Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями

Диссертация: Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В результате, мы определили статистически достоверное отличие по нескольким признакам — снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей, снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей, нарушение ходьбы на пятках, синдром дряблых предплечий, крыловидные лопатки и возраст дебюта более 5 лет — для группы больных с мутациями в гене CAPN3. Для других двух исследуемых групп… Читать ещё >

Содержание

  • Список использованных сокращений

Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Научная новизна.7.

Практическая значимость.8.

Положения, выносимые на защиту.9.

Апробация работы.9.

Глава I.10.

I Обзор литературы.10.

1.1 Распространенность и* систематика прогрессирующих мышечных дистрофий.10.

1.2 Взаимодействие белков, участвующих в процессе мышечного сокращения.20.

1.2.1 Структура мышечного волокна.20.

1.2.2 Функция белка кальпаина 3 в мышечной клетке.264.

1.2.3 Функция фукутин-связанного белка в мышечной клетке.30.

1.3 Этиопатогенез' ПКМД с АР типом наследования, обусловленных мутациями в генах ферментов.331.3.1 Этиология ПКМД2А типа.34.

1.3.2 Этиология ПКМД 21 типа.37.

1.4 Клиническая картина ферментопатий при ПКМД с АР типом наследования.39 >

1.4.1 Характеристика ПКМД.39.

1.4.2 Клиническая характеристика ПКМД2А типа.41.

1.4.3 Клиническая характеристика ПКМД21 типа.43.

выводы.

1. Установлен вклад мутаций генов САРИЗ и РКЯР, обуславливающих развитие ферментопатий, в структуру изолированных ПКМД в РФ. В выборке из 74 больных мутации гена САРЫЗ явились причиной заболевания у 32 пациентов (43%). У семи пациентов (9%) выявлены мутации гена РКЯР.

2. В гене САРЫЗ обнаружены «горячие» экзоны, информативность диагностики которых составляет 100%. Обнаружены две частые мутации: с.550с!е1А, с.598 612с!е1, информативность диагностики которых составляет более 81%, среди больных ПКМД2А типа. Разработаны эффективные методы диагностики «горячих» экзонов гена САРЫЗ — методом прямого автоматического секвенирования, двух частых мутаций — методом ПДАФ-анализа.

3. В гене РКЯР обнаружена частая мутация с.826С>А, выявленная в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии у четырех из семи больных ПКМД21 типа на 50% хромосом с данной мутацией. Показано, что для анализа мутаций при ПКМД21 типа эффективен метод прямого автоматического секвенирования.

4. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.550ёе!А гена С, А РИЗ, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя. Время распространения мутации составляет 1700±500 лет. Анализ гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель с.826С>А гена РКЯР, показал, что причиной высокой частоты данной мутации является эффект основателя.

5. Проведен сравнительный анализ частот встречаемости 37 клинических симптомов в трех группах больных с ПКМД2А, ПКМД21 типов и неустановленной формой заболевания. Показано отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию этих генетических вариантов только на клиническом уровне.

6. Разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования больных наследственными ферментопатиями с клиникой изолированной ПКМД, определяющий последовательность анализа мутаций генов САРИЗ и РКЯР. Предложенный алгоритм позволит значительно снизить экономические и временные затраты при проведении диагностики ПКМД в РФ.

Список публикаций по теме диссертационной работы:

1. Рыжкова О. П., Дадали Е. Л., Щагина О. А., Поляков А. В., Молекулярно-генетическое исследование российских больных с наиболее частыми поясно-конечностными мышечными дистрофиями / Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. — 2010. — Т., прил. к № 5. — С. 155.

2. Ryzhkova О. P., Dadali Е. L., Scagina О. A., Rudenskaya G. Е., Polyakov.

A. V., The age of mutation c.550delA in CAPN3 gene / European Human Genetics Conference 2010, June 12 — 15, 2010, Gothenburg, Sweden //European J. ofHum.Gen.-2010.-V.18, supp.l.-P.132.

3. Рыжкова О. П., Причина распространенности мутации c.550delA в РФ // Медицинская генетика. — 2009. — Т. 8, № 12. — С. 36−37.

4. Ryzhkova, G. Rudenskaya, Е. Dadaly, О. Schagina, A. PolyakovCAPN3 mutations in Russian patients with limb-girdle muscular dystrophy, type 2A // European journal of human genetics — 2009 — PI 6.46.

5. Дадали E.JI., Щагина О. А., Рыжкова О. П., Руденская Г. Е., Федотов.

B.П., Поляков А. В. Клинико-генетическая характеристика кальпаинопатий у российских больных // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн.-2010.-Вып. 14. С. 83−91.

6. Дадали Е. Л., Щагина О. А., Рыжкова О. П., Руденская Г. Е., Федотов В. П., Поляков А. В. Особенности клинических проявлений поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии типа 2А у российских больных // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. — 2010. — № 4. — С. 79−83.

7. Дадали Е. Л., Щагина O.A., Тибуркова Т. Б., Рыжкова О. П., Иванова Е. А., Поляков A.B. Особенности клинических проявлений и алгоритмы молекулярно-генетической диагностики генетически гетерогенных вариантов наследственных прогрессирующих мышечных дистрофий // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике/ под ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн. — 2010. — Вып. 14. — С. 174−183.

8. Рыжкова О. П., Билева Д. С., Дадали Е. Л., Щагина O.A., Шаркова И. В, Поляков A.B. Клинико-генетические характеристики поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии 2А типа // Медицинская генетика. — 2010. — T. l 1, 1. — С. 3−10.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В результате молекулярно-генетичеекого исследования двух генов, являющихся причиной распространенных ферментопатий с клиникой изолированной ПКМД, выборке больных проживающих на территории РФ, были выявлены частоты и спектр мутаций генов САРЫЗ и ЕКЛР.

Установлено, что мутации гена САРЫЗ, обуславливают около 43% ПКМД, что согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена САРЫЗ в структуру заболеваемости изолированной ПКМД оценивается в Европе в 3040%. Мутации выявлены у 32 больных из 74 на 61 хромосоме. У трех больных выявлена только одна мутация в гетерозиготном состоянии, однако, наличие мутации и клиники позволяет предполагать, что причиной заболевания является именно изменения в гене САРЫЗ.

При анализе изменений нуклеотидной последовательности гена САРИЗ, выявленных в выборке больных из РФ, было установлено, что мутации встречаются на веем протяжении гена, однако, существуют «горячие» экзоны, мутации в которых встречаются чаще. В нашей выборке такими экзонами являются 1, 4, 5, 8, 10, 11, 20, 21, 22. В нашем исследовании на данные экзоны приходилось 53 из 61 всех «мутантных» хромосом, что составило 86,9%. При молекулярно-генетической диагностике «горячих» экзонов гена САРЫЗ нами была обнаружена хотя бы одна из «мутантных» хромосом у всех больных. Обе «мутантные» хромосомы при данном анализе обнаружены у 22 из 32 больных ПКМД2А (68,8%).

В гене САРЫЗ выявлены две частые мутации с.550с1е1А и с.598 612с1е1, явившиеся причиной заболевания у 26 из 74 больных (35,1%). Мутация с.598 612с!е1 встретилась у 4 из 74 больных (5,4%) на 4 хромосомах. Мутация с.550с!е1А встретилась у 23 из 74 (31,2%) на 30 хромосомах в гомозиготном, компаунд-гетерозиготном и гетерозиготном состоянии. Разработана система диагностики двух частых мутаций методом ПДАФ-анализа, информативность которой, среди всех больных ПКМД, составляет около 11%.

Для установления природы высокой частоты мутации c.550delA были проанализированы гаплотипы 23 хромосом с данной заменой с использованием семи микросаттелитных маркеров. Мы обнаружили неравновесие по сцеплению для 6 из 7 этих маркеров, из чего сделали вывод, что причиной столь высокой частоты этой мутации является эффект основателя. На основе проведенного анализа неравновесия по сцеплению аллелей полиморфных маркеров с заболеванием нам удалось определить гаплотип хромосомы, на которой произошла мутация. Наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя D15S994 — D15S968 -D15S514 — D15S779 — CAPN3(mut) — D15S780 — D15S778 — D15S659: 5−5-7−9-CAPN3(mut) -4−6-7. Мы оценили период времени за который произошло размывание вследствие рекомбинаций гаплотипа предковой хромосомы. Для этого мы использовали подход, предложенный Risch с соавторами (Risch et al., 1995). Полученная нами оценка времени, за которое произошло распространение мутации — около 1700 лет, что не противоречит историческим данным.

Мутации гена FKRP, как и предполагалось, обуславливают около 10% ПКМД, что согласуется с данными других авторов, по которым вклад гена FKRP в структуру заболеваемости изолированной ПКМД оценивается в Европе в 10−25%. Мутации выявлены у 7 больных из 74 на 12 хромосомах. У двух больных выявлена только одна мутация в гетерозиготном состоянии, однако, наличие мутации и клиники позволяет предполагать, что причиной заболевания является именно изменения в гене FKRP.

У четырех больных (5,4%) причиной заболевания явилась одна и та же миссенс мутация единственного кодирующего экзона 4 — Leu276Ile (с.826С>А) в гомозиготном или компаунд гетерозиготном состоянии. Данная замена встретилась на половине мутантных хромосом. Для установления природы высокой частоты данной мутации были проанализированы гаплотипы всех 6 хромосом с данной заменой с использованием пяти микросаттелитных маркеров, а так же одного внутригенного SNP. На основе проведенного анализа нам удалось определить гаплотип хромосомы, на которой произошла мутация. Наиболее вероятным нам представляется следующий гаплотип основателя D19S219 — D19S412 — FKRP 3'GT-FKRP с.135С>Т-FKRP (mut) — SLC1A5 — D19S606: 7−11−3- с. 135ТFKRP (mut)—l.

Нами проведен клинический анализ 36 признаков изолированной ПКМД в группах больных с мутациями генов CAPN3 и FKRP и, у которых мутаций в данных генах выявлено не было. В данном исследовании мы попытались выделить ядро клинических признаков, характерных для этих групп.

В результате, мы определили статистически достоверное отличие по нескольким признакам — снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей, снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей, нарушение ходьбы на пятках, синдром дряблых предплечий, крыловидные лопатки и возраст дебюта более 5 лет — для группы больных с мутациями в гене CAPN3. Для других двух исследуемых групп не выявлено уникального набора симптомов и признаков. Однако, в ходе исследования, мы, как и другие исследователи, не смогли определить алгоритм диагностики ферментопатий на основе клинических признаков.

Создан молекулярно-генетический алгоритм диагностики ферментопатий с клиникой изолированной ПКМД у больных из РФ, в основу которого легли результаты проведенного исследования.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Balci В., Aurino S., Haliloglu G., Talim В., Erdem S., Akcoren Z., Tan E., Caglar M., Richard I., Nigro V., Topaloglu H., and Dincer P. (2006). Calpain-3 mutations in Turkey. Eur JPediatr 165: 293−8.
  2. Beedle A. M., Nienaber P. M., and Campbell К. P. (2007). Fukutin-related protein associates with the sarcolemmal dystrophin-glycoprotein complex. J Biol Chem 282: 16 713−7.
  3. Bengtsson В. O. a. G. T. (1981). Measuring the strength of associations between HLA antigens and diseases. Tissue Antigens 18: p. 356−363.
  4. Bourteel H., Stojkovic Т., Cuisset J. M., Mauragc C. A., Laforet P., Richard P., and Vermersch P. (2007). Phenotypic aspects of FKRP-linked muscular dystrophy type 21 in a series of eleven patients. Rev Neurol (Paris) 163: 189−96.
  5. Bourteel H., Vermersch P., Cuisset J. M., Maurage C. A., Laforet P., Richard P., and Stojkovic T. (2009). Clinical and mutational spectrum of limb-girdle muscular dystrophy type 21 in 11 French patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry 80: 1405−8.
  6. К. M. (1995). Diagnostic criteria for the limb-girdle muscular dystrophies: report of the ENMC Consortium on Limb-Girdle Dystrophies. Neuromuscul Disord 5: 71−4.
  7. Cobo A. M., Saenz A., Poza J. J., Urtasun M., Indakoetxea В., Urtizberea J. A., Lopez de Munain A., and Calafell F. (2004). A common haplotype associated with the Basque 2362AG —> TCATCT mutation in the muscular calpain-3 gene. Hum Biol 76: 73 141.
  8. R. (2000). Age estimate of the N370S mutation causing Gaucher disease in Ashkenazi Jews and European populations: A reappraisal of haplotype data. Am J Hum Genet 66: 692−7.
  9. Davies K. E., and Nowak K. J. (2006). Molecular mechanisms of muscular dystrophies: old and new players. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 762−73.de Wazieres B., and Dupond J. L. (2001). Mitochondrial and metabolic myopathies. Rev Prat 51: 256−61.
  10. Duguez S., Bartoli M., and Richard I. (2006). Calpain 3: a key regulator of the sarcomere? FebsJ213: 3427−36.
  11. Duno M., Sveen M. L., Schwartz M., and Vissing J. (2008). cDNA analyses of CAPN3 enhance mutation detection and reveal a low prevalence of LGMD2A patients in Denmark. Eur J Hum Genet 16: 935−40.
  12. Ehler E., and Gautel M. (2008). The sarcomere and sarcomerogenesis. Adv Exp Med Biol 642: 1−14.
  13. Ervasti J. M., and Sonnemann K. J. (2008). Biology of the striated muscle dystrophin-glycoprotein complex. Int Rev Cytol 265: 191−225.
  14. Esapa C. T., Benson M. A., Schroder J. E., Martin-Rendon E., Brockington M., Brown S. C., Muntoni F., Kroger S., and Blake D. J. (2002). Functional requirements for fukutin-related protein in the Golgi apparatus. Hum Mol Genet 11: 3319−31.
  15. J. (2004). Limb girdle muscular dystrophies. Nervenarzt 75: 1153−66.
  16. Ginjaard H.B. F. W. S., de Mos M., et al. (2000). Classification of limb girdle muscular dystrophy types 1C, 2A and 2B based on protein and/or DNA studies. Neuromuscular Disorder: 731−735.
  17. Groen E. J., Charlton R., Barresi R., Anderson L. V., Eagle M., Hudson J., Koref M. S., Straub V., and Bushby K. M. (2007). Analysis of the UK diagnostic strategy for limb girdle muscular dystrophy 2A. Brain 130: 3237−49.
  18. Guglieri M., and Bushby K. (2008). How to go about diagnosing and managing the limb-girdle muscular dystrophies. Neurol India 56: 271−80.
  19. Hanisch F., Grimm D., Zierz S., and Deschauer M. Frequency of the FKRP mutation c.826C>A in isolated hyperCKemia and in limb girdle muscular dystrophy type 2 in German patients. J Neurol 257: 300−1.
  20. J. E. (2009). Abnormal glycosylation of dystroglycan in human genetic disease. Biochim BiophysActa 1792: 853−61.
  21. Hodgson S., Hart K., Abbs S., Heckmatt J., Rodillo E., Bobrow M., and Dubowitz V. (1989). Correlation of clinical and deletion data in Duchenne and Becker muscular dystrophy. J Med Genet 26: 682−93.
  22. Kefi M., Amouri R., Chabrak S., Mechmeche R., and Hentati F. (2008). Variable cardiac involvement in Tunisian siblings harboring FKRP gene mutations. Neuropediatrics 39: 113−5.
  23. Krahn M., Bernard R., Pecheux C., Hammouda el H., Eymard B., Lopez de Munain A., Cobo A. M., Romero N., Urtizberea A., Leturcq F., and Levy N. (2006). Screening of the CAPN3 gene in patients with possible LGMD2A. Clin Genet 69: 444−9.
  24. Mercuri E., and Longman C. (2005). Congenital muscular dystrophy. Pediatr Ann 34: 5602, 564−8.
  25. Milic A., and Canki-Klain N. (2005). Calpainopathy (LGMD2A) in Croatia: molecular and haplotype analysis. Croat Med J 46: 657−63.
  26. Munoz-Blanco J. L. (1998). Lipidic myopathies. Rev Neurol 26 Suppl 1: S72−80.
  27. Muntoni F., Torelli S., and Brockington M. (2008). Muscular dystrophies due to glycosylation defects. Neurotherapeutics 5: 627−32.
  28. Ohnesorg T., Turbitt E., and White S. J. The many faces of MLPA. Methods Mol Biol 687: 193−205.
  29. Ono Y., Torii F., Ojima K., Doi N., Yoshioka K., Kawabata Y., Labeit D., Labeit S.,
  30. Suzuki K., Abe K., Maeda T., and Sorimachi H. (2006). Suppressed disassembly of autolyzing p94/CAPN3 by N2A connectin/titin in a genetic reporter system. J Biol Chem 281: 18 519−31.
  31. Panegyres P. K., Mastaglia F. L., and Kakulas B. A. (1990). Limb girdle syndromes. Clinical, morphological and electrophysiological studies. J Neurol Sci 95: 201−18.
  32. Parano E., Fiumara A., Falsperla R., Vita G., and Trifiletti R. R. (1994). Congenital muscular dystrophy: correlation of muscle biopsy and clinical features. Pediatr Neurol 10: 233−6.
  33. Parano E., Pavone L., Fiumara A., Falsaperla R., Trifiletti R. R., and Dobyns W. B. (1995). Congenital muscular dystrophies: clinical review and proposed classification. Pediatr Neurol 13: 97−103.
  34. Peter A. K., Miller G., and Crosbie R. H. (2007). Disrupted mechanical stability of the dystrophin-glycoprotein complex causes severe muscular dystrophy in sarcospan transgenic mice. J Cell Sci 120: 996−1008.
  35. Philpot J., Sewry C., Pennock J., and Dubowitz V. (1995). Clinical phenotype in congenital muscular dystrophy: correlation with expression of merosin in skeletal muscle. Neuromuscul Disord5: 301−5.
  36. Pollitt C., Anderson L. V., Pogue R., Davison K., Pyle A., and Bushby K. M. (2001). The phenotype of calpainopathy: diagnosis based on a multidisciplinary approach. Neuromuscul Disord 11: 287−96.
  37. Poppe M., Cree L., Bourke J., Eagle M., Anderson L. V., Birchall D., Brockington M., Buddies M., Busby M., Muntoni F., Wills A., and Bushby K. (2003). The phenotype of limb-girdle muscular dystrophy type 21. Neurology 60: 1246−51.
  38. Sanger F., Nicklen S., and Coulson A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463−7.
  39. Schara U., and Mortier W. (2005). Neuromuscular diseases 2: muscular dystrophies (MD). Nervenarzl 76: 219−37- quiz 238−9.
  40. Shin J. H., Kim H. S., Lee C. H., Kim C. M., Park K. H., and Kim D. S. (2007). Mutations of CAPN3 in Korean patients with limb-girdle muscular dystrophy. J Korean Med Sci 22: 463−9.
  41. Sveen M. L., Schwartz M., and Vissing J. (2006). High prevalence and phenotype-genotype correlations of limb girdle muscular dystrophy type 21 in Denmark. Ann Neurol 59: 808−15.
  42. Syntichaki P., and Tavernarakis N. (2002). Death by necrosis. Uncontrollable catastrophe, or is there order behind the chaos? EMBO Rep 3: 604−9.
  43. Taveau M., Bourg N., Sillon G., Roudaut C., Bartoli M., and Richard I. (2003). Calpain 3 is activated through autolysis within the active site and lyses sarcomeric and sarcolemmal components. Mol Cell Biol 23: 9127−35.
  44. Tidball J. G., and Spencer M. J. (2000). Calpains and muscular dystrophies. Int J Biochem Cell Biol 32: 1−5.
  45. Todorova A., Georgieva B., Tournev I., Todorov T., Bogdanova N., Mitev V., Mueller C. R., Kremensky I., and Horst J. (2007). A large deletion and novel point mutations in the calpain 3 gene (CAPN3) in Bulgarian LGMD2A patients. Neurogenetics 8: 2259.
  46. Todorova A., Kress W., and Mueller C. (2005). Novel mutations in the calpain 3 gene in Germany. Clin Genet 67: 356−8.
  47. Topaloglu II., Yalaz K., Renda Y., Kale G., Caglar M., and Gogus S. (1989). Congenital muscular dystrophy (non-Fukuyama type) in Turkey: a clinical and pathological evaluation. Brain Dev 11: 341−4.
  48. Tremblay M., and Vezina H. (2000). New estimates of intergenerational time intervals for the calculation of age and origins of mutations. Am J Hum Genet 66: 651−8.
  49. Vainzof M., Ayub-Guerrieri D., Onofre P. C., Martins P. C., Lopes V. F., Zilberztajn D., Maia L. S., Sell K., and Yamamoto L. U. (2008). Animal models for genetic neuromuscular diseases. J Mol Neurosci 34: 241−8.
  50. Yamamoto L. U., Velloso F. J., Lima B. L., Fogaca L. L., de Paula F., Vieira N. M., Zatz M., and Vainzof M. (2008). Muscle protein alterations in LGMD2I patients with different mutations in the Fukutin-related protein gene. J Histochem Cytochem 56:
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!