НА битартрат, Байол F, Арлацель, А («Serva «, ФРГ) — А гидрохлорид, НМН гидрохлорид, БСА, КСА, БТ, CNBr Сефароза 4 В («Sigma», США) — полиэтиленQ гликоль 6000 («Koch-Light», Англия) — 7- Н-НА гидрохлорид (удельная радиоактивность 5 Ки/мМ) фирмы «Amersham Англия.

3.2. Получение конъюгированных антигенов.

Синтез конъюгата ГУ-НА.

К раствору, содержащему 200 мг ГУ в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2, добавляли 100 мг НА. К полученной смеси приливали по каплям в течение 30 минут при постоянном перемешивании 2 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида. Реакцию проводили при комнатной температуре. Через 30 минут добавляли 0,2 мл 0,2 М раствора глутарового альдегида и перемешивали в течение 3-х часов. По истечении этого времени в смесь вносили 0,3 мл 1%-ного раствора боргидрида натрия в фосфатном буфере рН 7,2 и повторно инкубировали I час при комнатной температуре. После этого раствор диализовали против дистиллированной воды в течение 3-х суток. Полученный конъюгат подвергали лиофильной сушке.

Синтез коныогата БТ-НА.

НА (100 мг) и БТ (400 мг) растворяли в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2. К этому раствору прибавляли при перемешивании по каплям 2 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида в течение 30 минут. По прошествии 30 минут инкубации добавляли 0,2 мл 0,2 М раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивали в течение 3-х часов, затем к ней приливали 0,2 мл 1%-ного раствора боргидрида натрия в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 и выдерживали при комнатной температуре I час. После этого раствор подвергали диализу против дистиллированной воды в течение 3-х суток и высушивали конъюгат под вакуумом.

Синтез конъюгата БСА-НА.

В 4 мл фосфатного буфера (0,05 М, рН 7,2) растворяли 80 мг БСА и 60 мг НА. К этому раствору прибавляли по каплям в течение 30 минут 1,5 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида. По прошествии еще 30 минут добавляли 0,15 мл 0,2 М раствора глутарового альдегида и полученную смесь выдерживали в течение 3-х часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После этого к ней приливали 0,12 мл 1%-ного раствора боргидрида натрия, перемешивали I час и диализовали в течение 3-х суток против дистиллированной воды. Полученный продукт лиофильно высушивали.

3.3. Определение молярного соотношения НАбелок в конъюгатах.

Спектрофотометрический метод.

Спектральные измерения проводили на отечественном спектрофотометре СФ-26 в кварцевых кюветах с толщиной слоя анализируемого раствора I см.

Концентрацию белка в конъюгатах определяли по методу Лоури в модификации Hartгее (1972), используя в качестве стандартов для построения калибровочных кривых исходные нативные белки.

Содержание НА оценивали фотометрическим методом Doty (1948) с использованием реагента, содержащего сернокислое железо, и бикарбонатного буфера рН 9,6.

Конъюгат (15 мг) растворяли в 10 мл дистиллированной воды и определяли концентрацию белка в этом растворе. Затем последний разбавляли таким образом, чтобы концентрация конъюгата по белку была I мг/мл. К 3 мл этого раствора прибавляли 0,1 мл реагента, содержащего сернокислое железо, и 0,3 мл бикарбонатного буфера рН 9,6. Смесь перемешивали и по истечение 10 минут проводили спектральные измерения величины поглощения при 530 нм. Определив количество НА, приходящееся на I мг белка, в анализируемом конъюгате расчитывали молярное соотношение НА/носитель с учетом молекулярных масс НА и белка.

Радиоактивный метод.

К раствору, содержащему 0,1 мкМ белка-носителя в 2 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2, добавляли 5 мкл %-НА (I нМ) и 3,6 мг (10 мкМ) битартрата НА. К этому раствору при перемешивании прибавляли 0,5 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида. Через 30 минут приливали 0,1 мл 0,2 М раствора глутарового альдегида. Реакционную смесь перемешивали в течение 3-х часов при комнатной температуре. По окончании инкубационного периода в смесь вносили 0,05 мл 1%-ного раствора боргидрида натрия. Условия протекания реакции были аналогичными условиям, описанным при получении конъюгатов на основе НА. После диализа отбирали по 0,3 мл раствора полученного соединения в сцинтилляционные флаконы, содержащие по 10 мл сцинтилляционного раствора Брея (Bray, 1960). Радиоактивность измеряли в жидкостном сцинтил-ляционном спектрометре Mark 2 (США) с эффективностью счета по тритию около 29%. На основании полученных данных рассчитывали молярное соотношение НА — белок путем подсчета количества связанного Н-НА, приходящегося на макромолекулу белка, с учетом коэффициента, отражающего долю радиоактивного НА от общего количества НА, добавленного в реакционную смесь.

3.4. Иммунизация животных.

Работа выполнена на 36 кроликах породы Шиншилла массой 2−3 кг обоего пола, содержавшихся на стандартной лабораторной диете. В качестве антигена использовали смесь равных объемов раствора конъюгата (I мг/мл) и адъюванта Фрейнда. Первую инъекцию 0,1 мл смеси с полным адъювантом Фрейнда осуществляли в подколенный лимфатический узел. Через 3 недели вводили 0,5 мл этой эмульсии внутрикожно во множество точек в область шеи и через 2 недели I мл внутримышечно в бедренную мышцу. Последующую инъекцию (I мл смеси с неполным адъювантом Фрейнда) проводили через 2 недели также внутримышечно. По прошествии 7 дней осуществляли пробный забор крови. После окончания основного цикла иммунизации проводили курс поддерживающей иммунизации.(0,5 мл смеси с неполным адъювантом внутрикожно с месячным интервалом).

После каждого введения антигена через 7 дней брали кровь. Сыворотки инактивировали в течение 30 минут при 5б°С и исследовали методами иммунодиффузии и в РПГА.

3.5. Методы идентификации антител.

Наличие антител к НА в кроличьих сыворотках определяли методом встречной двухмерной диффузии в агаре (Nowotny, 1979), используя 0,03%-ные водные растворы конъюгатов.

Пулированные сыворотки исследовали в РПГА с применением эритроцитов барана, нагруженных конъюгатом КСА-НА. Этот конъюгат получали по методике сходной с методикой синтеза конъюгата БСА-НА. Сенсибилизацию эритроцитов этим соединением осуществляли следующим образом. К 10 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов в фосфатном буфере рН 7,2 приливали 10 мл раствора конъюгата (I мг/мл). Полученную смесь оставляли на I час при комнатной температуре, а затем центрифугировали. Собранные таким образом эритроциты отмывали несколькими объемами забуференного физраствора рН 7,2 с разведенной в нем в соотношении 250:1, нормальной кроличьей сывороткой, предварительно прогретой в течение 30 минут при 5б°С. Перед постановкой РПГА исследуемые сыворотки истощали формалинизированными эритроцитами, для чего к I мл сыворотки прибавляли 0,2 мл 2%-ной взвеси эритроцитов. Смесь инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Эритроциты удаляли центрифугированием, а сыворотки использовали в РПГА. РПГА проводили на серологических пластинах. В лунки вносили по 100 мкл 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных конъюгатом эритроцитов. Предварительно готовили серию двухкратных разведений исследуемых антисывороток, начиная с 1:50. В каждую лунку добавляли 200 мкл разведенной соответствующим образом сыворотки. Параллельно проводили контрольные опыты с использованием эритроцитов, несодержащих конъюгат и нагруженных только КСА. Пластины инкубировали при комнатной температуре в течение 4-х часов. После чего реакцию оценивали визуально по характеру осадка эритроцитов в лунках. За титр антител принимали максимальное разведение антисыворотки, которое вызывало видимую агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных конъюгатом КСА-НА.

Для оценки изменения связывающей способности сыворотки по отношению к НА в процессе иммунизации использовали меченый Н-НА. В качестве связывающего агента применяли гаммаглобулиновую фракцию, выделенную из сыворотки с помощью сульфата аммония (Fowotny, 1979). К 50 мкл раствора гаммаглобулина в 0,1 мл 0,1 М трис буфера рН 7,5, содержащего I мг этого белка, добавляли 3,4 нг г.

Н-НА и инкубировали при 4 °C в течение 3-х часов. Реакционную смесь разделяли на колонке с сефадексом G-25 при следующих условиях: размеры колонки 1,8×60 см, скорость протекания элюента (0,1 М трис буфер рН 7,5) — 0,5 мл/мин, объем собираемых фракций — I мл. Каждую фракцию смешивали с Ю мл сцинтилляционного раствора Брея и измеряли радиоактивность в жидкостном сцинтил-ляционном спектрометре по количеству распадов в минуту. В качестве контроля использовали гаммаглобулин, выделенный из сыворотки интактного кролика.

Кривые разведения связывающего агента строили путем инкубации фиксированного количества.

— НА с различными количествами связывающего агента. Предварительно готовили двухкратные разведения антисыворотки. К 0,1 мл разбавленной соответствующим образом антисыворотки добавляли 0,34 нг %-НА, содержащегося в 0,1 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 7,4, и 0,3 мл 0,5^-ного раствора БСА в 0,2 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,9% хлористого натрия и 0,05% нормального кроличьего гаммаглобулина. Полученную смесь инкубировали в течение 12 часов при 4 °C. Связанный %-НА осаждали добавлением 0,5 мл 30%-ного раствора поли-этиленгликоля и перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре. Осадок отделяли центрифугированием. 0,2 мл надоса-дочной жидкости смешивали с 10 мл раствора Брея и просчитывали на сцинтилляционном счетчике. Контролем в исследованиях служил раствор, содержащий 0,34 нг %-НА в 0,4 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 7,4. Связанный %-НА выражали в % по отношению к контролю.

3.6. Методы определения специфичности и сродства антител.

Перекрестную реактивность определяли радиометрическим методом (Чард., 1981; Grota, Brown, 1976). Для этого к пробам, содержащим %-НА и антисыворотку, добавляли различные количества немеченных, родственных НА, катехоламинов (от 10 до 100 000 пг/мл). В качестве последних применяли А, ДА, НМН и Д0ФА. К 0,1 мл антисыворотки приливали 0,25 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 7,4 и 0,05 мл раствора, содержащего определенное количество родственного соединения. Смесь инкубировали в течение 2-х часов при 4 °C. Затем вносили в неё 3,4 нг %-НА, растворенного в 0,1 мл фосфатного буфера рН 7,4 и выдерживали 12 часов при Связанный %-НА отделяли с помощью полиэтиленгликоля, для чего к инкубационной смеси добавляли 0,5 мл 30%-ного раствора полиэтиленгликоля и интенсивно встряхивали в течение .15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования надосадочную жидкость в количестве 0,2 мл смешивали с Ю мл раствора Брея и измеряли радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. По результатам измерений.

— 36 рассчитывали подавление связывания %-НА адренергическим соединением. При 50%-ном подавлении связывания %-НА определяли перекрестную реактивность связывающего агента, которую рассчитывали следующим образом: перекрестная реактивность (%) = — * 100- В о где: А — количество НА (пг) подавляющее на 50% связывание Н-НА;

В — количество родственного НА соединения (пг), подавляющее на 50% связывание %-НА.

Для количественной оценки взаимодействия антител с НА были использованы значения констант сродства, которые рассчитывали, используя графический метод Скэтчарда (Scatchard, 1949). 1.

В пробы, содержащие 0,1 мл антисыворотки и 0,4 мл раствора на-тивного НА (от 10 до 1000 пг/мл) в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,4, вносили по 0,3 нг %-НА. Смесь инкубировали в течение 12 часов при 4 °C. Затем к пробам приливали по 0,5 мл 30%-ного раствора полиэтиленгликоля. Перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин 40 минут. Отбирали по 0,5 мл супернатанта в сцинтилляци-онные флаконы, содержащие 10 мл раствора Брея, и измеряли радиоактивность. На основании экспериментальных данных вычисляли константы ассоциации, применяя координаты Скэтчарда.

3.7. Метод выделения антител.

Выделение антител проводили с помощью аффинной хроматографии. Иммуносорбент приготавливали на основе бромциан сефарозы 4 В, используя в качестве антигена конъюгат КСА-НА по методике Cuatrecasas, Anfinsen (1971). К суспензии иммуносорбента в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 добавляли антисыворотку в соотношении 1/10 и инкубировали при 37 °C в течение I часа при постоянном перемешивании. Затем сорбент промывали фосфатным буфером до исчезновения в отмывочных пробах положительной реакции на белок. Элюирование антител осуществляли ЗМ раствором роданистого натрия. Элгаат, содержащий антитела, диализовали против 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 0,85% хлористого натрия.

3.8. Метод определения валентности антител.

Синтез спин-меченого НА.

К раствору, содержащему 180 мг битартрата НА в 2 мл сухого диметилформамида, при 0 °C приливали 0,2 мл свежеперегнанного триэтиламина, перемешивали и выдерживали I час на холоду. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 10 000 об/мин и 4 °C в течение 5 минут. К надосадочной жидкости прибавляли 170 мг 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксила, растворенного в 2 мл диметилформамида, и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 3-х часов при 4 °C. Спиновую метку, применяемую в этой реакции, синтезировали по известной методике (Розанцев, 1970). Затем к смеси добавляли 10 мг боргидрида натрия и повторно инкубировали I час при комнатной температуре. Осадок, полученный путем осаждения диэтиловым эфиром, высушивали под вакуумом. Выделение спин-меченого НА проводили методом гельфиль-трации на сефадекс G-I0. Для этого 30 мг вещества растворяли в I мл 0,02 М фосфатного буфера рН 7,4 с добавлением 0,15 М хлористого натрия и фракционировали при следующих условиях: размеры колонки 0,8×70 см, скорость протекания элюента — 4 мл в час, объем фракции 0,5 мл. Контроль осуществляли методами УФ-спектрофотометрии при 280 нм и спектрометрии ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали на отечественном спектрометре РЭ-1306. Эталоном при измерении спектров спин-меченого НА служил Мп. Интенсивность сигнала выражали в относительных единицах, как отношение амплитуды Hq компоненты спектра меченого соединения к интенсивности спектра эталона.

Определение количества центров связывания антител методом титрования'.

В экспериментах использовали чистые препараты антител к НА и гаммаглобулиновую фракцию сывороток интактных животных. Содержание гаммаглобулина в растворах определяли методом адсорбции амидочерного 10 В (Фримель, 1979). Титрование связывающих участков антител производили по методике предложенной Hsia et al. (1973) для системы 2,4-динитробензол-антитела. Методика, по которой титрование осуществляли спин-меченым НА, заключалась в следующем: в пробы, содержащие по 4 мг гаммаглобулина в 0,2 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 7,4, добавляли возрастающие количества спин-меченого НА (в диапазоне от 4* 10″ «% до 2*10−4М) в 0,3 мл фосфатного буфера, содержащего 0,15 М хлористого натрия. Пробы интенсивно встряхивали и инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре. Затем отбирали аликвоты объемом 20 мкл, помещали их в кварцевые капилляры и регистрировали спектры ЭПР.

3.9. Модель изолированного сердца крысы, перфузируемого по Лангендорфу.

В экспериментах использовали крыс-самцов популяции Вистар весом 200−250 г. Животным вводили внутрибрюшинно гепарин (X мг/100 г веса) и тиопентал натрия (0,2 иг/г веса). У крыс, находящихся под наркозом, вскрывали грудную клетку, извлекали сердца и помещали их на несколько минут в охлажденную до 4 °C среду для перфузии. После этого серцца перфузировали через аорту модифицированным раствором Кребса-Хензеляйта рН 7,4−7,5 при 37 °C и постоянном перфузионном давлении равном 80 см водного столба. Перфузию сердец проводили по схеме: 20 минут — отмывка сердец от крови, 20 минут — контрольная перфузия, 60 минут — перфузия сердец в опыте. Перфузат собирали в течение каждых 20 минут эксперимента и определяли скорость коронаротока.

ЗЛО. Определение каталитической активности ЛДГ.

Ферментативную активность ЛДГ определяли с помощью кинетического метода (Wroblewski, LaDue, 1955). Измерения проводили на анализаторе скорости реакции LKB 8600 (Швеция) при 340 нм и температуре 37 °C. Для определения брали 0,1 мл перфузата. Активность рассчитывали по формуле:

А = 1929 дБ — где: А — активность ЛДГ в мЕ/мл;

1929 — коэффициент пересчетадБ — изменение оптической плотности среды за минуту.

Перед оценкой активности фермента в перфузате измеряли активность ЛДГ в контрольной сыворотке, пределы расхождения эн-зиматической активности в которой не превышали + Ъ% от средних арифметических величин образцов этого пула. Расчет кинетических кривых осуществляли с помощью компьютера HP-98I5 А (США) по стандартным программам фирмы.

Скорость выхода ЛДГ в перфузат (V") определяли по формуле:

V = Llo .

20 где: А — активность фермента в мЕ/мл;

0 — объем оттекающего от сердца перфузата за 20 минут опыта.

Результаты исследований были подвергнуты статистической обработке. При этом определяли отношение соответствующего параметра, полученного при перфузии опытных групп сердец, к среднему значению, рассчитанному для сердец контрольной группы. Полученные значения выражали в %, Величину стандартной ошибки среднего вычисляли с использованием статистической программы на компьютере HP 9815 А. Достоверность различий значений, полученных в опыте и контроле, оценивали по «разностному методу» (t — тест) и считали достоверными при Р< 0,05, что считается общепринятым критерием в биологической статистике (Каминский, 1964; Бессмертный, 1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

1. Путем ковалентного связывания норадреналина с такими белками, как гемоцианин улитки, бычий тиреоглобулин и бычий сывороточный альбумин получены коныогаты, содержащие различное количество этого катехоламина. Гаммаглобулиновая фракция сывороток кроликов, иммунизированных этими конъюгатами, приобретает способность взаимодействовать с норадреналином. Выделенные из антисывороток с помощью аффинной хроматографии антитела обладают по отношению к норадреналину бивалентной структурой.

2. На основании измеренных констант ассоциации (Касс) показано, что антитела связывают норадреналин с высоким сродством о g т.

Касс = 4,21'10 — 1,12*10 М"), которое зависит от вида конъю-гированного антигена и длительности иммунизации. Антитела, полученные к конъюгату гемоцианин-норадреналин при продолжительности иммунизации 10 месяцев, обладают наибольшим сродством.

3. Количество антител к норадреналину в сыворотках иммунизированных кроликов зависит от молярного соотношения норадреналин/носитель в антигене. Максимальный их уровень наблюдается при иммунизации конъюгатом бычий альбумин-норадреналин, содержащим наибольшее количество норадреналина.

4. На основании данных по подавлению связывания антисыворотками %-норадреналина в присутствии нативных катехоламинов установлено, что полученные антитела обладают высокой специфичностью к норадреналину и не дают перекрестной реакции с дофамином, ДОФА и норметанефрином. Наблюдается 15%-ный перекрест при взаимодействии антител с адреналином. Специфичность индуцируемых антител не зависит от вида конъюгированного антигена.

5. На модели изолированного сердца крысы, перфузированного по Лангендорфу, показано, что повреждающее действие на миокард норадреналина, оцениваемое по выходу из миоцитов лактатде-гидрогеназы, полностью ингибируется путем введения в перфузат полученных антител. Обнаруженный эффект антител специфичен по отношению к норадреналину, что доказывается их неспособностью предотвращать повреждающее действие адреналина на изолированное сердце крысы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Целый ряд патологических состояний сопровождается стрессовыми ситуациями, одним из характерных проявлений которых является гиперкатехоламинемия. Вместе с тем, известно, что высокие концентрации катехоламинов могут приводить к повреждению миокарда, вплоть до развития в нем диссеминированных очагов некроза (Меерсон, Гомазков, 1971; Копа et al., 1975). Поэтому профилактика и защита сердечной мышцы от катехоламинового повреждения является одной из важнейших проблем современной кардиологии.

В настоящее время проводится интенсивный поиск различных лекарственных средств, действие которых направлено на уменьшение токсического влияния катехоламинов на миокард (^-блока-торы, антиоксиданты, антагонисты кальция и др.). Однако, лечебный эффект применяемой терапии не всегда оказывается достаточно высоким, вероятно, в связи с отсутствием их непосредственного взаимодействия с катехоламинами.

Таким образом, поиск и подбор соединений, обладающих специфическим ингибирующим действием по отношению к индивидуальным катехоламинам, является чрезвычайно актуальной проблемой.

В настоящее время в качестве антагонистов биологически активных веществ с большим успехом применяют антитела (Dzau et al., 1980; НаЪег, 1982; Butler, 1982), чем и было положено начало использованию новых типов фармакологических средств. Вместе с тем, применение этих специфических антагонистов требует решения проблемы индукции антител к ряду низкомолекулярных биологически активных соединений.

Начиная с 1970;х годов предпринимаются попытки получения антител К катехоламинам (Spector, 1972; Grota, Brown ,.

1976; Miwa et al., 1976; Diener et al., 1981; Полевая и соавт., 1981; Geffard et al., 1984a, 1984ъ). Однако, специфические антитела к основным катехоламинам, и в частности к НА, до сих пор получены не были. Отсутствуют также данные относительно влияния антител к катехоламинам на физиологическую активность этих биогенных аминов. Проблема получения антител к катехоламинам связана с разрешением целого ряда задач: разработки методов конъюгации гаптенов с антигенными носителями, способов иммунизации, выделения антител, оценки их специфичности и т. д. Решение этих вопросов является вкладом в разработку биотехнологических проблем.

В своей работе мы попытались изучить возможность снятия повреждающего действия на миокард НА — одного из основных компонентов симпато-адреналовой системы, с помощью антител к этому кат ехо л амину.

В результате проведенных исследований был разработан ряд методов и приемов, позволяющих получить антитела, взаимодействующие с НА. Так оказалось-, что при иммунизации животных конъю-гированными антигенами в сыворотках образуется связывающий по отношению к НА компонент. В качестве таких антигенов нами были использованы продукты конденсации НА с такими белками, как ГУ, ВТ и БСА. Зная, что эти белковые носители обладают разной анти-генностью, заранее предполагалось, что их введение в состав конъюгированного антигена позволит выбрать наиболее оптимальный вариант при индукции с их помощью антител. Спектрофотометричес-ким и радиометрическим методами было показано, что наибольшее количество НА содержит конъюгат БСА-НА и несколько меньшееГУ-НА и БТ-НА.

Принадлежность связывающего НА сывороточного фактора к классу гаммаглобулинов подтвердила иммунологическую природу индуцируемых этими антигенами антител. Влияние различных носителей, входящих в состав конъюгированных антигенов, сказывалось на такие характеристики антител, как титры и сродство. При этом максимальные титры антител наблюдались в сыворотках животных, иммунизированных конъюгатом БСА-НА и значительно меньшие в случае иммунизации ГУ-НА и БТ-НА. Эти различия в результатах, вероятно, можно объяснить существенным влиянием содержания НА в конъюгированном антигене на количество индуцируемых к НА антител.

Заключив, что наибольшее количество антител к НА вырабатывается в ответ на введение животным конъюгата БСА-НА, необходимым звеном в изучении иммунохимических свойств этих связывающих агентов явилось определение их специфичности и сродства. С этой целью был исследован процесс связывания антисыворотками меченого %-НА. Оказалось, что антитела, полученные к конъюгату.

ГУ-НА, обладали наибольшим сродством к НА, и значение Касс, ха.

9 I рактеризующей это сродство, было порядка 10 М. В то же время антитела, образовавшиеся в ответ на введение БСА-НА, связывали НА с меньшим сродством. Значение Касс при этом было примерно в 3 раза меньше, чем для антител, полученных к конъюгату ГУ-НА.

Для определения специфичности связывания нами были применены такие ближайшие по структуре к НА катехоламины как А, ДОФА, ДА и НМН. Было показано, что эти катехоламины по разному подавляют связывание Н-НА антителами. При этом уже небольшие колио чества НА (до 10 пг/мл) вызывали существенное понижение связывания %-НА. В то же время, для достижения такого эффекта требуются намного большие количества таких соединений, как А, ДОФА,.

ДА и НМН. Полученные этим методом данные позволили установить высокую степень специфичности антител к НА. Оказалось, что антисыворотки, полученные ко всем конъгагатам, содержали антитела, характеризующиеся примерно одинаковой специфичностью. Ни вид носителя, входящего в состав конъюгата, ни концентрация НА в этих антигенах не влияли существенным образом на эту характеристику антител. Так, во всех антисыворотках отмечалась высокая специфичность антител к НА при их взаимодействии с ДА, НМН (< 0,1%) и ДОФА (2,7−3,4%). Что же касается А, то для подавления связывания %-НА на 50%, его требовалось приблизительно в 7 раз больше, чем НА, и перекрестная реакция, А с антителами к НА оказалась более выраженной (14,1−16,8%). Это говорит о том, что антитела, независимо от вида входящего в состав конъюгата носителя и содержания НА в антигене, способны узнавать структурные изменения в молекуле катехоламина, как в ароматической её части, так и в непосредственной близости от неё. Наряду с этим, антитела не обладали высокой специфичностью для заместителей при аминогруппе и olуглеродном атоме алифатической части молекулы катехоламина.

Необходимым этапом в исследовании природы связывающего компонента сыворотки являлось определение количества мест связывания НА, приходящееся на макромолекулу гаммаглобулина. Эта количественная характеристика была получена с помощью ЭПР и использования парамагнитной модели НА. Впервые нами был синтезирован препарат спин-меченого НА, обладающий высокими парамагнитными свойствами. По результатам исследований, в которых связывающие места антител титровали спин-меченым НА, было установлено, что одна макромолекула гаммаглобулина способна связать примерно две молекулы НА. Полученные данные позволили нам прийти к заключению, что индуцируемые конъюгатами антитела бивалентны по отношению к НА.

Суммируя приведенные в данном разделе результаты исследований, можно сделать вывод, что использование в качестве конъюгированных антигенов ГУ-НА, БТ-НА и БСА-НА при иммунизации кроликов способствует образованию антител, взаимодействующих с НА. При этом вид конъюгированного антигена и количество НА, содержащегося в нем, оказывают существенное влияние на титры и сродство антител к НА и практически не влияют на специфичность этого связывающего компонента сыворотки. Вместе с тем, установлена принадлежность этого связывающего сывороточного фактора к классу гаммаглобулинов и определен его бивалентный характер связывания по отношению к НА.

Считается доказанным, что катехоламины являются физиологическими регуляторами метаболизма сердечной мышцы, а чрезмерное повышение концентрации этих биогенных аминов вызывает кар-диотоксический эффект, независимо от того, введен ли катехола-мин извне или имеет место избыточная продукция эндогенных катехоламинов. Вследствие токсического действия катехоламинов наблюдаются некротические изменения в миоцитах, сходные с изменениями в миокарде, происходящими при ишемическом повреждении.

В связи с этим, несомненный интерес вызывает исследование возможности предотвращения повреждающего действия НА с помощью антител к этому катехоламину. Полученные экспериментальные данные продемонстрировали, что антитела полностью подавляют кардиотоксическое действие на миокард НА, оцениваемое по потере миокардиальными клетками одного из внутриклеточных ферментов — ЛДГ. Защитный эффект антител к НА, вероятно, обусловлен их возможностью связывать избыток НА, находящийся в растворе, пер-фузирующем коронарное русло сердца крысы.

В иммунохимических реакциях было показано, что антитела к НА обладают высокой специфичностью. Поэтому заслуживает особого внимания тот факт, что при введении антител, полученных к НА, в перфузируемый раствор Кребса-Хензеляйта, содержащий кар-диотоксическую дозу другого катехоламина — А, и последующей перфузии сердец этой смесью полностью сохраняется токсическое действие А, оказываемое на сердечную мышцу. Это является доказательством специфического характера подобного способа нейтрализации кардиотоксического эффекта НА.

Таким образом, полученные данные, позволили нам прийти к выводу, что антитела к НА полностью и специфически предотвращают повреждающее действие этого катехоламина на миокард.

В настоящей работе мы коснулись лишь определенной части проблемы получения и применения антител к таким важным соединениям, как катехоламины. Однако, полученные в результате проведенных нами экспериментов данные открывают перспективу для дальнейших исследований. Среди них — выяснение роли катехоламинов в патогенезе целого ряда заболеваний и патологических состояний, использование антител в качестве защитных соединений от гиперкатехоламинемии, применение их для радиоиммунологического тестирования НА и других катехоламинов.