Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками

Актуальность темы

Последнее десятилетие ознаменовалось формированием новых представлений об организации жизни бактерий, особенностей их существования во внешней среде и организме человека. Основные открытия в этой области связаны с изучением бактериальных биопленок (Тец В.В., 1998; Amano A. et al., 1999; Costerton J. W. et al., 1999; Watnic P., Kotler R., 2002). Накопившиеся данные свидетельствуют об особенностях свойств бактерий, находящихся в составе сообществ, наиболее актуальным из которых для практической медицины следует считать повышенную выживаемость микроорганизмов в биопленках (Anderl J.N. et al. 2000; Lewis К., 2001). Бактерии в составе сообществ выживают в присутствии антибиотиков, взятых в количествах, значительно превосходящих минимальную подавляющую концентрацию. Возможно, антибиотики, вообще, не могут полностью уничтожить бактерии биопленок, поскольку в последних обнаружены клетки, находящиеся в силу дифференцировки в состоянии полной устойчивости практически ко всем известным препаратам (Keren I. et al., 2004; Harrison J.J. et al., 2005; Lewis K., 2005). Несмотря на свою актуальность, биопленки остаются со многом слабо изученными. Очень мало известно о структуре, составе и функциях компонентов внеклеточного матрикса бактериальных сообществ. Среди различных молекул, обнаруженных в составе матрикса, особое внимание привлекают липиды и внеклеточная ДНК. Липиды входят в состав поверхностной оболочки, отграничивающей сообщество от внешней среды, формируя мембраноподобную структуру (Tetz V.V. et al., 1993; Zhou L. et al., 1998). Такая оболочка, предположительно, может служить преградой на пути антибиотиков в биопленку (Тец В.В., 1997). Большое внимание исследователей в последние годы привлекает ДНК, которую можно обнаружить за пределами клеток эукариот (Anker P., Stoun M., 2000; Bergsmedh A. et al., 2002 Anker P. et al., 2004). Внеклеточная ДНК бактерий остается практически неизученной. Почти ничего не известно о её путях распространения и функциях. На сегодня, практически нет данных о путях экспорта ДНК в межклеточный матрикс микробных биопленок. Вместе с тем, внеклеточная ДНК в биопленках представляет особый интерес для понимания механизмов и путей горизонтального переноса генов между различными микроорганизмами. Можно предполагать, что исследование внеклеточной ДНК биопленок поможет в понимании особенностей их развития и изменчивости признаков, а также эффективности перераспределения генов, в особенности контролирующих антибиотико-устойчивость и патогенность. Возможно, внеклеточная ДНК станет новой мишенью для воздействия на микроорганизмы.

Цель работы.

Целью настоящей работы являлось изучение состава фосфолипидов и содержания внеклеточной ДНК бактериальных биопленок, а так же оценка возможности повышения эффективности антибиотикотерапии за счет воздействия на компоненты матрикса микробных сообществ. В процессе выполнения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состав фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки биопленок неродственных представителей грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий.

2. Произвести поиск и охарактеризовать внеклеточную ДНК в матриксе биопленок неродственных бактерий на различных стадиях развития сообщества.

3. Оценить связь матриксной ДНК и изучить возможность воздействовать на неё с целью изменения свойств биопленки.

4. Изучить влияние ДНКазы на активность передачи генов, интенсивность формирования и сохранение признака антибиотикоустойчиво-сти в биопленках.

5. Проверить эффективность воздействия на бактерии биопленок антибиотиков, способных преодолевать мембрану клеток эукариот.

6. Оценить эффективность совместного действия ДНКазы и антибиотиков на биопленки разного возраста неродственных грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий.

Научная новизна работы Впервые проведено комплексное изучение состава внеклеточных фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки различных неродственных моно и смешанных микробных сообществ. Выполнен поиск и идентификация внеклеточной ДНК микробных биопленок. Установлено, что в составе поверхностной оболочки биопленок и внеклеточном матриксе фосфолипиды по качественному составу аналогичны мембранным, но количественно в них преобладают стабильные фракции. Показано, что в матриксе различных, неродственных микроорганизмов присутствует внеклеточная ДНК, которая содержит гены бактериальной хромосомы и плазмид. Доказано, что антибиотики, способные проникать через мембрану клеток, действуют на бактерии, находящиеся в биопленках.

Впервые установлено, что разрушение внеклеточной ДНК, приводит к невосстановимым изменениям различных свойств биопленок неродственных бактерий, сопровождающимся снижением числа антбиотико-устойчивых клеток.

Впервые доказана возможность усиления действия на биопленки неродственных микробов различных антибиотиков за счет воздействия на компонент матрикса — внеклеточную ДНК.

Предложены новые способы борьбы с инфекционными заболеваниями (патенты РФ № 2 267 329, № 2 269 358 № 2 269 359).

Теоретическое и практическое значение результатов исследования На основании полученных данных стало возможным использовать новые критерии выбора антибиотиков для действия на бактерии, основанные на способности препарата проникать через липидную оболочку биопленок, что позволяет повысить эффективность антибиотикотера-пии и уменьшить число осложнений.

Использование ДНКазы для воздействия на бактериальные биопленки позволяет уменьшить их биомассу, а также интенсивность образования и сохранения антибиотикоустойчивых клонов.

Выявлена новая мишень — внеклеточная ДНК матрикса биопленок для воздействия на бактерии с целью повышения эффективности анти-биотикотерапии. Использование ДНК матрикса, как дополнительной мишени при терапии, позволяет повысить эффективность действия различных антибиотиков на неродственные микробы, находящиеся в биопленках, снизить вероятность возникновения, распространения и сохранения устойчивости к лечебному агенту, сократить общую продо-ложительность терапии, уменьшить сроки пребывания больных в стационаре и снизить частоту рецидивов заболевания.

Разработаны и внедрены в клиническую практику новые эффективные схемы антимикробной терапии, включающие воздействие на внеклеточную ДНК фермента ДНКазы у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой локализации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Наличие фосфолипидов в поверхностной оболочке и матриксе бактериальных биопленок позволяет использовать новые принципы в выборе антибиотиков, активных против микробов, находящихся в составе сообществ.

2. Добавление ДНКазы на разных стадиях существования бактериальных биопленок ведет к нарушению их образования, уменьшению биомассы, снижению эффективности формирования и сохранению антибиотико-устойчивых клонов.

3. Совместное применение ДНКазы и антибиотиков ведет к усилению антибактериального эффекта при действии на биопленки неродственных бактерий разного возраста.

Апробация результатов исследования Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях симпозиумах и съездах:

Международная конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» Санкт-Петербургский Государственный Медицин-ский Университет им. акад. И. П. Павлова, 2006 г.

Научно-практическая конференция «Санкт-Петербургский научно-технический потенциал в решении проблем лабораторной медицины — Сделано в Санкт-Петербурге», 2007 г.

1st European Congress of Microbiology June 29 — July 3, 2003. Ljubljana, Slovenia.

43rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) September 14−17, 2003. Chicago, II, USA.

Fourth International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum (CNAPS-IV)) (London, 2006).

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии/НИЦ отдела молекулярной биологии и генетики и на проблемной комиссии «микробиология и иммунология» СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова (2007).

выводы.

1. Поверхностная оболочка и внеклеточный матрикс биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий изученных штаммов содержат большое количество липидов, аналогичных таковым у мембран микроорганизмов сообщества, причем среди фосфолипидов в минимальном количестве обнаружены нестабильные фракции и максимально представлен стабильный кар-диолипин.

2. Внеклеточный матрикс бактериальных биопленок неродственных микроорганизмов, на всех исследованных сроках роста содержит фрагменты ДНК, несущие хромосомные гены, с молекулярной массой, равной приблизительно 30 кДА, которые играют важную роль в поддержании жизнедеятельности сообществ.

3. Действие ДНКазы на этапе формирования и на уже сформированные микробные сообществ, ведет к нарушению их образования, уменьшению биомассы и снижению числа колониеобразую-щих единиц.

4. Разрушение внеклеточной ДНК в присутствии ДНКазы в биопленках различных грамположительных и грамотрицательных бактерий ведет к нарушению передачи генетической информации между клетками, снижению числа образующихся рекомбинантов и мутантов антибиотикоустойчивости, а также уменьшению их выживаемости в сообществах.

5. Антибиотики, проникающие в биопленки, снижают биомассу сообщества преимущественно за счет уменьшения количества внеклеточного матрикса и в меньшей степени за счет числа жизнеспособных бактерий, дающих рост на плотной среде.

6. Матрикс микробных сообществ представляет собой новую мишень для действия лечебных препаратов, при этом применение ДНКазы увеличивает эффективность действия неродственных антибиотиков на бактерии в биопленках разного возраста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Настоящая работа посвящена изучению свойств бактериальных биопленок, образованных различными, неродственными грамполо-жительными и грамотрицательными микроорганизмами, находящихся в биопленках. Основное внимание в работе было уделено изучению компонентов матрикса биопленок, которые кроме самих бактерий могли оказывать влияние на их взаимодействие сообщества с факторами внешней среды и влиять на выживаемость микроорганизмов в присутствии антибиотиков. Основное внимание в работе уделено исследованию внеклеточных липидов и ДНК матрикса.

В результате проведены исследований в поверхностной оболочке, отделяющей биопленки от внешней среды, и в межклеточном матриксе выявлено содержание большого количества липидов. Обнаруженные липиды по качественному составу аналогичны таковым у мембран бактерий, образовавших сообщество. Липиды матрикса отличаются от клеточных количеством определенных компонентов и, прежде всего, низким содержанием нестабильных фосфолипидов и повышенным стабильного кардиолипина. Сравнительно высокое содержание кардиоли-пина в матриксе внеклеточного пространства биопленки можно считать важной предпосылкой стихийного образования мембраноподобной структуры повышенной прочности, которая может функционировать в качестве защитного барьера между сообществом бактериальных клеток и окружающим пространством. Существование липидсодержащего барьера между внешней и внутренней средой биопленок позволило предположить, что антибиотики, хорошо проникающие через мембрану клеток эукариот, должны быть эффективны и по отношению к бактериям, расположенным внутри биопленок. Проведенные нами исследования подтвердили данное предположение и показали, что препараты левофлоксацин и азитромицин, хорошо преодолевающие барьер мембраны клетки человека, проникают в микробные биопленки и вызывают значительное снижение их биомассы и числа КОЕ.

Другим важным, малоизученным компонентом матрикса является свободная внеклеточная ДНК. Такая ДНК в ходе настоящего исследования обнаружена в матриксе биопленок, различного возраста у неродственных бактерий. Все фрагментов внеклеточной ДНК имеют приблизительно одинаковый размер и согласно результатам идентификации в ПЦР с помощью созданного нами праймера содержат хромосомные бактериальные гены. Для штаммов, несущих плазмиду, показано, что ДНК последней также может быть обнаружена в свободном состоянии в матриксе. После электрофореза ДНК, выделенной из матрикса у содержащего плазмиду штамма в агарозном геле, регистрировали две независимые полосы, одна из которых соответствовала плазмидной нуклеиновой кислоте. Определение функциональной активности внеклеточной ДНК матрикса было проведено в условиях воздействия на неё дезокси-рибонуклезы. Использованная нами ДНКаза была предварительно проверена на наличие собственного токсического действия на различные штаммы. В результате установлено, что ДНКаза не оказывает токсического действия на бактерии, растущие диффузно. В присутствии нук-леазы в биопленках зарегистрировано уменьшение количества внеклеточной ДНК. При действии ДНКазы выявлено частичное угнетение передачи плазмидных генов, контролирующих атибиотико-устойчивость. Кроме того, показано, что при действии ДНКазы в биопленке снижается частота выявления мутантов антибиотико-устойчивости и эффективность сохранения данного признака бактериями. Важным результатов действия ДНКазы оказалось также изменение морфологии биопленки и количеств, а в ней внеклеточного матрикса. Фермент, добавленный в момент засева и на разных сроках существования сообщества, снижал количество внеклеточного матрикса, изменял морфологию биопленки, но мало влиял на число КОЕ. Эффект действия ДНКазы зависел от дозы препарата. В присутствии фермента в матриксе уменьшалось содержание ДНК и в меньшей степени белков и полисахаридов. Для оценки состояния биопленки, сформированной в присутствии ДНКазы или изменившейся при её воздействия на различных сроках роста мы оценили результаты воздействия различных антибиотиков, вне зависимости от их способности проникать в биопленки. Совместное применение ДНКазы и различных, неродственных антибиотиков привело к усилению их антимикробного действия. Таким образом, на бактериальные биопленки одновременно оказывалось комплексное воздействие, при котором сам антибиотик влиял на клетки, а ДНК на компоненты матрикса. Нуклеаза повышала эффективность действия антибиотиков в биопленках различного возраста в изученных штаммах грамположительных и грамотрицательных бактерий. Изменения биопленок, возникшие под воздействие ДНКазы, не восстанавливались и биомасса оставалась сниженной минимум на протяжении 7 суток. Для сравнения уменьшение биомассы биопленок стафилококка, возникшее под влиянием антибиотиков, добавленных при формировании сообщества, через 7 суток инкубации практически возвращалось к норме. Таким образом, проведенные исследования позволили показать происхождение и состав липидов матрикса, оценить роль внеклеточной ДНК бактериальных биопленок в распространении генетической информации и поддержании свойств сообщества. На основании полученной информации разработан принципиально новый универсальный способ повышения эффективности действия антибиотиков, основанный на использовании новой внеклеточной мишени — ДНК матрикса. Новизна подхода защищена 3 патентами РФ.