Изучение биомаркеров метаболизма омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот у детей и беременных женщин

Актуальность проблемы. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), принадлежащие к числу незаменимых факторов питания, служат предметом значительного внимания исследователей как в нашей стране [39, 59, 28], так и за рубежом [108, 111, 207, 208, 331, 332]. За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации многочисленных физиологических и биохимических процессов в организме в норме и при патологических состояниях. К их числу относятся: формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, поддержание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции.

Изучены многие стороны метаболических превращений ПНЖК, лежащих в основе указанных процессов. В то же время, ряд путей метаболизма жирных кислот и, особенно, взаимодействие этих путей, в значительной мере определяющее их функциональные эффекты, остаются малоизученными. Это, в частности, относится к участию ПНЖК в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты, образовании различных классов эйкозаноидов и построении и функционировании биомембран. Изучение взаимодействия этих путей представляет особый интерес с точки зрения поиска новых биомаркеров метаболизма ПНЖК у детей и беременных женщин.

Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ [7, 59, 23, 48, 63]. Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [1, 30, 39, 51, 52, 61, 103, 142, 202, 226, 150]. В связи с этим возникает вопрос о возможной роли длинноцепочечных (ДЦ) ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови. С этой точки зрения значительный интерес представляет изучение АОА и химического состава отдельных хроматографических фракций сыворотки крови, в которых возможно присутствуют ДЦ ПНЖК, а также параллельная клиникобиохимическая оценка показателей ПОЛ, АОА и жирнокислотного состава плазмы крови у беременных женщин и недоношенных детей.

Следует подчеркнуть, что роль системы ПОЛ/АОА не может рассматриваться только с позиций патогенетического механизма развития заболеваний. В ряде исследований показана тесная связь между балансом этих систем и процессами клеточной пролиферации и роста [1, 118, 308, 359, 360]. В связи с этим целесообразно проведение исследования возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.

В многочисленных работах установлены пути образования из ш-6 и со-З ПНЖК различных серий одного из видов эйкозаноидов — лейкотриенов (ЛТ) [116, 221]. Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим представляется важным провести детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особого внимания заслуживает выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.

Как было уже упомянуто, ПНЖК принимают участие в регуляции процессов воспаления в качестве субстратов ПОЛ и предшественников ЛТ, что сопровождается значительным расходом этих соединений. В то же время, ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства [332, 47]. В связи с этим представляется целесообразным изучение возможных изменений спектра жирных кислот (ЖК) КМ у детей при различных видах воспалительных заболеваний, относящихся к числу распространенной патологии детского возраста, характеризующейся тяжелым хроническим течением. При этом представляло интерес сравнить ЖК КМ крови (эритроцитов, лейкоцитов) у детей при двух видах воспаления (аллергическом и альтеративно-экссудативном).

Изучение указанных биохимических показателей (МДА, АОА, ЛТ и ЖК состав крови) представляется важным не только с позиций решения фундаментальных задач биохимии, но и с позиций проблемы расширения спектра биомаркеров как скрининговых показателей различных метаболических процессов в норме и при патологии. В связи с этим представляло интерес изучить возможность использования указанных трех групп показателей в качестве биомаркеров метаболизма ю-3 и ю-6 ПНЖК в организме детей и беременных женщин.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках тем № 051 «Обоснование оптимального белкового и липидного компонентов рационов питания для детей различных возрастных групп» и № 074 «Разработка системы диагностики, профилактики и лечения ожирения у детей раннего, дошкольного и школьного возраста».

Цель и задачи исследования

:

Цель: Изучение роли длинноцепочечных ПНЖК в формировании антиоксидантной системы и соотношения основных путей метаболизма ПНЖК: процессов ПОЛ, участия в построении клеточных мембран и образования лейкотриенов в крови детей и беременных женщин.

Задачи:

1. Изучить роль со-3 и со-6 ПНЖК в формировании антиоксидантной системы (АОС) крови у взрослых мужчин и женщин и у детей,.

2. Исследовать особенности участия со-3 и со-6 ПНЖК в формировании антиоксидантного потенциала у беременных женщин (при физиологически протекающей беременности и преэклампсии (ПЭ)) и у недоношенных детей.

3. Исследовать возрастную динамику АО, А крови у детей и экспериментальных животных и оценить возможную роль АОА крови в процессах клеточной пролиферации.

4. Провести параллельное изучение интенсивности ПОЛ, уровня АОА и образования лейкотриенов крови в норме и при патологии (бронхиальной астме, ожирении).

5. Изучить состав жирных кислот клеточных мембран в норме и при воспалительных заболеваниях органов желудочно-кишечного тракта и бронхиальной астме.

Научная новизна работы. Впервые доказана важная роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные со-3 и ео-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного (АО) потенциала крови. Установлено, что АОА сыворотки крови максимальна в раннем возрасте у детей и экспериментальных животных и коррелирует со скоростью клеточной пролиферации. Показано, что обогащение рациона беременных женщин с ПЭ со-3 ПНЖК увеличивает уровень АОА их крови и подавляет ПОЛ, повышенное при ПЭ. Впервые доказано, что соотношение различных видов ЛТ у детей в норме и при патологии меняется при изменении в организме уровня со-3 ПНЖК. Установлено существование реципрокных отношений между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и различных видов (В, С, Д, Е). Недостаточный уровень в организме детей со-6 ПНЖК вследствие их сниженного поступления (недоношенные дети) или повышенного расхода на образование провоспалительных эйкозаноидов (бронхиальная астма) сопровождается снижением уровня ПОЛ, а обогащение их рациона ПНЖК приводит к нормализации уровня ПОЛ. На основании параллельного изучения ПОЛ, АОА и образования ЛТ сформулировано положение о реципрокности метаболических превращений ПНЖК. Впервые установлено, что различные виды воспаления — альтеративно-экссудативное и аллергическое, а также состояние недоношенности у детей вызывают сходные изменения в составе различных типов КМ (эритроцитов и лейкоцитов) и в плазме крови, заключающиеся в накоплении в них эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), снижении докозагексаеновой кислоты (ДГК) со-3 и общего уровня со-6 ПНЖК. На основании результатов исследования п оказана возможность использования указанных трех групп показателей (ПОЛ/АОА, лейкотриены, жирнокислотный состав биомембран) в качестве биомаркеров метаболизма ПНЖК.

Научно-практическое значение работы. Выявленный в работе факт взаимодействия трех исследованных путей метаболизма ПНЖК (участие в формировании АОС и регуляции ПОЛ, образование ЛТ и построение биомембран), позволивший сформулировать положение об их реципрокности, открывает новые направления в изучении особенностей биохимической регуляции этих соединений в организме. Не описанный ранее феномен накопления в крови ЭПК в сочетании со снижением уровня ДГК и со-6 ПНЖК при патологических состояниях у детей вносит новые представления в концепцию патогенеза этих состояний. Обнаружение АО свойств у ДЦ ПНЖК расширяет спектр известных к настоящему времени АО факторов и указывает на перспективность использования этих соединений в клинической практике. Полученные данные раскрывают новые стороны метаболизма ПНЖК и могут способствовать пониманию их физиологической роли у детей, а также служат теоретической основой для разработки новых подходов к диетотерапии болезней детского возраста. Данные о положительных эффектах обогащения рациона беременных женщин оо-З ПНЖК используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин.

Материалы диссертации легли в основу глав руководства для врачей «Детское питание» /Под ред. Тутельяна В. А., Коня И. Я.: МИА, — 2009. 952 е., и руководства для врачей и акушеров «Преэклампсия: руководство» /Под ред. акад. РАМН Сухих Г. Т., проф. Мурашко Л. Е. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.-576 с. Разработаны Методические рекомендации «Оптимизация жирнокислотного состава рационов питания дошкольных образовательных учреждений г. Москвы (MP 2.4.5.015−09, М., 2009 г.).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всероссийских и международных конференциях: Y и VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998, 2002) — Y и YII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2000) — Y Конгрессе педиатров России (Москва, 1999), International Congress of Pediatrics (Амстердам, Нидерланды, 1998), Международном симпозиуме «Питание XXI века. Медико-биологические аспекты, пути оптимизации» (Владивосток, 1999), Международном семинаре «Проблемы беременности высокого риска» (Москва, 1999) — I Всероссийском Конгрессе с международным участием «Питание детей: XXI век» (Москва, 2000) — II российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2002) — YII Всероссийском Конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003) — Second International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (Мюнхен, Германия, 2004) — 38th, 42th, 44lh Annual Meetings of the European Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) (Порто, Португалия, 2005; Будапешт, Венгрия, 2009; Сорренто, Италия, 2011) — Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006) — конгрессе «Внутриутробный ребенок и общество. Роль перинатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии» (Москва, 2007) — 10th European Nutrition Conference (Париж, Франция, 2007) — World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Сан-Паоло, Бразилия, 2008) — IX, X, XI, XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 64 работы, из них 19 публикаций — в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, другие издания — 10 публикаций, материалы научных конференций — 35 публикаций, 1 методические рекомендации, главы в 2-х руководствах.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (361 ссылка). Объем работы составляет 289 страниц, содержит 61 рисунок и 34 таблицы.

248 ВЫВОДЫ.

1. Доказана важная роль высокомолекулярных (около 600 кДа) компонентов (липопротеинов и входящих в их состав фосфолипидов) в формировании антиоксидантного потенциала крови у взрослых и детей при исследовании распределения антиоксидантной активности во фракциях их крови. Установлено, что фракции крови с высокой антиоксидантной активностью содержат в 3 раза больше длинноцепочечных ПНЖК, в том числе, в 5,6 раза — докозагексаеновой кислоты (р<0,05) семейства со-3, по сравнению с фракциями, обладающими низкой антиоксидантной активностью.

2. Показано, что увеличение соотношения со-6/ю-З ПНЖК в крови у беременных женщин с преэклампсией до 29:1 (против 10:1 в норме) сопровождается снижением антиоксидантной активности и интенсификацией ПОЛ, наиболее выраженным (р<0,05) в середине второго триместра беременности. Обогащение рациона беременных женщин с преэклампсией со-3 ПНЖК приводит к нормализации спектра жирных кислот (снижению со-6/со-З ПНЖК до 11:1), увеличению уровня антиоксидантной активности крови (р<0,05) и снижению интенсивности ПОЛ (р<0,05).

3. Установлено, что снижение содержания в плазме крови недоношенных детей длинноцепочечных ПНЖК со-6 и со-3 (р<0,05) и их соотношения (до 4:1), накопление в их крови эйкозапентаеновой и снижение докозагексаеновой кислоты сопровождается достоверным (на 50%, р<0,05) снижением антиоксидантной активности и уровня МДА. Вскармливание недоношенных детей смесью, обогащенной длинноцепочечными ПНЖК (арахидоновой и докозагексаеновой), приводит к частичной нормализации спектра жирных кислот крови, что проявляется увеличением уровня со-6 ПНЖК и уменьшением накопления эйкозапентаеновой кислоты на фоне тенденции к нормализации процессов ПОЛ.

4. Показано, что антиоксидантная активность сыворотки крови максимальна у новорожденных детей (в 2 раза выше (р<0,05) по сравнению с другими возрастными группами). Исследования на экспериментальных животных подтвердили выявленную закономерность. При этом уровень антиоксидантной активности крови у крыс коррелировал со скоростью клеточной пролиферации лимфоцитов печени (г = 0,815, р<0,001, п=30) и делящихся клеток в тимусе (г = 0,789, р<0,001, п=30), что подтверждает представление об участии ПОЛ в процессах клеточной пролиферации и роста.

5. Впервые установлено, что в лейкоцитах условно здоровых детей преобладают лейкотриены 5-й серии — метаболиты ПНЖК со-3. Увеличение синтеза провоспалительных сульфидопептидных лейкотриенов 4 серии (производных со-6 ПНЖК) ЛТС4 и ЛТЕ4 — при бронхиальной астме (р=0,018), и ЛТД4 — при ожирении (р=0,001) у детей сопровождается снижением уровня МДА (р<0,05), изменением соотношения между лейкотриенами 4-й и 5-й серий, а также между отдельными видами сульфидопептидных (С, Д, Е) и несульфидопептидных (В) лейкотриенов.

6. Обогащение рационов со сниженным уровнем со-3 ПНЖК этими нутриентами из различных пищевых источников (0,9 г рыбьего жира/день, содержащего 0,23 г длинноцепочечных со-3 ПНЖК, либо 10 мл льняного масла/день, содержащего 3,9 г а-линоленовой кислоты) в течение 5−6 недель приводит к нормализации спектра лейкотриенов крови детей: снижению образования провоспалительных лейкотриенов 4-й серии и увеличению уровня противовоспалительных лейкотриенов 5-й серии.

7. Впервые показано, что у детей при различных видах воспаления — альтеративно-экссудативном (воспалительные заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта) и аллергическом (бронхиальная астма) — в мембранах как дифференцированных клеток (эритроцитов), так и клеток, способных к делению (лейкоцитов), обнаруживаются сходные изменения жирнокислотного спектра: накопление эйкозапентаеновой кислоты и снижение содержания докозагексаеновой кислоты с увеличением (в 4 — 8 раз) их соотношения, сопряженных со снижением (в 2 — 6 раз) коэффициента эффективности метаболизации жирных кислот.

8. Накопление эйкозапентаеновой и снижение докозагексаеновой кислоты, обнаруженное в клеточных мембранах при воспалении, а также в плазме крови недоношенных детей, позволяет характеризовать выявленный феномен как типовую «биохимическую аномалию», отражающую снижение адаптационного потенциала у детей. Предложено рассматривать реакции превращения эйкозапентаеновой кислоты в докозагексаеновую кислоту как «метаболический перекресток», отражающий баланс между поступлением, синтезом и метаболизмом длинноцепочечных ПНЖК.

9. Проведенные исследования позволяют заключить, что антиоксидантная активность, уровень МДА как показатель интенсивности ПОЛ, синтез лейкотриенов в крови и жирнокислотный состав клеточных мембран могут быть отнесены к биомаркерам метаболизма ПНЖК в организме детей и беременных женщин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) относятся к эссенциальным факторам питания и привлекают внимание исследователей как в нашей стране [39, 59, 27], так и за рубежом [108, 111, 207, 208, 331, 332]. За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации таких важных физиологических и биохимических процессов в организме, как формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, поддержание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции, как в норме, так и при патологических состояниях.

Изучены многие стороны метаболических превращений ПНЖК, лежащих в основе указанных процессов. В то же время, ряд путей метаболизма жирных кислот и, особенно, взаимодействие этих путей, в значительной мере определяющее их функциональные эффекты, остаются малоизученными. Это, в частности, относится к участию ПНЖК в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты, образовании различных классов эйкозаноидов и построении и функционировании биомембран. Изучение взаимодействия этих путей представляет особый интерес с точки зрения поиска новых биомаркеров метаболизма ПНЖК у детей и беременных женщин.

Неконтролируемое усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) играет важную роль в развитии и течении таких тяжелых заболеваний как ретинопатия недоношенных, бронхолегочная дисплазия, артриты, сахарный диабет, гипертоническая болезнь у детей, а также преэклампсии у беременных женщин. Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ [7, 59, 23, 48, 63]. Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [1, 30, 39, 51, 52, 61, 103, 142, 202, 226, 150]. В связи с этим нами было проведено изучение возможной роли длинноцепочечных (ДЦ).

ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови, которая является частью общей АОС организма. Эта система, сформировавшаяся в ходе эволюции, представляет из себя сложную, многоуровневую систему защиты организма от окислительного стресса, которая осуществляется с участием различных факторов, как классических антиоксидантов, так и веществ, которые способны проявлять и прооксидантное действие.

В частности, в мембранах существует несколько путей, определяющих антиоксидантный статус организма, которые изменяют скорость окисления липидов и которые можно рассматривать как регуляторные. К ним относятся строго определенная структурная организация липидов, влияющая на скорость реакции инициирования, продолжения и обрыва цепи, ферменты, регулирующие обмен фосфолипидов мембран, выход из них окисленных форм липидов, влияющие на скорость окисления путем изменения состава жирных кислот фосфолипидов, отношения липиды/белок, фосфолипиды/холестерин и т. д., ферменты антиоксидантного действия и низкомолекулярные вещества, в том числе, витамины [61]. Любые лекарства или пищевые добавки, изменяющие условия работы перечисленных систем, будут менять скорость ПОЛ, даже не являясь антиоксидантами. При этом между вышеперечисленными факторами возможны различные взаимодействия и, в частности, между пищевыми антиоксидантами и другими звеньями антиоксидантной системы. Это необходимо учитывать при оценке действия пищевых антиоксидантов и их назначении с лечебными и профилактическими целями, в особенности детям. Применение пищевых антиоксидантов в качестве единственного средства антиоксидантной терапии и профилактики не учитывает роли других уровней антиоксидантной защиты и синергических взаимоотношений, возникающих между пищевыми антиоксидантами и компонентами антиоксидантной защиты с других уровней и может вести к развитию негативных побочных реакций со стороны организма [71, 279, 280, 309, 272, 295, 23]. Эти побочные эффекты особенно нежелательны для организма детей младшего возраста в связи с незрелостью выделительной и детоксицирующей систем и потенциальной опасностью нарушения нормального развития, включающего процессы тканевой пролиферации и дифференцировки. Для детей более старшего возраста опасность побочных эффектов от слепого использования высоких доз антиоксидантов не теряет актуальности, особенно в период так называемых «критических окон» в развитии (5−6 лет и препубертатный возраст). Вместе с тем, представляется весьма привлекательной теоретическая возможность использования при проведении антиоксидантной терапии веществ, обладающих максимально эффективной способностью вызывать положительные сдвиги в системе ПОЛ/АОС и клиническом течении заболеваний, связанных с неконтролируемым усилением процессов ПОЛ. Для выяснения природы этих веществ необходимо проведение исследований, направленных на выяснение роли отдельных компонентов антиоксидантной системы в формировании АОС организма.

Учитывая важную роль баланса ПОЛ и АОС, очевидна необходимость разработки адекватных методов контроля за скоростью ПОЛ и состоянием антиоксидантной защиты организма у детей. При этом практически наиболее доступной для исследования тканью является кровь, состав которой в значительной мере отражает и может рассматриваться как интегральный показатель состояния других органов и систем [188]. В то же время циркулирующие в крови компоненты могут, в свою очередь, оказывать существенное влияние на метаболические процессы в различных органах и тканях, в частности, окисленные липопротеины низкой плотности могут инициировать в тканях изменения, проявляющиеся в виде метаболического синдрома [182, 188, 341]. С этой точки зрения исследование антиоксидантной системы крови представляет значительный теоретический и практический интерес.

При этом особый интерес представляет использование для характеристики АОС крови такого интегрального показателя, как суммарная АОА, поскольку изучение содержания отдельных антиоксидантов в биологических субстратах организма без учета их синергических отношений с компонентами других уровней антиоксидантной защиты не может считаться исчерпывающей характеристикой антиоксидантного статуса. Кроме того, определение отдельных компонентов эндогенной системы защиты липидов клеточных мембран и липопротеинов от перекисной деградации не представляется возможным из-за трудоемкости анализов и синергизма действия различных ингибиторов в системе защиты.

В связи с этим, на протяжении 25−30 последних лет предпринимаются попытки создания методик для определения суммарной активности ингибиторов свободно-радикальных реакций, присутствующих в биологических жидкостях (сыворотке крови, моче, слюне, слезе и др.), гомогенатах тканей и суспензиях мембран и липопротеинов, так как, с одной стороны, это упрощает характеристику антиоксидантого статуса методически, с другой стороны позволяет учесть и синергические отношения антиоксидантов, и вклад компонентов других уровней антиоксидантной защиты.

При выборе наиболее адекватного для наших целей метода определения АОА мы исходили из представления о том, что в принципе любая методика определения АОА биологических жидкостей основывается на использовании модельной системы, которая включает в себя по крайней мере два компонента: механизм генерации определенного сорта свободных радикалов и систему их детектирования.

Введение

в такую модельную систему перехватчика свободных радикалов, либо веществ, влияющих на концентрацию или состояние ионов-катализаторов, вызовет уменьшение концентрации свободных радикалов, что отразится на параметрах детектирующей системы. При этом для определения общей АОА биологических жидкостей применяют несколько модельных систем, различающихся по способу генерации свободных радикалов, методу их детектирования, характеру фазы системы (гомогенная или гетерогенная) и сложности интерпретации.

Одной из первых доступных и воспроизводимых модельных систем окисления, примененной для определения АОА сыворотки крови, был предложенный Стоксом и соавт. в 1974 г., гомогенат мозга [315]. С помощью этой модельной системы было показано, что сыворотка крови и другие биологические жидкости ингибируют ПОЛ модельной системы, определяемое по концентрации вторичных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты). Было показано также, что основной вклад в общую АОА крови вносят сывороточные белки — церулоплазмин и трансферрин. а-Токоферол (а-Тк) в физиологических концентрациях отвечает лишь за незначительную часть общей АОА сыворотки крови. Альбумин, добавленный к гомогенату в физиологических концентрациях, эффективно ингибирует накопление ТБК-активных продуктов, что, по мнению авторов, обусловлено его способностью связывать различные лиганды, в том числе Бе2+. Таким образом, гомогенат мозга в качестве модельной системы оказался пригодным для определения вклада железоокисляющих и железосвязывающих компонентов в общую АОА биологических жидкостей (церулоплазмина, трансферрина, альбумина) [315]. Другие компоненты общей АОА сыворотки крови (аскорбат, урат, а-токоферол, каротиноиды) на свойства этой модельной системы не влияли.

Другой модельной системой, которую использовали Клебанов и соавт. [19] для определения АОА во фракциях, полученных при разделении сыворотки крови на колонке с ТОУОРЕЯЬ Н¥—60 (Япония), явилась система желточных липопротеинов (ЖЛП) [19], инициирование ПОЛ в которой осуществляется с помощью ионов двухвалентного железа. Суспензия липопротеинов желтка яиц как модельная система отличается от других липидсодержащих систем доступностью получения, высокой стабильностью и относительно хорошей окисляемостью [19, 18]. Профиль белковой элюции включал два пика: первый пик был связан с выходом из колонки липопротеинов, а также крупнои среднемолекулярных плазменных белков, второй — с элюцией низкомолекулярных веществ. Исследователи пришли к выводу, что АО, А сыворотки крови была связана, в основном, с активностью ЦП, сконцентрированного во фракции среднемолекулярных белков. В то же время, низкомолекулярные фракции не меняли параметры регистрирующей системы (интенсивность хемилюминисценции модельной системы ЖЛП).

В наших исследованиях для оценки общей АОА мы избрали систему ЖЛП с инициацией ПОЛ ионами Fe. Следует подчеркнуть, что в соответствии с традиционными представлениями принято считать, что в суммарную АОА сыворотки крови вносят вклад различные вещества высокои низкомолекулярной природы: ферменты (супероксид дисмутазы, каталаза, глутатион-пероксидазы), белки — хелаторы ионов металлов, витамины Е, С, А, каротиноиды, мочевая кислота, билирубин и др.) Многочисленные исследования, проведенные отечественными и зарубежными авторами [12, 60, 23, 27, 42], позволили прийти к заключению о том, что основной вклад в формирование неферментативной антиоксидантной системы крови вносят низкомолекулярные соединения (витамины А, Е, С, билирубин, коэнзим Q, флавоноиды, мочевая кислота и др.). Однако, в дополнение к антиоксидантам с хорошо изученными свойствами работами Стокса с соавт. (1974), Клебанова Г. И. и соавт., 1999 [19, 315] было показано значение высокомолекулярных белковых компонентов крови (трансферрина и церулоплазмина) в формировании ее суммарной АОА. Кроме того, представляют значительный интерес данные литературы об АОА липопротеинов, одним из компонентов которых являются ПНЖК семейства со-З [56, 58, 182, 254, 256]. Вопреки сложившимся представлениям об этих соединениях как о субстратах ПОЛ, в ряде работ имеются указания на возможность их полярного, антиоксидантного действия [19, 52, 103, 202, 150]. По одним данным такой активностью обладает докозагексаеновая кислота (ДГК) — ДЦ ПНЖК с 6 двойными связями [103, 202], по другим — все длинноцепочечные полиненасыщенные ЖК [30, 52], которые вступают в синергические отношения с витамином E и проявляют антиоксидантные свойства, являясь комонентами фосфолипидов. Однако вклад ПНЖК в формирование суммарной АОА сыворотки крови неизвестен.

Таким образом, к моменту начала наших исследований вопрос о природе АОА крови оставался спорным и требовал дальнейшего изучения. С этой целью была проведена серия экспериментов по хроматографическому разделению сыворотки крови на фракции с различной молекулярной массой, в которых была измерена суммарная АОА методом подавления Fe2± индуцированного ПОЛ в системе липопротеинов яичного желтка и в других модельных системах подавления ПОЛ (TAS /total antioxidant status/- окисление метилолеата, а также содержание витаминов-антиоксидантов, уровень белков с антиоксидантными свойствами и жирнокислотный состав фракций, уровень в них различных липопротеинов и активность антиокисдантного фермента PON-1, связанного с липопротеинами.

Взяв за основу исследование Stocks et al. [315], в первой части нашего исследования мы провели хроматографическое разделение сыворотки крови на геле «SEPHADEX G-200» со свойствами, сходными со свойствами гелей, использованных Stocks и соавт. (1974) [315], но в системе с ЖЛП. Большая разрешающая способность носителя позволила нам в дополнение к пику с АОА, определяемой ТФ и ЦП, выявить еще один, дополнительный пик с высокой молекулярной массой, АОА которого была максимальной.

Характеристика этого пика показала, что по молекулярной массе он соответствует липопротеинам, а его химический состав представлен меньшим количеством белка и большим количеством как общих липидов, так и отдельных липидных компонентов (холестерина, фосфолипидов, триглицеридов) и аполипопротеина В1 по сравнению с контрольной фракцией, не обладающей АОАсодержит небольшое количество жирорастворимого витамина Е.

Следует указать, однако, что использованный нами в качестве носителя гель «SEPHADEX G-200», равно, как и «SEPHADEX G-150», использованный Stocks et al. [315] не позволяют проводить эффективное разделение белков с молекулярной массой больше 200 кДа. Поэтому во второй части исследования для проведения хроматографического разделения мы выбрали носитель «Superose-б» с рекомендуемым диапазоном молекулярных масс разделяемых белков от 5 до 5000 кДа.

Используя этот носитель, мы вновь подтвердили существование высокомолекулярной фракции (М. масса ~ 600 кДа), обладающей максимальной АОА. Однако, в отличие от данных Клебанова и Стокса, которые считали, что основной вклад в АОА высокомолекулярной фракции вносят ТФ и ЦП, мы не обнаружили присутствия этих белков в данной фракции, что было показано с помощью методов иммунохимии. Эти белки, а также альфа-фетопротеин и альбумин образовывали второй по величине пик АОА, обусловленной способностью связывать ионы металлов переходной валентности (Fe, Cu), феррооксидазной активностью церулоплазмина и способностью таких входящих в его состав белков, как альбумин и альфа-фетопротеин связывать и переносить ПНЖК [56, 53].

Поскольку АОА является интегральным показателем, величина которого зависит от взаимодействия многих компонентов, закономерно возникает вопрос о правомерности данного вывода при использовании иных методов детекции АОА, основанных на оценке других составляющих АОС. С этой целью было проведено определение АОА в двух других модельных системах индуцированного СРО: определение АОА с помощью оценки ингибирования окисления метилолеата и с помощью торможения ПОЛ в системе определения общего антиоксидантного статуса (total antioxidant status, TAS). В первой из этих систем свободно-радикальное окисление (СРО) инициировали с помощью термического разложения азобисизобутиронитрила (АИБН) (6×10″ 4 моль/л), а АОА рассчитывали как отношение разности периодов индукции в опыте и в контроле (Ах^Топ тк) к периоду индукции контроля тк [30] Во второй — внесенные антиоксиданты в составе сыворотки крови или ее фракций тормозят образование окрашенного стабильного радикала ABTS+ (2,2'-азино-ди-(3-этилбензтиазолина сульфонат)) в смеси ABTS-метмиоглобин-НгОг [ 243]. В обеих модельных системах были выявлены пики АОА в области высокомолекулярных компонентов (около 600 кДа). Таким образом, при использовании трех независимых методов оценки АОА сыворотки крови были получены сходные результаты, свидетельствующие о том, что высокомолекулярные фракциии сыворотки крови обладают высокой АОА.

Анализ жирнокислотного состава выявленной фракции с максимальной АОА показал наличие гораздо большего, чем в контрольной фракции, количества в ней ПНЖК, достоверно более высокое содержание ДГК ю-3 семейства и суммы ДЦ ПНЖК как со-3, так и со-6 семейства. Учитывая имеющиеся в литературе данные о способности длинноцепочечных (ДЦ, более 20 углеродных атомов) ПНЖК, входящих в состав фосфолипидов, восстанавливать активную форму а-Тк при взаимодействии с токоферрильными радикалами и проявлять тем самым АОА, состоящую в способности вступать в синергические отношения с основным жирорастворимым антиоксидантом биомембран — витамином Е [Сторожок, Храпова, 1997, Луконькин, 2000], можно предположить, что АОА выявленной нами фракции во многом определяется ПНЖК в особенности ДЦ ПНЖК со-3 семейства, входящими в состав фосфолипидов, триглицеридов и липопротеидов, и способностью этих ПНЖК к синергическим взаимодействиям с жирорастворимыми компонентами антиоксидантной системы крови.

Для подтверждения этого предположения был проведен электрофорез указанной фракции в агарозе, который выявил присутствие в ней липопротеинов, соответствующих по подвижности а-липопротеинам и липопротеину (а), т. е ЛПВП и ЛПНП [58]. Во фракции сыворотки крови, не обладающей АОА, эти виды липопротеинов не выявлялись.

Другим подходом к определению природы ЛП во фракции с высокой АОА явилось определение во фракциях сыворотки крови активности фермента параоксоназы-1 (Р01М), ассоциированного с ЛПВП, которую исследовали во фракциях крови, полученных с помощьюдвух разных хроматографических носителей: «8ирегозе-6» и носителя с более высокой разрешающей способностью «Т8КОеЮ40 008У». Эти данные показали, что АОА в высокомолекулярных областях действительно связана с ЛП, но АОА обладают не только ЛПВП, а и другие классы ЛП, выявляемые с помощью хроматографического носителя с более высокой разрешающей способностью («Т8КОеЮ40 008\6>) и способные переносить в крови ПНЖК, в особенности, ПНЖК со-3 семейства, в составе фосфолипидов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ю-3 и со-6 ДЦ ПНЖК могут проявлять свое антиоксидантное действие в качестве компонентов липопротеинов, в которых они транспортируются в составе фосфолипидов и триглицеридов в комплексе с аполипопротеинами. В пользу этого вывода говорят и литературные данные о том, что ПНЖК проявляют свои антиоксидантные эффекты, связанные с восстановлением радикала витамина Е, именно в составе фосфолипидов [30, 51, 52].

Примечательно, что по данным Сторожок Н. М. и Луконькина И. А. [30], ПНЖК с большей длиной углеводородной цепи и большим количеством двойных связей обладают более высокой АОА. В связи с этим можно полагать, что одной из причин более высокой АОА данной фракции может быть присутствие в ней большего количества ДЦ ПНЖК. Авторы связывают АОА ПНЖК с их участием в построении фосфолипидов и синергизмом в действии конъюгированной системы из чередующихся двойных и одинарных связей в цепочке жирной кислоты и полярной головки фосфолипида: чем больше количество двойных связей в молекуле жирной кислоты, а, следовательно, и ее длина, тем выше АОА фосфолипида [30, 51, 52]. Учитывая этот принцип, наибольшей АОА должны обладать ПНЖК со-3 семейства как более ненасыщенные и длинноцепочечные. Следовательно, максимальной АОА будут обладать фосфолипиды, в состав которых входит ДГК с 22 углеродными атомами и 6 двойными связями [30, 103], а в сыворотке крови — частицы, которые переносят эти фосфолипиды. Таким образом, можно заключить, что более высокая АОА фракции с ее максимальным значением может быть обусловлена более высоким уровнем входящих в ее состав длинноцепочечных ПНЖК со-3 семейства.

Полученные данные указывают, следовательно, на гораздо более сложные взаимоотношения отдельных антиоксидантов и их вклад в формирование суммарной АОА крови, чем это принято считать в настоящее время.

Другим подходом к оценке возможной роли со-3 ПНЖК в реализации АОА крови явилось параллельное изучение, ПОЛ, АОА и спектра жирных кислот у беременных женщин с преэклампсией (ПЭ). При оценке антиоксидантного статуса исследовали также содержание в крови одного из белков с антиоксидантными свойствамитрансферрина.

Было установлено, что при ПЭ наблюдалось увеличение уровня со-6 ПНЖК и снижение уровня со-3 ПНЖК в крови беременных женщин, а также изменение соотношения со-б/со-З ПНЖК: при нормально протекающей беременности оно составляло 10:1, тогда как при ПЭ оно повышалось до 30:1. При этом в динамике беременности наблюдалось увеличение уровня ПОЛ в крови по сравнению с нормально протекающей беременностью, и отсутствие увеличения во втором триместре беременности АОА и ТФ в сыворотке крови, имеющее место при нормально протекающей беременности. Наши данные согласуются с результатами работы американских исследователей, проведенной независимо от нас в 90-е годы прошлого века [133].

Включение в комплексную терапию со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира приводило к достоверному увеличению относительного содержания ЭПК и ДГК в крови у беременных женщин с ПЭ, особенно выраженному в 29-ю и 34-ю недели. При этом в среднем содержание ЭПК — увеличилось в 1,4 раза, а ДГК — удвоилось. Отношение со-6/ю.

3 ПНЖК при этом составило 11:1 -14:1 и приблизилось к значениям при физиологической беременности.

Прием со-3 ПНЖК полностью устранял также рост концентрации МДА в крови, вызванный ПЭ, и приводил к резкому (в 1,5−2 раза) снижению этого показателя даже по сравнению с неосложненной беременностью. АОА и уровень ТФ при этом возрастали на всех изученных сроках беременности.

Таким образом, полученные данные подтверждают представления о существенной роли нарушений антиоксидантного статуса в патогенезе ПЭ, связанного с накоплением в крови продуктов ПОЛ, отражающим его усиление [25, 239]. Это ведет к оксидативному стрессу и снижению содержания антиоксидантов в организме беременной, что вызывает дефицит эссенциальных ПНЖК в организме беременных и способствует развитию ПЭ. В то же время нельзя исключить и обратную зависимость: недостаточное поступление эссенциальных ПНЖК со-3 семейства в организм женщины в предконцептуальный период, ведущее к повышению соотношения со-6/со-З ПНЖК, может провоцировать снижение АОА крови и окислительный стресс. Дополнительный прием препарата со-3 ПНЖК позволяет повысить содержание со-З ПНЖК в крови беременных женщин, изменить соотношение ш-6/со-З ПНЖК и приблизить его к уровню у женщин с нормально протекающей беременностью, устранить нарушения антиоксидантного статуса и усиление процессов ПОЛ и улучшить клиническое течение ПЭ. Так, после проведенной терапии с включением со-3 ПНЖК наблюдалось более раннее (на 2−3 дня), чем при применении общепринятой терапии, исчезновение клинических проявлений ПЭ, более благоприятное течение ПЭ и исходы беременности и родов для матери и плода (своевременные роды в 2 раза чаще, а преждевременные — в 5 раз реже, чем у пациенток группы сравненияболее высокий процент (93%) самостоятельной родовой деятельности у женщин, принимавших со-3 ПНЖК, и 75% - в группе сравнения, соответственно) и детей, родившихся доношенными (90% в группе женщин, принимавших со-3 ПНЖК, и 47% в группе сравнения). Эти результаты послужили основанием для использования со-3 ПНЖК в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

Полученные данные, в сочетании с проведенными нами исследованиями in vitro, подтверждают гипотезу об антиоксидантных эффектах со-3 ПНЖК, обусловленных их включением в состав ЛП комплексов, обладающих максимальной АОА в крови, а также стимуляцией синтеза ТФ — как одного из важных АО факторов крови [315]. Возможно, этот эффект реализуется путем влияния со-3 ПНЖК, входящих в состав рыбьего жира, на активность ядерного фактора каппа би [219, 220], который, в соотвествии с современными представлениями, отвечает за экспрессию многих молекул, принимающих участие в развитии воспаления. Можно также предполагать, что этот процесс опосредован образованием противовоспалительных эйкозаноидов, в частности, лейкотриенов (ЛТ) 5 серии из ЭПК [220, 221].

Еще одним подходом к оценке возможной роли ш-3 ПНЖК в формировании АОА крови явилось параллельное изучение ПОЛ, АОА и спектра ЖК у недоношенных детей, для которых характерно снижение уровня ПНЖК в организме вследствие прерывания их внутриутробного развития во второй половине беременности, когда идет максимальное накопление плодом ПНЖК [111, 113, 208, 331] .

Проведенные исследования показали, что уровень МДА и АОА в крови недоношенных детей был существенно и достоверно ниже, чем их уровень в пуповинной крови у здоровых доношенных детей (58% и 46% от контроля для АОА и МДА, соответственно). Снижение уровня суммарной АОА говорит о нарушении антиоксидантной защиты недоношенных детей, что согласуется с литературными данными о высокой частоте у этой категории больных детей свободно-радикальной патологии, такой как ретинопатия недоношенных, бронхолегочная дисплазия, некротизирующий энтероколит и др. [272, 273], а кроме этого может служить причиной задержки роста, характерной для недоношенных детей [208, 272]. В то же время, обращает на себя внимание снижение в крови у недоношенных детей уровня МДА как показателя процессов ПОЛ. Согласно данным литературы [6, 26, 308] интенсивность ПОЛ поддерживается в здоровом организме на определенном уровне, поскольку ПОЛ участвует в таких важных физиологических процессах, как апоптоз, неспецифический иммунитет и др., обеспечивая нормальный уровень тканевой дифференцировки и иммунной защиты. Поэтому снижение уровня МДА как показателя ПОЛ в крови у недоношенных детей является неблагоприятным признаком, так как в результате снижения ПОЛ могут нарушаться процессы нормальной дифференцировки тканей и защитные механизмы у недоношенных детей. Таким образом, можно предполагать, что низкий уровень АОА сыворотки крови и показателя интенсивности процессов ПОЛМДА — у недоношенных детей относятся к числу факторов, ответственных за нарушение роста и дифференцировки, которые вносят вклад в развитие ряда патологических состояний, сопровождающих недоношенность. Исходя из выдвинутой гипотезы, с нашей точки зрения, необходимо пересмотреть представления об оптимальных дозах пищевых антиоксидантов. В самом деле, если свободно-радикальная патология недоношенных младенцев (ретинопатия недоношенных, некротический энтероколит) является лишь следствием незрелости младенцев, в особенности недоношенных, то поступление с пищей достаточного количества всех экзогенных антиоксидантов, включая витамины А, Е, С, бета-каротин, микроэлементы (Zn, Си, Mn, Se), глутатион, серусодержащие аминокислоты и др. играет исключительно важную роль в поддержании их гомеостаза. Однако, если усиление ПОЛ, сопряженное с генерацией свободных радикалов, служит также одним из механизмов регуляции процессов клеточного роста и дифференцировки [69, 118, 262, 359, 360], можно полагать, что избыточное поступление антиоксидантов с пищей в организм ребенка раннего возраста, в особенности в определенные критические периоды, может нарушить тонкую регуляцию дифференцировки тканей, лежащую в основе процессов развития.

Параллельная с изучением ПОЛ оценка уровня жирных кислот в крови у недоношенных детей показала, что у них наблюдается достоверное снижение уровня всех представителей со-6 ПНЖК — линолевой (18:2), дигомо-гамма-линоленовой (20:3) и, особенно, арахидоновой кислоты (20:4). В то же время на фоне снижения уровня со-6 ПНЖК выявлено накопление в плазме крови эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5) и суммы со-3 ПНЖК. Вместе с тем, уровень двух других ДЦ ПНЖК со-3 семейства (ДПК 22:5 и ДГК 22:6) проявлял тенденцию к снижению. Можно предполагать, что выявленное нами снижение уровня арахидоновой кислоты (20:4) со-6 семейства в плазме крови недоношенных детей частично компенсируется за счет накопления в ней ЭПК (20:5) со-3 семейства, метаболизация которой в ее более длинноцепочечные производные — 22:5 и 22:6 — понижена. Этот феномен — блок превращения ЭПК в ДГК — не был описан ранее в литературе. Вместе с тем, было высказано предположение, что недостаток эссенциальных ПНЖК со-6 семейства может компенсироваться увеличением содержания в организме производных олеиновой кислоты семейства со-9, способной синтезироваться в организме [54, 55, 58]. Полученные нами данные не согласуются с данной гипотезой и показывают, что у детей в условиях дефицита ПНЖК со-6 семейства производные эссенциальных ПНЖК со-3 семейства накапливаются в крови быстрее и/или более предпочтительно, чем жирные кислоты семейства со-9.

Снижение в плазме крови недоношенных детей субстрата ПОЛ — со-6 ПНЖК — может быть причиной наблюдавшегося снижения уровня ПОЛ, проявляющегося в уменьшении уровня в крови МДА, а снижение АОА плазмы крови недоношенных детей, видимо, обусловлено низким содержанием ДЦ ПНЖК (арахидоновой, ДПК и ДГК) в составе фосфолипидов, переносимых липопротеинами.

Таким образом, результаты, полученные при обследовании недоношенных детей, представляющих собой как бы природную модель недостаточной обеспеченности организма ДЦ ПНЖК, связанной с прерыванием внутриутробного развития ребенка в период, предшествующий максимальному трансплацентарному переносу ДЦ ПНЖК от матери к плоду, подтверждают предположение об участии этих соединений в формировании АО системы сыворотки крови, достоверно сниженной у этих детей.

Через 2 недели после начала их вскармливания либо модифицированной смесью для недоношенных детей, обогащенной ДЦ ПНЖК — арахидоновой и ДГК, либо стандартной смесью для недоношенных детей (группа сравнения) показал, что в крови детей, получавших обогащенную смесь, достоверно увеличивался по сравнению с исходным уровнем, суммарный уровень со-6 ПНЖК, и, в частности, линолевой кислоты (18:2). При этом снижался уровень ЭПК (20:5), что могло свидетельствовать о прекращении компенсаторного накопления ЭПК в крови вследствие увеличения в ней уровня со-6 ПНЖК. ПОЛ на этом фоне повышалось, стремясь к уровню у доношенных детей. Таким образом, наблюдаемые изменения в спектре жирных кислот носили в целом благоприятный характер, хотя и не нормализовали спектр жирных кислот полностью. В частности, не удалось нормализовать в крови детей уровень арахидоновой кислоты (20:4).

В группе сравнения, у детей, получавших такую же смесь, но не обогащенную ДЦ ПНЖК, уровень МДА к концу исследования резко снизился (M±SD: 0,41± 0,36 и 0,26±0,30 нмоль/мл в начале и конце исследования, соответственно). При этом, исследование спектра жирных кислот плазмы крови данной группы детей выявило нарастание его дисбаланса. В частности, продолжилось снижение уровня арахидоновой кислоты и рост ЭПК и суммы со-3 ПНЖК в плазме крови детей.

Полученные результаты подтверждают предположение о том, что ДЦ ПНЖК играют существенную роль в формировании АО статуса у детей. В частности, снижение обеспеченности этими жирными кислотами, которое наблюдается у недоношенных детей, ведет к ухудшению антиоксидантного статуса, что выражается в снижении АОА сыворотки крови. При этом дополнительное потребление ДЦ ПНЖК в составе специализированной смеси вызывало тенденцию к нормализации состава жирных кислот плазмы крови и ПОЛ. Однако нормализации АОА крови под влиянием обогащения смеси не наблюдалось в связи с неполной нормализацией состава ДЦ ПНЖК плазмы крови.

Следующий раздел работы был направлен на оценку возможного участия ДЦ ПНЖК в реализации альтернативной, то есть связанной не с их ролью в развитии заболеваний, а с участием в контроле клеточной пролиферации и дифференцировки, функции системы ПОЛ/АОА. Эта гипотеза, выдвинутая в 70-е годы прошлого столетия Е. Б. Бурлаковой и соавт. [1], была впоследствии поддержана работами других исследователей [118, 308, 359, 360].

С этой целью нами было проведено исследование вклада отдельных антиоксидантов в суммарную АОА крови у детей в сравнении с этими показателями у взрослых людей, изучение возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.

В результате проведенных исследований было установлено, что суммарная АОА т? 2+ сыворотки крови детей первого года жизни, изученная в системе подавления гезависимого ПОЛ в ЖЛП, достоверно (Р<0,05) превышает АОА детей в возрасте 5 лет и взрослых людей, и выше, чем у детей 10−14 лет. АОА сыворотки крови детей всех обследованных возрастных групп, была выше, чем у взрослых людей, несмотря на то, что по данным литературы, содержание большинства АО компонентов в крови в детском возрасте ниже, чем у взрослых [223, 228, 229]. Примечательно, что максимальная АОА наблюдается в крови у новорожденных детей. Этот феномен отражает, очевидно, эволюционно закрепленную способность новорожденных противостоять агрессивному воздействию Ог, которому он подвергается в первые же минуты после прекращения внутриутробного существования и появления на свет. Максимальная АОА в крови у новорожденных детей совпадает с максимальной скоростью роста, наблюдающейся в этот период у детей [276]. Повышение АОА крови наблюдается также и у подростков, т. е. в период второго ростового скачка.

Учитывая полученные нами результаты изучения вклада отдельных АО в формирование АОА сыворотки крови (глава З.1.), представлялось целесообразным сравнить спектр ЖК крови у детей разного возраста. Было показано, что в плазме крови здоровых доношенных новорожденных детей достоверно выше уровень длинноцепочечных ПНЖК: ДГЛК (20:3), АК (20:4) и ДГК (22:6), а в мембранах эритроцитов — АК (20:4) и ДПК (22:5) по сравнению с их уровнем в плазме крови и мембранах эритроцитов подростков и беременных женщин. В то же время уровень АК и ДПК в крови у подростков, для которых характерен ростовой скачок, был выше по сравнению с беременными женщинами. Эти данные согласуются с выдвинутым положением о важной роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови и указывают также на их возможную роль в процессах роста.

В связи с этим была проведена сравнительная оценка вклада отдельных компонентов АОС в суммарную АОА различных фракций сыворотки крови взрослых и детей. Хроматографическое разделение сыворотки крови детей показало, что их суммарная АОА характеризовалась одним пиком с максимальной АОА, соответствующим фракции № 13, и отсутствием дополнительного пика, соответствовавшего 16 фракции у взрослых (глава 3.1.2.) и определяется, следовательно, высокомолекулярным ЛП компонентом сыворотки крови, содержащим входящие в состав ЛП ПНЖК со-6 и соЗ семейства. Эти результаты согласуются с результатами изучения возрастной динамики уровня ПНЖК в крови детей, приведенными в предыдущем разделе, и подтверждают сделанный вывод о важной роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови и их возможном участии в регуляции процессов роста. Такие важные высокомолекулярные антиоксиданты сыворотки крови как ТФ и ЦП не участвовали в формировании суммарной АОА у детей, поскольку присутствовали в крови в существенно меньшей концентрации, чем у взрослых. Представления о том, что именно ДЦ ПНЖК играют важную роль в формировании АОС у детей, согласуются с известными из литературы данными о том, что ю-6 и ю-З ПНЖК имеют большое значение для нормального развития детей, ю-6 и ю-3 ПНЖК активно захватываются из кровотока матери организмом плода в последнем триместре беременности, а после рождения ребенка поступают в его организм с грудным молоком и используются как строительный материал для клеточных и субклеточных мембран, в особенности для растущего с высокой скоростью головного мозга и формирования зрительного анализатора [93, 123, 158, 208]. Эти данные заслуживают особого внимания в связи со значительным интересом исследователей к проблемам роста и его регуляции.

В частности, в последние годы активно обсуждается проблема программирования заболеваний взрослого человека неблагоприятными факторами, действующими на ранних этапах онтогенеза, в период так называемых «критических окон» развития. Одним из таких факторов является скорость роста во внутриутробном и раннем постнатальном периоде [152, 276, 289]. Показано, что как задержка роста, так и скачкообразное увеличение скорости роста ведут к неблагоприятным метаболическим сдвигам, проявляющимся развитием избыточной массы тела и ожирения, инсулинорезистентности, диабета, гипертонии, атеросклероза и других «болезней цивилизации» [152, 276, 289]. В то же время, механизмы регуляции процессов нормального роста не ясны. Поэтому изучение факторов, влияющих на рост и развитие организма в различные возрастные периоды, представляется весьма актуальным.

Рост складывается из трех процессов: роста всего тела, роста органов и тканей и увеличения количества и размера клеток. Последние два компонента роста регулируются путем изменения баланса клеточной пролиферации и дифференцировки. В раннем возрастном периоде этот баланс сдвинут в сторону процессов пролиферации, и первые месяцы жизни характеризуются максимальной скоростью роста как у человека, так и у экспериментальных животных, в частности, крыс [276]. В то же время недостаточно данных о факторах, определяющих высокую скорость роста в раннем возрасте.

Одним из механизмов регуляции клеточного цикла и процессов клеточной пролиферации и дифференцировки может служить изменение баланса между антиоксидантным статусом организма и прооксидантами. Так, показано, что первичные продукты ПОЛ — окисленные липопротеины низкой плотности (оЛПНП) обладают свойством ингибировать клеточную пролиферацию, в частности, путем снижения экспрессии митогенов [117, 118] и общего числа клеток, как входящих в клеточный цикл, так и завершивших его, а также уровня в ядре белков клеточного цикла [359]. Основным механизмом антипролиферативного действия оЛПНП авторы считают снижение транслокации белков клеточного цикла из цитоплазмы в ядро, в частности, такое снижение наблюдалось для циклина D1, ответственного за переход клетки из фазы Go в фазу Gi. Следствием этого было снижение образования активных комплексов циклинов с циклин-зависимыми киназами. В частности, обнаружено снижение активности Cdc2 и Cdk2 киназ в клетках, обработанных оЛПНП [359]. Таким образом, увеличение перекисного окисления липидов, приводящее к повышению уровня оЛПНП в крови или среде, ведет к торможению клеточной пролиферации, по-видимому, за счет торможения фазы Gi.

Что касается тканевой дифференцировки, то одним из важных механизмов ее регуляции является апоптоз, в свою очередь регулируемый при активном участии свободных радикалов [308]. При развитии плода свободные радикалы вовлечены в контроль апоптоза и детальной индивидуализации развивающихся частей зародыша. На ранних этапах эмбриогенеза присутствие перекиси водорода обязательно для формирования бластоциста и апоптоза внутренней массы [272].

Таким образом, соотношение процессов ПОЛ и АОА в организме может оказывать влияние на соотношение в нем процессов пролиферации и дифференцировки и, таким образом, служить фактором регуляции скорости роста. В связи с этим следущим этапом работы явилось сопоставление возрастной динамики АОА и интенсивности клеточной пролиферации и апоптоза в различные возрастные периоды у экспериментальных животных (крыс). Исследование было проведено с помощью метода проточной цитометрии на клеточных популяциях печени и тимуса крыс.

При этом было выявлено существенное и достоверное снижение уровня АОА у крови у крыс с возрастом. Максимальные значения этого показателя наблюдались в группе новорожденных животных в возрасте 3−4 дней жизни. Более поздние возрастные периоды характеризовались в 6−9 раз меньшей АОА сыворотки крови (22,1 отн.ед. и 2,4 — 4,2 отн.ед. в возрасте 0,5 и 6−26 недель, соответственно). Данные, полученные у экспериментальных животных, совпадают с данными, полученными нами у детей разного возраста (глава З.4.). Максимум этого показателя наблюдался в пуповинной крови у новорожденных детей и на первом году жизни, постепенно снижаясь в более поздние возрастные периоды. Высокий уровень АОА совпадает, следовательно, с максимальной скоростью роста, наблюдающейся в этот возрастной период как у детей, так и у экспериментальных животных [276].

Изучение клеточных популяций печени и тимуса крыс с помощью проточной цитометрии показало, что скорость клеточной пролиферации (относительная доля делящихся клеток) в обоих изученных органах была максимальной у новорожденных животных, снижалась с возрастом, причем уменьшение числа делящихся клеток было намного более выраженным в тимусе, чем в печени, и коррелировала с АОА. Наиболее высокая достоверная корреляция выявлена между АОА сыворотки крови и наиболее быстро делящимися клеточными популяциями — лимфоцитами печени (г = 0,815, р<0,001, п=30) и делящимися клетками тимуса (г = 0,789, р<0,001, п=30), что подтверждает выдвинутое нами предположение о связи высокой АОА с пролиферативной активностью: показатели клеточной пролиферации были особенно высоки в раннем возрастном периоде, характеризующемся максимальной скоростью роста. Можно предположить, что высокая АОА может играть регуляторную роль в стимулировании процессов пролиферации и смещении равновесия в сторону их преобладания над процессами апоптоза и дифференцировки. Мы не располагаем конкретными данными относительно влияния СРО на соотношение процессов пролиферации и дифференцировки, однако, можно преположить, что механизм данного явления связан с липопротеидными комплексами, участвующими, по нашим данным, в формировании АОС крови (глава 3.1), а именно ЛПВП и ЛПНП. Как уже было отмечено, оЛПНП могут тормозить процессы клеточной пролиферации [117, 118, 359] и вызывать апоптоз эндотелиальных клеток в культуре, увеличивая концентрацию внутриклеточного кальция, тогда как для нативных форм другого вида липопротеинов — ЛПВП, напротив, показана способность защищать эти клетки от апоптоза [318] и стимулировать процессы клеточной пролиферации в ряде клеточных популяций. Для этих процессов требуется внеклеточный кальций и изменение внутриклеточного pH [261, 323]. В пролиферирующих эндотелиальных клетках ЛПВП стимулируют также РКС-зависимое фосфорилирование белка теплового шока 27 кДа [132]. ЛПВП могут противостоять способности оЛПНП стимулировать апоптоз путем непосредственного влияния на сигнальные пути эндотелиальной клетки, что подтверждается исследованиями^ которых предварительная совместная инкубация ЛПВП с оЛПНП не снижала проапоптотического действия оЛПНП [323].

АОА у подклассов ЛПВП, особенно 2-го и 3-го связывают с наличием собственных антиоксидантных ферментов ЛПВП — параоксоназы-1 [148] и др. [175, 330], антиоксидатной активности, присущей апоА-1 [254], и липидному компоненту ЛПВП, а именно переносимым этим липопротеином фосфолипидам, компонентами которых являются ПНЖК, причем АОА фосфолипидов увеличивается с ростом степени ненасыщенности и длины углеродной цепи ПНЖК, входящих в состав фосфолипидов [30, 52,62].

Важно подчеркнуть, что антиапоптотической активностью может обладать именно липидный компонент ЛПВП, поскольку их защитный эффект, как показано, не зависел ни от антиоксидантного фермента параоксоназы, ни от действия апоА-1, ни от влияния на захват клетками оЛПНП [258, 323]. Данные о том, что липидная фракция ЛПВП может увеличивать в эндотелиальных клетках внутриклеточную концентрацию кальция, который регулирует такие ключевые процессы как пролиферация, апоптоз, синтез простагландинов иЖ) [189, 261].

Наряду с уже упомянутыми обычными фосфолипидами, АОА в липидной фракции ЛПВП могут обладать плазмалогены, в состав которых также входят длинноцепочечные ПНЖК и количество которых в клеточных мембранах может достигать 30% от суммы всех фосфолипидов [35].

Известны данные о стимулирующем действии на рост злокачественных опухолей молочной железы со-6 ПНЖК: ЛК, АК и образующихся из нее эйкозаноидов (ПГЕ2, ЛТВ4, 12-НЕТЕ) [293]. Увеличение потребления со-3 ПНЖК приводило к снижению в организме уровня со-6 ПНЖК и их активных метаболитов и тормозило пролиферацию данного вида опухолей [101, 102]. В то же время, при раке простаты данные о роли со-6 и со-3 ПНЖК в прогрессировании заболевания противоречивы. По одним данным рост пролиферации опухоли связан с повышенным потреблением общего жира и со-6 ПНЖК [101, 102, 293], по другим — прямо пропорционален потреблению а-линоленовой кислоты со-3 семейства ПНЖК [293]. Как было упомянуто выше, ДЦ ПНЖК как со-6 (АК), так и со-3 семейства (ДГК) в составе фосфолипидов и ЛП крови обладают АОА (раздел З.1.), которая максимальна в период активного роста у человека и экспериментальных животных и коррелирует с высокой пролиферативной активностью клеток печени и тимуса у крыс. Литературные данные о стимулирующем действии со-6 ПНЖК на пролиферативную активность злокачественных опухолей молочной железы и простаты косвенно подтверждают вывод, сделанный нами в разделах 3.1.-3.5. о роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА и регуляции процессов пролиферации в организме человека и животных.

Другим липидным компонентом, регулирующим клеточный цикл, могут быть сфинголипиды. ]^ег а1. [258] сообщили, что выделенные из ЛПВП лизосульфатид и сфингозилфосфорилхолин активируют фосфоинозитол-специфическую фосфолипазу С в фибробластах и способствуют клеточной пролиферации. Однако не ясно, влияют ли сфинголипиды на АОА ЛПВП.

Другой точкой зрения на проблему связи АОА с процессами пролиферации является точка зрения Е. Б. Бурлаковой и соавт. [1], наблюдавших увеличение АОА клеточных липидов в период прохождения клеткой фазы [1]. Авторы трактовали полученные результаты в свете представлений о важной роли липидов для построения клеточных мембран и определения их физико-химических свойств. Поскольку АОА является отражением именно физико-химических свойств липидных компонентов, ее изменение могло быть связано с теми процессами, которые происходят на мембранных структурах, в частности с образованием комплекса нуклеопротеидов с липопротеидами мембран, необходимого для репликации ДНК [1]. Важно подчеркнуть, что по данным литературы АОА обладают в первую очередь представители именно со-3 класса, как наиболее длинноцепочечные и ненасыщенные представители жирных кислот [30, 52, 103, 202]. Именно их встраивание в клеточные мембраны может изменять физико-химические свойства последних, способствуя максимально эффективной передаче сигналов, стимулирующих пролиферативные процессы в клетках.

И, наконец, можно предположить, что для делящихся в период активного роста организма клеток необходимо большое количество ДЦ ПНЖК, а именно АК и ДГК, входящих в состав фосфолипидов клеточных мембран. Эти ДЦ ПНЖК в то же время обладают АОА в составе фосфолипидов. Таким образом, ДЦ ПНЖК в период активного роста могут выполнять множественные функции: быть «строительным материалом» для мембран новых клеток, обладать защитными свойствами в отношении СРО и стимулировать рост путем ускорения прохождения клеткой фазы 01.

В предыдущих разделах была показана роль ПНЖК в формировании АОА крови. В то же время, эти соединения являются основным субстратом ПОЛ. Таким образом, со-3 ПНЖК, с одной стороны, выступают в качестве субстратов ПОЛ, с другой стороны, участвуют в формировании АО потенциала. Более того, сложные метаболические взаимоотношения, в которых участвуют со-3 ПНЖК, дополняются еще одной группой метаболических реакций: ПНЖК являются предшественниками различных классов эй козаи докозаноидов, причем их образование включает в качестве промежуточных метаболитов продукты ПОЛ [342].

Многообразие путей как превращения ПНЖК, так и путей образования и превращения различных видов эйкозаноидов (лейкотриенов, ЛТ), позволяет предполагать возможность их реципрокных взаимоотношений, вытекающих из факта единого источника этих метаболических путей — пула со-3 и со-6 ПНЖК, образующихся в результате их поступления с пищей и освобождения из тканевых депо. Несмотря на всю очевидность данных представлений, эта гипотеза не была рассмотрена ранее в литературе. В связи с этим в работе была проведена оценка данной гипотезы, включающая исследование спектра ЛТ с параллельной оценкой одного из показателей ПОЛ — МДА и АОА крови у условно здоровых детей, детей с бронхиальной астмой (БА) и ожирением.

Пути образования различных серий ЛТ из со-6 и со-3 ПНЖК изучены в ряде работ [116, 221, 251]. Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим мы провели детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особое внимание было обращено на выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.

Было установлено, что основным классом ЛТ, образуемых лейкоцитами здоровых детей, является производное ЭПК — ЛТД5, количество которого превышает уровень всех других изученных нами видов ЛТ. Этот факт согласуется с обнаруженным высоким содержанием со-3 ПНЖК и, в особенности ЭПК, в мембранах лейкоцитов здоровых детей (раздел З.7.). Обращает на себя внимание также отсутствие образования лейкоцитами здоровых детей лте4.

Изучение указанных показателей у детей, получавших диету с неоптимальным уровнем ПНЖК в условиях санатория, выявило снижение у них в крови уровня МДА и АОА. Обогащение диеты детей со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира вело к изменениям спектра ЛТ, направленным в сторону приближения их к спектру и уровню, наблюдаемому у здоровых детей: рост ЛТД5, снижение ЛТД4, С4, В4. Уровень ЛТД5 у детей группы сравнения, получавших капсулы с подсолнечным маслом, напротив, снижался, в то время как уровень лтд4 у них возрастал.

Следует подчеркнуть, что по данным ряда авторов [68, 177, 334], повышенное поступление ПНЖК с пищей в организм детей может привести к усилению ПОЛ. Полученные нами данные не выявили, однако, существенного изменения интенсивности ПОЛ на фоне приема дополнительных количеств со-3 ПНЖК, но, напротив, показали, что дополнительный прием со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира, богатого ДЦ ПНЖК, сдерживает тенденцию к росту ПОЛ, наблюдающуюся у детей группы сравнения, не получавших рыбий жир, и ведет к некоторому увеличению суммарной АОА сыворотки крови. Можно полагать, что потребление ПНЖК со-6 семейства в составе капсул с подсолнечным маслом детьми группы сравнения позволяет повысить уровень субстрата ты.

ПОЛ в организме с увеличением образования его конечного продукта МДА, тогда как потребление ПНЖК со-3 семейства в составе рыбьего жира обогащает организм детей длинноцепочечными ПНЖК, которые влияют на увеличение суммарной АОА их сыворотки крови.

Сопоставление данных о продукции ЛТ и ПОЛ показало, что реципрокные отношения между уровнем ПОЛ и образованием ЛТ у детей, обследованных в санатории, наблюдаются на уровне тенденции. В то же время полученные данные говорят о том, что такие отношения существуют между ЛТ различных серий (4 и 5) и ЛТ различных видов (В, С, Д и др.). Так, при увеличении уровня образования ЛТД5 снижается уровень образования ЛТД4 При росте уровня ЛТД4 наблюдается снижение уровней ЛТС4 и ЛТВ4. При снижении уровня сульфидопептидного ЛТД5 наблюдается рост несульфидопептидного ЛТВ5.

Таким образом, при умеренной стимуляции синтеза ЛТ в организме обследованных в санатории детей под влиянием рыбьего жира реципрокные отношения между ПОЛ и образованием ЛТ выявлены не были. В то же время реципрокные отношения были выявлены в условиях резкого усиления синтеза ЛТ при воспалительном заболевании (БА) и ожирении.

Установлено, что при Б, А имело место нарастание продукции всех видов ЛТ при преимущественном увеличении уровня сульфидопептидных ЛТ и, особенно, ЛТС4 и ЛТЕ4 (р=0,018) — провоспалительных метаболитов арахидоновой кислоты ПНЖК со-6 семейства.

Изменения в спектре ЛТ у детей с БА различной степени тяжести согласуются с выводами, сделанными при изучении изменений спектра ЛТ под влиянием дополнительного приема со-3 ПНЖК в составе рыбьего жира условно здоровыми детьми школьного возраста о реципрокности продукции различных семейств и классов ЛТ. Эти сложные отношения могут оказывать влияние на клиническое течение и эффективность терапии различных заболеваний и, в частности, БА. Поэтому их необходимо учитывать при назначении фармпрепаратов, влияющих на образование ЛТ, но не оказывающих влияние на обеспеченность организма ДЦ ПНЖК.

У детей с БА выявлено достоверное снижение уровня МДА в сыворотке крови при всех формах БА, которое может быть отражением реципрокных отношений между метаболизмом ПНЖК по липоксигеназному и перекисному пути. Учитывая роль ПОЛ в таких ключевых процессах жизнедеятельности как иммунный ответ, клеточная пролиферация, дифференцировка, апоптоз и др. [272, 295], обнаруженные данные о снижении уровня МДА, указывающие на снижение интенсивности ПОЛ, свидетельствуют, очевидно, о неблагоприятном изменении в соотношении путей метаболизма ПНЖК. Полученные данные указывают на необходимость пересмотра подхода к антиоксидантной терапии при БА. Можно полагать, что патогенетически более оправданным подходом может служить не назначение антиоксидантов, а коррекция ЖК состава рациона.

Параллельное изучение АОА крови у детей с БА выявило снижение суммарной АОА у детей с легкой БА, не получавших медикаментозного лечения, что, по-видимому, отражает низкий уровень в организме ДЦ ПНЖК, в первую очередь, АК и ЭПК, израсходованных на усиленное образование ЛТ 4 и 5 серии при данном заболевании.

Напротив, при средне-тяжелой форме заболевания АОА сыворотки крови была увеличена, что может быть связано с положительными сдвигами в ЖК составе клеточных мембран у больных БА под влиянием мембраностабилизирующего действия кромогликатов.

Таким образом, полученные нами данные о снижении уровня МДА и повышении АОА крови, по-видимому, могут рассматриваться не как доказательство отсутствия вклада неконтролируемого свободно-радикального окисления в развитие БА, а как свидетельство исчерпания запасов субстрата ПОЛ — ПНЖК, особенно легкоокисляемых.

АК и со-3 ПНЖК, связанного с их расходом на синтез ЛТ и других эйкозаноидов, образующихся на развернутом этапе течения БА.

В связи с этим, заслуживают особого, внимания данные, полученные при использовании льняного масла в дополнение к базисной терапии БА. При этом были выявлены более благоприятные тенденции, чем при использовании только базисной терапии, а именно наблюдалось подавление образования провоспалительных медиаторов аллергии — ЛТ 4-ой серии и увеличение содержания противовоспалительных медиаторов ЛТ 5-ой серии.

Прием льняного масла вызывал тенденцию к нормализации уровня ПОЛ (содержание МДА увеличивалось и приближалось к нормальным значениям) и увеличению АОА. В группе детей с БА, получавших только базисную терапию, не удалось добиться нормализации ПОЛ, которое продолжало снижаться.

Таким образом, проведенные исследования позволили впервые получить комплекс данных об образовании важного класса метаболитов со-6 и ю-3 ПНЖК — ЛТ 4-ой и 5-ой серии, соотношении интенсивности ПОЛ и АОА в крови детей с БА легкой, средне-тяжелой и тяжелой степени. Проведенный анализ указывает на достаточно сложный характер изменений в метаболизме ПНЖК при БА у детей. В частности, выявлено нарастание продукции всех ЛТ при преимущественном увеличении уровня сульфидопептидных ЛТ и особенно С4 и Е4 — провоспалительных ЛТ 4-ой серии. Именно с этим можно связать уменьшение образования МДА, одним из основных предшественников которого является АК, расходуемая при БА на образование лтс4 и Е4.

При использовании льняного масла в качестве дополнительного источника со-3 ПНЖК в рационе больных БА наблюдалось увеличение уровня МДА до его уровня в контрольной группе детей и изменение в соотношении ЛТ крови — снижение уровня провоспалительных ЛТ и рост противовоспалительных ЛТ. Таким образом при обогащении рациона ю-3 ПНЖК у больных с хроническим аллергическим воспалением имеют место реципрокные отношения между процессами ПОЛ (увеличение уровня МДА) и уровнем провоспалительных ЛТ 4 серии, в особенности ЛТ С4 и В4- Сниженный уровень МДА при БА у детей может являться биомаркером увеличения продукции провоспалительных ЛТ при аллергическом воспалении.

Изучение тех же показателей, что были изучены у детей с БА, у детей с ожирением, выявило повышенное образование в лейкоцитах провоспалительного ЛТ04, являющегося констриктором гладкой мускулатуры сосудов, кишечника и др. органов [180, 221, 222], и возможно, участвующего в развитии дискинезии желчного пузыря, выявленной у значительного числа обследованных больных. При этом у детей с ожирением отсутствует ЛТБз, что связано, возможно, с недостаточным поступлением ПНЖК, в особенности со-3 класса, в составе их рациона.

Изучение показателей ПОЛ и антиоксидантного статуса выявило снижение на 38% образования МДА в сыворотке крови у детей с ожирением по сравнению со здоровыми детьми. Суммарная АОА сыворотки крови при этом также имела тенденцию к снижению.

Данные, полученные нами у детей с ожирением, указывают, следовательно, на снижение процессов ПОЛ при увеличении уровня образования провоспалительных лейкотриенов 4 серии и, наряду с приведенными данными обследования детей с БА, подтверждают гипотезу о реципрокности основных путей метаболизма ПНЖК.

Увеличение уровня ЛТБ4 в крови детей с ожирением в сочетании со снижением уровня МДА может служить биомаркером метаболизма ПНЖК по липоксигеназному пути и свидетельствовать о наличии воспалительного процесса в организме детей с ожирением.

Приведенные данные об участии ДЦ ПНЖК в формировании АОС и процессах ПОЛ и образовании эйкозаноидов позволили предположить, что изменения в продукции данных соединений отразятся на уровне ПНЖК в клеточных мембранах. В связи с этим нами было проведено изучение спектра жирных кислот мембран клеток крови при различных видах воспаления — патологического процесса, для которого характерно резкое увеличение продукции различных провоспалительных медиаторов [15].

Было установлено, что в мембранах эритроцитов (МЭ) детей с воспалительными заболеваниями ЖКТ (ВЗЖКТ) наблюдается достоверное повышение по сравнению со здоровыми детьми содержания среднецепочечных жирных кислот — лауриновой (12:0), миристиновой (14:0), мононенасыщенной миристоолеиновой (14:1) и тенденция к повышению уровня пентадекановой (15:0), пальмитиновой (16:0) и пальмитолеиновой (16:1), гептадеценовой (17:1) и олеиновой (18:1) жирных кислот.

Одновременно наблюдалось резкое и достоверное снижение уровня ПНЖК семейства со-6 — эссенциальной линолевой кислоты (18:2) и ее метаболитов: арахидоновой кислоты (20:4) — основной ПНЖК клеточных мембран, и предшественницы АК в метаболическом ряду со-6 ПНЖК — дигомо-гамма-линоленовой кислоты (20:3). Это вело к резкому и достоверному снижению суммы со-6 ПНЖК в МЭ детей, страдающих ВЗЖКТ. При этом наблюдались полярные изменения уровня со-3 ПНЖК — резкое увеличение содержания в МЭ эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) (20:5) семейства со-3 и эссенциальной со-3 ПНЖК — а-линоленовой (18:3) кислоты, что вело к повышению суммарного содержания со-3 ПНЖК в МЭ. Однако одновременно имело место снижение содержания в МЭ докозагексаеновой кислоты (ДГК) (22:6 со-3).

Это вело к резкому повышению отношения ЭПК/ДГК (с 1,5 у здоровых до 12,6 у больных детей). В результате отмеченных изменений в уровне со-6 и со-3 ПНЖК у детей с ВЗЖКТ резко (в 3,7 раза) снизилось по сравнению со здоровыми детьми соотношение в МЭ ПНЖК со-6 и со-3, которое составило у них 0,7 против 2,6 у здоровых детей. Одновременно при воспалении в МЭ резко снижался коэффициент эффективности метаболизации (КЭМ) (0,21 — у больных против 1,2 — у здоровых) и менее значительноиндекс ненасыщенности (1,15 — при воспалении, 1,3 — у здоровых детей) [27]. Изменение этих индексов указывает на изменение физико-химических характеристик мембран и позволяет предполагать снижение их жидкостности, пластичности и текучести вследствие снижения степени ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав мембран, и уровня длинноцепочечных производных эссенциальных ПНЖК таких, как АК и ДГК [54, 332].

Таким образом, ВЗЖКТ сопровождаются значительным изменением жирнокислотного состава МЭ, которое, возможно, связано с увеличением образования в организме провоспалительных эйкозаноидов и торможением превращения ЭПК в ДГК, аналогичным обнаруженному нами у недоношенных детей. Это в свою очередь может вести к изменению функции клеточных и субклеточных мембран, играющих важную роль в патогенезе болезней ЖКТ [43, 54, 332, 301].

В пользу патогенетической значимости выявленных нарушений состава жирных кислот МЭ говорят результаты изучения состава жирных кислот МЭ у детей с ВЗЖКТ в сочетании с ожирением — заболеванием, которое характеризуется резкими нарушениями метаболизма.

В МЭ крови детей с ожирением сохраняются те же тенденции, что и при ВЗЖКТ у детей с нормальной массой тела, а именно увеличение доли насыщенных жирных кислот и изменение соотношения со-6 и со-3 ПНЖК с резким и достоверным снижением содержания ПНЖК со-6 семейства и параллельным увеличением ПНЖК со-3 семейства в первую очередь, ЭПК и а-линоленовой кислоты. В то же время, также как и в случае ВЗЖКТ, наблюдалось достоверное снижение в МЭ уровня ДГК со-3 семейства. Однако при ожирении, в сочетании с ВЗЖКТ, все выявленные изменения носили менее выраженный характер, чем при ВЗЖКТ у детей с нормальной массой тела. Следовательно, степень нарушений метаболизма жирных кислот при ВЗЖКТ у детей является столь значительной, что на них не могут заметно повлиять даже такие существенные метаболические сдвиги, какие имеют место при ожирении.

При изучении ЖК состава мембран другого типа клеток (лейкоцитов) при другом виде воспаления — хроническом аллергическом воспалении, имеющем место при БА, выявлено значительное и достоверное увеличение уровня ЭПК в мембранах лейкоцитов (МЛ), сопровождавшееся тенденцией к накоплению а-линоленовой кислоты и суммы ПНЖК со-3 семейства и тенденцией к снижению ДГК (22:6 со-3) и ПНЖК со-6 семейства. При этом отношение со-6/со-З ПНЖК в МЛ при БА было снижено в 2 раза (0,39 у больных БА против 0,79 у здоровых детей), а отношение ЭПК/ДГК, напротив, резко возрастало (26,8 при БА против 6,0 у здоровых детей), что приводило к росту индекса ненасыщенности (1,23 — при БА, 0,72 — у здоровых детей), но КЭМ при этом снижался (0,06 — у больных против 0,13 — у здоровых).

Таким образом, полученные результаты показывают, что и воспалительные заболевания ЖКТ, и хроническое аллергическое воспаление при БА, приводят к значительным и сходным изменениям состава жирных кислот клеточных мембраннакоплению ЭПК и снижению уровня ДГК. Этот феномен был выявлен и в МЭ, и в МЛ, которые были избраны в качестве моделей клеток, существенно различающихся по своим функциональным и метаболическим особенностям. Эритроциты представляют собой высокодифференцированные клетки, лишенные ядра и неспособные к делению, с ограниченной метаболической активностью, тогда как лейкоциты являются примером клеток, способных как к клеточному делению, так и к дифференцировке в различные типы клеток иммунного ответа под влиянием стимулов и сигналов воспаления. Однако, несмотря на существенные функциональные различия этих клеток, изменения, происходящие в их мембранах при воспалении, имели много общих признаков, к числу которых, в первую очередь, следует отнести накопление в мембранах ЭПК со-3 семейства и снижение уровня ее длинноцепочечного производного ДГК (22:6 со-3) с увеличением отношения ЭПК/ДГК в 4−8 раз. Увеличение этого отношения говорит о торможении процесса метаболизации ЭПК в ее длинноцепочечные производные, что подтверждается накоплением в мембранах предшественника ЭПК — эссенциальной а-линоленовой кислоты (18:3) со-3 семейства. Рост в МЭ и МЛ уровня ЭПК и а-линоленовой кислоты приводил к увеличению в них суммы со-3 ПНЖК и снижению отношения со-6/со-З. Последнее усугублялось драматическим снижением, особенно в МЭ, уровня оо-б ПНЖК. В МЭ особенно заметным было снижение уровня основной со-6 ПНЖК МЭ — арахидоновой кислоты (20:4), сопряженное с достоверным снижением содержания в МЭ ее предшественников — эссенциальной линолевой (18:2) и дигомо-гамма-линоленовой (20:3) кислот. Таким образом, проведенные исследования позволили впервые выявить резкие изменения состава жирных кислот клеточных мембран, характеризующиеся торможением превращения ЭПК в ДГК, возникающим при воспалении, аналогичные выявленным нами изменениям ЖК состава плазмы крови у недоношенных детей. В качестве рабочих гипотез причин выявленных изменений могут быть рассмотрены следующие.

Недостаток в составе клеточных мембран арахидоновой кислоты (АК, 20:4), может возникать вследствие недостаточного поступления ее в организм с рациономсниженной метаболизации эссенциальной ПНЖК (линолевой) или повышенного расхода на образование провоспалительных эйкозаноидов (в частности, ЛТ). Дефицит АК в составе клеточных мембран восполняется за счет производных со-3 семейства, а именно ЭПК (20:5), что сопровождается торможением ее метаболизации в длинноцепочечные производные, и, в частности, в ДГК (22:6), которая выполняет важные функции в организме, в особенности, у детей. К ним относятся: пластическая, заключающаяся в участии в построении мембран клеток головного мозга и зрительного анализатора, а также в построении так называемых аннулярных фосфолипидов [27, 32], и защитная, связанная с образованием из ДГК резолвинов и протектинов, — соединений, принимающих активное участие в репаративных процессах в поврежденной клетке [83, 168, 248, 301]. Кроме того, можно полагать, что накопление ЭПК в клеточных мембранах в процессе воспаления является причиной снижения образования из нее противоспалительных эйкозаноидов, в частности лейкотриена Д5, выявленное нами у детей с ожирением (раздел З.6.4.). Таким образом, изменение состава жирных кислот клеточных мембран при воспалении может вести к снижению способности клеток образовывать вещества, обладающие защитными и репаративными свойствами, что, очевидно, может способствовать хронизации и рецидивирующему характеру течения воспалительного процесса [9, 83].

Изменение состава жирных кислот клеточных мембран при воспалении может оказывать существенное влияние и на свойства и функции самой мембраны. Так, в работе [41], авторами изучено влияние жирнокислотного состава рациона экспериментальных животных на спектр жирных кислот митохондриальных мембран и их функциональные свойства, в частности, показатели, характеризующие состояние дыхательной цепи митохондрий: скорость переноса электронов в основной цепи (на внутренней мембране митохондрий), скорость окисления по нефосфорилирующему пути (во внешних мембранах митохондрий), а также количество переносчиков и их стехиометрия. Было выявлено снижение скорости окисления во внутренних мембранах митохондрий у животных, получавших те виды жира, потребление которых приводило к снижению уровня арахидоновой кислоты в митохондриальных мембранах. В то же время наблюдалась активация внешнего пути переноса электронов и увеличение количества цитохромов Ьз с и, а и изменение пропорции цитохрома Ьз по отношению к цитохрому а, что подтверждает факт активации внешнего пути транспорта электронов у животных, и является, по-видимому, своеобразной адаптационной реакцией на изменения состава жирных кислот, поступающих с рационом. Таким образом, изменения жирнокислотного состава рациона могут влиять не только на клеточные мембраны, но и на мембраны субклеточных структур В связи с этим можно предполагать, что существенные изменения состава жирных кислот клеточных мембран, выявленные нами при различных видах воспаления, существенно меняют их функциональные свойства, что может являться важным патогенетическим звеном указанных заболеваний, требующим специфического терапевтического подхода и, в частности, использование диетотерапии. С этой точки зрения, полученные результаты могут рассматриваться как указание на необходимость дальнейшего изучения вопроса об оптимальном соотношении в диетических рационах ео-3 и со-6 ПНЖК как патогенетически обоснованном дополнительном подходе к терапии воспалительных заболеваний у детей.

Проведенные исследования позволили нам впервые выявить ряд новых особенностей трех направлений метаболизма ПНЖК: участие в формировании АО потенциала, образование ЛТ и построение биомембран. С помощью разных методических подходов была доказана роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные со-3 и со-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного потенциала крови. Антиоксидантные свойства со-3 ПНЖК были доказаны также при изучении их влияния на показатели ПОЛ и АОА крови у беременных женщин с преэклампсией (ПЭ) и недоношенных детей. При изучении возрастных особенностей АОА крови было показано, что в ее реализации принимают участие высокомолекулярные липопротеидные комплексы, но не ТФ и ЦП. При этом максимальная АОА крови наблюдалась у новорожденных детей. Эти данные были подтверждены в опытах на экспериментальных животных. Проведенные исследования позволили подтвердить гипотезу об участии системы ПОЛ/АОА в клеточной пролиферации, на что указывает высокая положительная корреляция скорости клеточной пролиферации и АОА крови. Изучение трех направлений метаболизма ПНЖК: участие в формировании АО потенциала, образование ЛТ и построение биомембран позволили сделать вывод о существовании реципрокных отношений между указанными путями их метаболизма. Впервые выявлен феномен накопления в крови и мембранах клеток крови эйкозапентаеновой кислоты в сочетании со снижением уровня докозагексаеновой кислоты и со-6 ПНЖК в условиях недостаточной обеспеченности детей ПНЖК, выявленной при обследовании недоношенных детей и детей с различными типами воспалительных заболеваний — аллергическом воспалении при БА и альтеративно-экссудативном при ВЗЖКТ).

Полученные в работе данные используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин и могут служить основой для разработки диетотерапии болезней детского возраста, основанной на коррекции жирнокислотного состава рационов. Проведенные исследования позволяют заключить, что антиоксидантная активность, уровень МДА как показатель интенсивности ПОЛ, образование лейкотриенов в крови и жирнокислотный состав мембран могут служить биомаркерами метаболизма ПНЖК в организме детей и беременных женщин.