Кинетическая теория подвижности и хемотаксиса бактерий и ее практические приложения

Актуальность проблемы.

Тема диссертации связана с исследованием роли хемотаксиса в жизнедеятельности отдельных бактерий и их сообществ. Поэтому построение модели движения клеток при хемотаксисе, как и всестороннее экспериментальное изучение этого явления, могут найти широкое применение в различных областях микробиологии, экологии и медицинской практике. Это видно из перечня областей, где хемотаксис бактерий играет существенную роль:

• экология и мониторинг окружающей среды;

• сельскохозяйственное применение бактериальных удобрений;

• биоремедиация (утилизация бактериями промышленных отходов);

• приспособление, выживаемость и миграция бактериальных популяций в естественных условиях;

• связь патогенности бактерий и хемосенсорной системы;

• образование и развитие биологических пленок;

• способы распространения и передачи инфекции;

• симбиотические отношения с микроорганизмами, минеральными, растительными и животными формами;

• биосенсоры на основе хемотаксиса бактерий.

Исследованию различных аспектов хемотаксиса бактерий уделяют большое внимание во многих лабораториях мира. В российской науке это внимание явно недостаточно. В литературе появляются различные математические описания хемотаксиса микроорганизмов, но они носят разрозненный и частный характер, используются применительно к тем или иным характерным проявлениям в условиях конкретных задач исследования. Основными лабораторными способами наблюдения остаются качественные регистрация формы колоний на полужидких средах в чашках Петри и микроскопические наблюдения, а также полуколичественный способ Адлера, оперирующий с общим количеством клеток, зашедших в капилляр с веществом за определенное время. Наблюдается существенный пробел в анализе и сравнении различных способов изучения и выявлении характерных физических параметров хемотаксиса, количественных способах регистрации, которые могли бы найти применение в лабораторной практике.

Поскольку хемотаксис бактерий имеет широкое распространение в самых различных сферах жизни, включая взаимодействие бактерий с высшими организмами, представляется актуальным проведение более полного и всестороннего анализа явления в целом. Подобного целостного описания явления мы попытались придерживаться в нашей работе, основываясь на подходе к подвижности и хемотаксису бактерий в рамках обобщенной модели, объединяющей характеристики движения отдельных клеток с движением популяции в целом. Для построения, проверки и уточнения теории использовали данные, полученные другими исследователями, так и данные собственных модельных экспериментов.

Цель исследования.

Описание движения и хемотаксиса бактерий в рамках единой кинетической теории и проведение серии модельных экспериментов для корректировки входящих в модель параметров. Построение теории подвижности и хемотаксиса бактерий в жидких и пористых средах и на границе гетеротрофных сред. Исследование хемотаксиса разнообразными физико-химическими методами в режиме реального времени, в том числе в интерактивном режиме с использованием компьютерной обработки данных.

Задачи исследования.

1. Построение теории хемотаксисного взаимодействия обладающих подвижностью и хемотаксисом бактериальных популяций с корнями сельскохозяйственных культур с целью биогенного управления почвенным плодородием.

2. Построение математической модели движения единичных подвижных и обладающих хемотаксисом бактерий.

3. Создание математической модели движения популяций хемотаксических бактерий, учитывающей закономерности движения отдельных клеток, в рамках единого интегро-дифференциального кинетического подхода.

4. Выявление в рамках предложенной модели связи между макропараметрами движения популяции и микропараметрами движения отдельной клетки.

5. Всесторонний анализ математической модели с подсчетом многофакторных эффектов хемотаксиса: эффекта быстрой ориентации клеток и связанного с ним оптического эффекта при хемотаксисе, гетерогенного расслоения популяции на границе раздела гетеротрофных сред, особенностей миграции популяций в пористых средах.

6. Анализ влияния вязкости и температуры среды на подвижность и хемотаксис бактерий, построение модели движения бактерий в условиях переменной вязкости окружающей среды.

7. Выделение из рабочей коллекции ГНЦ ПМ перспективных с точки зрения практического применения бактерий для проведения модельных экспериментов, изучение их подвижности и хемотаксиса различными методами.

8. Проведение серии модельных экспериментов для проверки и уточнения теории.

9. Конструирование лазерной установки для слежения за миграцией бактериальных полос и измерение с ее помощью характеристик движения клеток при хемотаксисе.

10. Создание и отработка денситометрической методики исследования хемотаксиса с интерактивной компьютерной обработкой экспериментальных данных.

11. Построение подхода изучения хемотаксиса бактерий на колонках с пористым материалом.

12. Разработка методики изучения хемотаксиса бактерий в гелевых средах.

13. Создание экспериментальных методик по разделению различающихся по хемотаксису бактерий разных штаммов и методики отбора штаммов по хемотаксическим признакам.

14. Изучение связи подвижности и хемотаксиса бактерий с другими системами жизнедеятельности бактериальной клетки.

15. Изучение влияния на хемотаксис бактерий бактериофагов.

Научная новизна.

На основании данных о микроскопическом движении бактериальных клеток построена кинетическая теория подвижности и хемотаксиса бактерий.

Предложен новый метод исследования подвижности и хемотаксиса бактерий — кинетический, отличающийся от других существующих тем, что объединяет в себе как микро, так и макроскопический подход к движению. Метод позволяет решать одновременно две задачи: 1) исходя из микропараметров движения одной клетки, прогнозировать движение целой популяции в изменяющихся условиях окружающей среды- 2) исходя из пространственного распределения клеток, выявлять характеристики отдельно взятой клетки. Это становится возможным из кинетического уравнения, соединяющего различные характеристики движения клетки и параметры хемотаксической реакции.

Детально проанализированы все входящие в модель параметры и выявлена их связь с хемотаксической реакцией клетки, проявляющейся в специфическом связывании рецептора с субстратом или неспецифической реакции хемотаксиса.

Впервые объяснен эффект образования и миграции бактериальных полос в средах с переменным химическим составом на основе кинетического уравнения и показано, почему этого нельзя сделать в рамках традиционного диффузионного подхода. Вместе с тем, на примере неспецифического (не рецепторного) хемотаксисного взаимодействия субстрат-хемоэффектор показано, что волновой подход к описанию хемотаксиса может быть использован для интерпретации экспериментальных данных, процессов формирования и миграции бактериальных полос при неспецифическом взаимодействии.

Теоретически предсказан и экспериментально измерен оптический эффект, связанный с ориентацией бактериальных клеток при хемотаксисе.

Теоретически предсказана и экспериментально продемонстрирована возможность полного разделения различающихся по хемотаксису бактерий.

На основании модели жгутикового мотора впервые объяснен эффект влияния вязкости среды на подвижность и хемотаксис бактерий.

Теоретическая и практическая значимость.

Адекватное описание движения бактерий при хемотаксисе позволяет предсказывать поведение как одной клетки, так и серии конкурирующих между собой популяций в условиях изменяющейся окружающей среды, а также по внешним признакам распределения клеток в пространстве выявлять физиологические характеристики отдельно взятой клетки.

Сконструирована электромеханическая камера для управления разделением различающихся по хемотаксису штаммов микроорганизмов в пространственных градиентах концентрации химических веществ.

Разработан экспресс-способ количественного измерения реакции хемотаксиса по изменению оптической плотности суспензии клеток после химического воздействия, вызванного ориентацией бактериальных клеток при хемотаксисе (выдано свидетельство об изобретении).

Разработан метод количественного определения концентрации антибиотиков с использованием хемотаксиса бактерий. Тест-система с использованием хемотаксиса бактерий успешно прошла испытания на Бердском химическом заводе в условиях промышленного производства (выдано свидетельство об изобретении).

Разработана методика изучения «быстрого» хемотаксиса бактерий в пористых и приграничных средах, продемонстрирована возможность полного разделения различающихся по хемотаксису штаммов на колонках с пористым материалом.

Разработан денситометрический способ изучения и анализа хемотаксиса бактерий в жидких и гелевых средах с компьютерной обработкой экспериментальных данных.

Обнаружена корреляция подвижности и хемотаксиса бактерий с их энтомопатогенной активностью.

Предложен способ изучения мигрирующей эритемы при болезни Лайма in vitro с использованием хемотаксиса мигрирующих спирохет.

Продемонстрировано изменение хемотаксиса бактерий Campilobacter jejuni при действии связывающегося с флагеллами бактериофага PV22.

Предложен денситометрический способ изучения гетерогенных популяций бактерий, способствующих трещинообразованию дорожных покрытий, на основе хемотаксического разделения клеток в пространственных химических градиентах.

Разработан способ создания биосенсора на основе хемотаксиса бактерий.

Предложена модель синхронизации бактериального удобрения с ризосферой культивируемых сельскохозяйственных растений.

Разработана методика определения с помощью реакции хемотаксиса присутствия в среде следовых концентраций биологически активных химических веществ.

Предложен способ быстрого количественного определения концентрации антибиотиков с использованием в качестве тест-системы хемотаксиса бактерий.

Разработана методика разделения бактерий, различающихся по хемотаксической активности. С помощью этой методики выявлена корреляционная связь между хемотаксической подвижностью и энтомопатогенной активностью клеток Bacillus thuringiensis.

Теория подвижности и хемотаксиса бактерий в приграничных и пористых средах, позволяет описывать процессы распространения бактерий в почвах, утилизации бактериями промышленных отходов (в частности, нефтяных пленок и полициклических ароматических углеводородов), моделировать существование и развитие микробных сообществ в конкретных условиях in vitro, in vivo и in situ.

На основе кинетического подхода разработана модель синхронизации почвенной и хемотаксисной активности бактериального удобрения «Гумовит», с помощью которой планируется осуществлять управление процессом синхронизации микрофлоры и сельскохозяйственных растений на территории Кыргызстана.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Кинетическая теория движения и хемотаксиса бактерий.

2. Модель влияния вязкости на подвижность и хемотаксис бактерий.

3. Физико-химические методы изучения хемотаксиса бактерий. Связь хемотаксиса с другими системами жизнеобеспечения клетки. Структура бактериальных полос в денситометрических исследованиях. Особенности поведения бактерий на границе сред. Тест-система обнаружения присутствия в среде следовых концентраций химически активных веществ. Экспресс-анализ окружающей среды с использованием хемотаксиса бактерий. Определение концентрации антибиотиков с использованием хемотаксиса бактерий.

Апробация работы.

Материалы диссертации многократно докладывались на региональных, всероссийских и международных конференциях и совещаниях, на биофизических и биотехнологических съездах. Диссертация апробирована на заседании ученого совета ФГУП «Государственный научный центр прикладной микробиологии» и заседании ученого совета ИТЭБ РАН.

Публикации.

Основное содержание работы отражено в 75 научных публикациях, в сборниках трудов конференций, в двух авторских свидетельствах на изобретение.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из предисловия, введения, 5 глав, выводов, списка литературы и приложения. Объем диссертации 256 страниц машинописного текста, 55 рисунков и 20 таблиц.

Список литературы

включает 460 наименований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Несмотря на малые размеры (порядка 1 мкм), бактериальная клетка имеет весьма разветвленную организменную структуру. ДНК бактерии E. coli содержит 5 тысяч генов, из которых 100 ответственны за подвижность и хемотаксис. Это означает, что в строительстве клетки и ее функционировании участвуют тысячи белков, около ста из которых формируют двигательный и чувствительный к химическому окружению аппарат. Системные отношения между структурами простой бактерии столь сложны, что не поддаются самому мощному компьютерному анализу. Тем не менее, основные закономерности движения бактерий к настоящему времени изучены довольно подробно. Эти закономерности мы постарались учесть при построении кинетической теории подвижности и хемотаксиса бактерий.

Целью настоящей работы было описание движения и хемотаксиса бактерий в рамках единой кинетической теории и проведение серии модельных экспериментов для корректировки входящих в модель параметров. Построение теории подвижности и хемотаксиса бактерий в жидких и пористых средах и на границе гетеротрофных сред. Исследование хемотаксиса разнообразными физико-химическими методами в режиме реального времени, в том числе в интерактивном режиме с использованием компьютерной обработки данных.

Идеи диссертационной работы, сформулированной в виде цели и задач, выдвинуты лично автором. Кинетическая теория подвижности и хемотаксиса бактерий разработана лично автором.

Результаты раздела работы, посвященного экспериментальным исследованиям, получены автором совместно с А.Г. Волошиным1 (изучение хемотаксиса бактерий в пористых средах), Н.С. Соломиным1 (разработка специализированной камеры для исследования хемотаксиса), В.Н. Брезгуновым1 (экспресс-методика определения хемотаксиса на основе оптического эффекта, вызванного ориентацией клеток), В.Н. Шевцовым1 (связь энтомопатогенности с хемотаксической активностью), Е.Л. Жиленковым1 (влияние взаимодействия фагов на хемотаксис бактерий), A.B. Штанниковым1 (моделирование мигрирующей эритемы при болезни Лайма в гелевых средах), А.И. Марченко2 (взаимодействие бактерий с корнями растений), Р.В. Боровиком2 (биоремедиация, ризосферное взаимодействие растений и микрофлоры), С.Н. Пахтуевым3.

1 ФГУП «Государственный научный центр прикладной микробиологии.

2 Государственный научный центр токсикологии и гигиенической регламентации.

3 Центральная заводская лаборатория Бердского химического завода способ определения концентрации антибиотиков на основе хемотаксиса в заводских условиях).

Основным итогом работы стало построение такой теории, а также разработка комплекса экспериментальных физико-химических методов, позволяющих в совокупности с теорией объяснять и предсказывать ряд явлений, связанных с проявлением хемотаксиса бактерий в различных условиях.

В главе 1 обобщены данные литературы о движении отдельных бактерий и их популяций, что послужило основой развиваемой в главе 3 кинетической теории. В главе 1 подробно рассматриваются различные аспекты хемотаксиса бактерий: характеристики движения, строение и энергообеспечение бактериальных жгутиков, структура и особенности вращения флагелл, феноменология хемотаксиса бактерий, структура и молекулярная организация механизма бактериального хемотаксиса, методы математического моделирования бактериальной подвижности и хемотаксиса.

Глава 2 посвящена описанию материалов и методов. В работе мы исследовали следующие виды бактерий: E. coli, S. thyphimurium, Ps. aeruginisa, B. subtilis, B. anthracis, B. thuringiensis, Helicobacter pilori, Campilobacter jejuni, Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi и др. Все эти виды бактерий демонстрируют высокую подвижность и хемотаксис при определенных условиях. Вместе с тем, хорошо известна их роль в ряде широко распространенных инфекционных заболеваний, что делает работу по изучению их подвижности и хемотаксиса не только важной с научной точки зрения, но представляет и несомненный практический интерес для инфекционной патологии. Это объясняется тем, что хемотаксис типа «паразит-хозяин», на определенной стадии, несомненно, участвует в процессе инфицирования организма.

Как и любая другая жизненно важная функция, система хемотаксиса бактерий не существует сама по себе, независимо от других функций организма. Установлена связь системы хемотаксиса с дыхательной системой клетки, с процессами метилирования-деметилирования трансмембранных белков (МСР-белков), с фосфотрансферазной системой ФТС (ответственной за энергетические процессы, связанные с переносом фосфатной группы), с уровнем внутриклеточного рН, циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и другими системами жизнеобеспечения. Следует подчеркнуть, что основные хеморецепторы — это интегральные трансмембранные белки, выступающие с обеих сторон клеточной мембраны. Эти белки, помимо хемосенсорной, выполняют функцию переносчиков через мембрану определенных химических соединений. При контакте со стимулирующим веществом эти белки претерпевают конформационные изменения, приводящие к активации следующих звеньев переработки хемотаксического сигнала.

Многочисленными исследованиями было установлено, что нормально функционирующие белки в ходе рецепции подвергаются процессу метилирования-деметилирования, за что они и получили название метил-акцептирующих МСР-белков. Другой важный рецептор к сахарам — так называемый фермент II глюкозофосфотрансферазной системы, прочно связанный с мембраной и катализирующий фосфорилирование Сахаров фосфорилированным белком. Не исключена возможность, что и некоторые интегральные белки других систем могут каким-то образом изменять уровень того или иного переключателя флагелл. Влияние некоторых стимулов (таких, например, как концентрация внутриклеточного рН) на переключатель мотора может быть непосредственным, в обход основной системы. Многие звенья цепи управления хемотаксисом к настоящему времени изучены довольно подробно, вплоть до уровня пространственных структур и конформационных изменений участвующих в ней белков, другие только изучаются.

Все это означает, что изучение хемотаксиса бактерий интересно не только как явление само по себе, но может дать определенную информацию о состоянии и функционировании других важных систем клетки, если эта связь установлена.

При изучении хемотаксиса бактерий мы использовали разнообразные физико-химические методы, позволяющие получать информацию о механизмах функционирования хемотаксической системы бактерий на молекулярном уровне. Поскольку внешнее проявление хемотаксиса в ответ на действие раздражителя заключается в изменении структуры движения бактерий, внимание уделялось способам, с помощью которых можно регистрировать реакцию движения хемотаксичных бактерий и количественно характеризовать их хемотаксическую активность.

Глава 3 посвящена построению и анализу кинетической теории подвижности и хемотаксиса бактерий. Показано, при каких допущениях из кинетической модели может быть получено волновое уравнение, описывающее миграцию популяций бактерий в неоднородном химическом окружении. Оказалось, что для специфической рецепции, описываемой уравнением Михаэлиса-Ментен, использование диффузионного приближения основного кинетического уравнения не всегда обосновано, поскольку на границе бактерии-хемоэффектор может наблюдаться сингулярность, при которой диффузионное уравнение становится неприменимо. Найден параметр сингулярности. Однако при неспецифической рецепции использование диффузионного приближения оправдано, поскольку сингулярности не наблюдается.

На границе двух сред, содержащих бактерии и аттрактант, всегда происходит расщепление популяции, проявляющееся в образовании концентрационной полосы клеток. Дальнейшее развитие процесса зависит от того, является ли субстрат метаболитом для данного вида бактерий или не является. Привлечение кинетической модели хемотаксиса помогает лучше разобраться в сути происходящих явлений, где можно, а где недопустимо использовать диффузионное приближение, проанализировать «тонкую» структуру динамики распределения бактерий в градиенте хемоэффектора. Подобный анализ, с учетом дополнений и учета особенностей изучаемых явлений, может иметь значение при описании процессов образования и формирования биопленок, роста и гибели колоний бактериальных клеток, взаимодействия бактерий с химическими выделениями корневых растительных и эпителиальных животных тканей, изучении путей распространения инфекций. Интегральная характеристика хемотаксиса (например, количество бактерий, проникших в капилляр с аттрактантом), оперирует с общим количеством клеток в эксперименте, и поэтому имеет ограниченные возможности для более детального изучения динамики хемотаксиса бактерий на границе сред.

В данном случае привлечение математической модели, как нам представляется, хотя и не служит цели управления процессом, помогает разобраться с явлением образования и миграции бактерий к нафталину на качественном уровне.

Из кинетической модели предсказан и подсчитан эффект ориентации клеток при хемотаксисе, который может быть использован для быстрого обнаружения хемотаксиса спектрометрическими методами.

В главе 4 излагается экспериментальная часть работы. Адекватное описание движения бактерий при хемотаксисе имеет существенное значение в микробиологии и экологии микроорганизмов, поскольку позволяет анализировать и предсказывать поведение одной клетки и конкурирующих между собой популяций в условиях изменяющейся среды при взаимодействии бактерий с высшими живыми формами. В данной главе обсуждаются некоторые практические аспекты подвижности и хемотаксиса бактерий:

Влияние температуры;

Роль вязкости;

Связь хемотаксиса с другими системами бактериальной клетки;

Влияние ультрафиолетового облучения на подвижность и хемотаксис бактерий;

Корреляционная связь энтомопатогенной и хемотаксической активности штаммов Вас.

Структура бактериальных полос в денситометрических исследованиях;

Образование и скорости миграции бактериальных полос;

Распространение бактериальных фронтов в условиях метаболизируемого и неметаболизируемого субстрата;

Быстрый" хемотаксис бактерий в пористых средах;

Особенности поведения бактерий на границе сред;

Использование хемотаксиса бактерий в качестве тест-системы для определения присутствия в среде концентраций химически активных веществ;

Экспресс-анализ окружающей среды с использованием системы хемотаксиса бактерий;

Использование хемотаксиса бактерий для определения концентрации антибиотиков.

По каждому разделу в диссертации выполнены экспериментальные исследования и проведен теоретический анализ. С привлечением «роторной» модели жгутикового мотора объяснено явление существовании оптимальных значений вязкости, при которых скорость плавания бактерий достигает наивысших значений. Там, где это уместно, проведен теоретический анализ с привлечением кинетической теории подвижности хемотаксиса. Показано, что использование теории во многих случаях позволяет не только качественно трактовать результаты и планировать постановку новых экспериментов, но и извлекать из экспериментов новую ценную количественную информацию.

Коротко остановимся на практической значимости некоторых результатов этих исследований.

Известно, что загрязнение окружающей среды полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в виде промышленных выбросов предприятий химической и нефтехимической промышленности представляет собой серьезную угрозу здоровью населения и природе. Оказывается, биодеградация ПАУ микроорганизмами идет интенсивнее в ризосферной сфере растений, примыкающей к корню, чем непосредственно в почве. Сами же микроорганизмы скапливаются у корней растений благодаря хемотаксису. Мы видим, что знание законов хемотаксиса бактерий может помочь в решении важных вопросов утилизации промышленных отходов.

Особый интерес привлекает вопрос нарушения химической чувствительности бактерий под действием ряда химических веществ. Кроме упомянутых в диссертации этанола и хлороформа хемотаксис блокируют: бензол, ацетон, многие виды антибиотиков, а также различные вещества наркотического действия, анестетики, адреналин, ацетилхолин. Механизм их действия самый различный.

Скорость расщепления бактериями некоторых органических соединений также коррелирует с их хемотаксической способностью. Например, морские бактерии активно расщепляют альбумин и казеин. Однако, воздействие микроскопическими концентрациями углеводородов, толуола, фенола, отходами нефти, 2−4-дихлорфенолксиацетата, О-О-дихлорбифенила и др. сильно ингибирует это процесс. В то же самое время такие малые концентрации практически не оказывают прямого пагубного действия на жизнедеятельность микрофлоры. Основной эффект их действия, по-видимому, сводится к подавлению хеморецепторной активности.

Таким образом, разнообразные загрязнения пресноводных и морских водоемов даже в малых концентрациях могут привести к серьезным нарушениям экологического баланса. При таких малых концентрациях это в первую очередь связано с нарушениями в работе хемосенсорных систем микроорганизмов. Возникшая в связи с этим новая область изучения микробиологических сообществ в последние годы получает интенсивное развитие. Исследования в живой природе дополняются разнообразными лабораторными экспериментами.

Глава 5 посвящена проблемам и перспективам дальнейших исследований хемотаксиса бактерий, экологическим и эволюционным аспектам. Глава состоит из следующих разделов:

Взаимодействие с окружающей средой.

Внутривидовое и межвидовое взаимодействие.

Роль хемотаксиса в образовании биопленок.

Взаимодействие с растениями.

Взаимодействие с высшими животными формами.

Хемотаксис бактерий как простейшая модель межклеточного взаимодействия клеток.

Миграция микробных популяций и образование минералов.

Хемотаксис и эволюция живых форм.

Способность бактерий к самостоятельному независимому движению является ярким примером обособления особи от общества, что дает основание назвать этот самодвижущийся объект первым в истории жизни организмом. Приобретенная «самостоятельность» дала возможность клетке активно осваивать окружающее пространство, независимо от хаотического влияния внешних сил. Многие бактерии обладают химическими рецепторами, регистрирующими кислотность и химические изменения окружающей среды. Бактерии могут также реагировать на изменения температуры, освещенности, магнитного поля Земли (из-за присутствующих в некоторых клетках частичек магнетита). Про условные рефлексы бактерий говорить не приходится, но примитивная память у них есть. Рыская по пространству в поисках благоприятных условий, бактерии сравнивают новое химическое окружение с предыдущим и на основании этого сравнения вырабатывают соответствующую стратегию поведения.

Сравнительный анализ различных видов подвижных бактерий показывает, что устройство двигателя, несмотря на некоторые различия, во многом сходно, у близких видов вплоть до идентичности структурных белков и организации генетического аппарата. Это дает снование предположить, что однажды возникшие в природе «удачные» инженерные решения сохраняются и продолжают успешно существовать, несмотря на сложные и увенчанные катастрофами пути макроэволюции.

В заключение отметим, что при обсуждении кинетической теории и ее практических приложений мы старались охватить достаточно широкий круг областей микробиологии, где подвижность и хемотаксис бактерий играют существенную роль.