Эффекты мурамилдипептидов в комплексной терапии детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита (клинико-экспериментальные исследования)

Аллергические заболевания стали серьёзной проблемой человечества и по прогнозу ВОЗ в 21 веке по распространённости они выходят на первое место в структуре заболеваний. Ежегодно около 35% населения Земли обращаются за медицинской помощью с клиническими проявлениями аллергии.

Провоцирующими факторами и факторами риска развития аллергии являются: резкое ухудшение экологииострый и хронический стрессбесконтрольное широкое применение медикаментов [Е.С.Феденко, 2005; Е. В. Оганова, 2006].

В детском возрасте аллергодерматозы занимают первое место (5066,4%), среди которых преобладает атопический дерматит (АтД) [И.И.Балаболкин, В. Н. Гребенюк, 1999; Е. С. Феденко, 2005], распространенность которого составляет 17−25% [Р.М.Хаитов и др., 2002; И. И. Балаболкин, 2004]. АтД — аллергическое заболевание кожи, возникающее, как правило, в раннем детском возрасте у лиц с наследственной предрасположенностью к атопическим заболеваниям, имеющее хроническое рецидивирующее течение, возрастные особенности локализации и морфологии очагов воспаления, характеризующееся кожным зудом и обусловленное гиперчувствительностью как к аллергенам, так и неспецифическим раздражителям [Балаболкин И.И. 2004].

В настоящее время, одним из ведущих механизмов патогенеза АтД признается обнаруживаемая у большинства больных функциональная иммунная недостаточность, признаками которой является уменьшение количества CD3(+)-, CD4(+)-, С08(+)-лимфоцитов и снижение функциональной активности эффекторов гиперчувствительности замедленного типа и моноцитов [В.А.Ревякина, Н. Д. Дигилова, Т. Б. Сенцова, Л. С. Намазова, Н. И. Вознесенская, 2000; Л. И. Аллахвердиева, 2004; С. С. Петров, 2006], увеличение общего количества С020(+)-В-лимфоцитов, С023(+)-лимфоцитов, экспрессирующих низкоафинный рецептор для IgE, увеличение количества активированных лимфоцитов, несущих активационные маркеры ICAM-1(+), CD25(+), GD71(+), HLA DR (+) [Ж.М.Салмаси, А. Н. Казимирский, Е. С. Феденко и соавт., 1999]. При этом важно, что иммунопатогенез АтД характеризует прежде всего не количество CD4(+) — и СВ8(+)-лимфоцитов, а нарушение дифференцировки наивных Т-лимфоцитов (То) и профиля их цитокиновой секреции.

Не вызывает сомнений тот факт, что в патогенезе АтД одно из центральных мест принадлежит изменениям регуляции на уровне цитокинов, в большой степени определяющим специфичность механизмов развития заболеваний. [S.C.Chan е.а., 1996; М. E. Kimura е.а., 1996].

Иммунологические нарушения при АтД проявляются повышенной восприимчивостью больных к бактериальным и грибковым инфекциям [T.Shirakawa, е.а., 1997, Е. С. Феденко и соавт., 1999; Е. С. Феденко, 2000, 2005].

Исследования последних лет обогатили понимание механизма аллергических реакций прежде всего тем, что был значительно расширен перечень клеток, которые можно рассматривать как клетки-мишени аллергии, выполняющих эффекторную функцию, и вовлекаемых в аллергический процесс за счет действия на них медиаторов тучных клеток и базофилов. Одними из таких клеток являются нейтрофильные гранулоциты [И.С.Гущин, 1994]. Несмотря на то, что функциональный потенциал нейтрофилов и пути его реализации имеют огромное значение для многих патологических процессов [И.И.Долгушин и соавт., 2004], эта популяция клеток приобретает особое значение в развитии аллергических заболеваний [С.Коен и соавт., 1983; Н. М. Бережная, 1989; С. Н. Керашева, 2003]. В частности известно, что при атопической бронхиальной астме у детей, протекающей на фоне очагов хронической инфекции респираторного тракта и JIOP-органов, происходят достоверные нарушения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, не восстанавливаемые в период ремиссии заболевания [С.Н.Керашева, 2003]. Интерес к изучению функций нейтрофильных гранулоцитов при ал-лергопатологии еще более повышается, если учесть, что при этом возникает ряд неблагоприятных факторов, нарушающих функции данных клеток. Одним из таких факторов является гиперпродукция IgE, которая способна даже в условиях in vitro модифицировать биоцидные свойства нейтрофи-лов [О.Ю. Филатов и соавт., 1997; С. Н. Керашева, 2003].

Исходя из того, что многие атопические аллергические заболевания, в том числе и АтД, развиваются на фоне иммунодефицита, и наиболее частым дефектом нейтрофилов при этом является нарушение, (снижение) хемотаксиса на фоне гиперпродукции IgE [Hill е.а., 1974;

Н.М.Бережная, 1989; Л. В. Ломтатидзе, 1999; И. В. Нестерова и соавт., 2002]. Известно также, что у больных с АтД отмечается нарушение регуляции, пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников гранулоци-тои моноцитопоэза [Б.Г.Яровинский и соавт., 1999], сопровождающееся существенными изменениями основных функций нейтрофилов крови. При этом известно, что при выраженном АтД отмечается высокая активность лизосомальных гидралаз (кислой фосфатазы, кислой ДНК-азы, катепсина), являющаяся следствием освобождающего действия на лизосомы продуктов «респираторного взрыва» с истощением резерва кислороднезависимой биоцидности нейтрофилов (лизосомальные катионные белки) [Г .А.Жуматова, 1986, СН. Керашева, 2003 ] .

Показано также [О.П.Гурина и соавт., 1994; М. А. Мокроносова и соавт., 1997], что развитие гнойных осложнений при АтД отмечается у детей с крайне низким уровнем комплемента в сыворотке крови и низкой фагоцитарной активностью нейтрофилов. Дефект фагоцитарного звена снижает клиренс аллергенов, дезинтеграцию и нейтрализацию вирусов и бактерий, отягощает течение аллергического заболевания, повышает опасность инфицирования [О.А.Маталыгина и соавт., 1994; С. С. Петров, 2006]. Причем у больных АтД с площадью поражения кожных покровов более 50% в фазе обострения и ранней ремиссии отмечается резкое нарушение кооперации клеток на уровне «нейтрофил-нейтрофил», «нейтрофил-моноцит», которое может быть связано с резким нарушением пролиферации и дифференци-ровки клеток-предшественников гранулои моноцитопоэза [Б.Г.Яровинский и соавт., 1997].

Указанные нарушения ухудшают течение АтД, увеличивают возможность развития инфекционного процесса и создают фон, поддерживающий аллергический процесс.

Изучение изменений в системе нейтрофильных гранулоцитов, при АтД у детей, представляется весьма актуальным вопросом как с позиций углубленной диагностики нарушений в иммунной системе, так для обоснования подбора адекватного иммуномодулирующего средства для данной категории пациентов. Перспективной для медицины группой бактериальных иммуномодуляторов являются мурамил-содержащие гликопептиды (мура-милдипептиды) [A.Adam, 1985] - фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий и их синтетические аналоги [E.Lederer, 1988], обладающие широким спектром биологической активности, обосновывающим, в частности, их применение в противоопухолевой терапии и при создании новых вакцин в качестве адъювантов [В.А.Несмеянов, 1998]. В этом отношении хорошо зарекомендовал себя ликопид — синтетический аналог глюко-заминилмурамилдипептида (ГМДП), который представляет собой универсальный минимальный компонент бактериальной стенки и является естественным стимулятором иммунной системы, в связи с чем, воздействие на организм данного препарата в наибольшей степени приближено к процессу естественной иммунорегуляции. Совокупность известных данных о влиянии ГМДП дала основание сделать вывод, что главной мишенью действия этого иммуностимулятора являются клетки моноцитарномакрофагальной системы и нейтрофильные гранулоциты. [В.А.Несмеянов, 1998; Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин, 2000; Н. В. Колесникова и соавт., 2003; Б. В. Пинегин, Т. М. Андронова, М. И. Карсонова, 2005; М. Н. Митропанова, 2006].

Таким образом, исследования, направленные на функциональное зондирование нейтрофильных гранулоцитов при АтД, актуальны не только в связи с расширением наших представлений о роли данных клеток в патогенезе и течении атопических заболеваний, но и в плане определения наиболее значимых диагностических и прогностических их критериев, а так же подбора адекватной иммунокоригирующей терапии.

1.ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: На основании углубленного изучения функционирования системы нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита, повысить клинико-иммунологическую эффективность комплексной традиционной терапии заболевания, путем включения в нее иммуно-модулятора ликопида.

2.3АДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита, средней степени тяжести:

1.1 Определить число активно-фагоцитирующих клеток, их поглотительную и переваривающую способность

1.2 Определить активность микробицидной кислород-зависимой системы нейтрофильных гранулоцитов по показателям спонтанного и стимулированного NBT-теста

1.3 Оценить рецепторную функцию фагоцитов — по абсолютному и относительному содержанию нейтрофилов, несущих функционально значимые (CD1 lb-, CD16) и активационные (CD25-, CD95) рецепторы.

2. В экспериментах in vivo на лабораторных животных, обосновать целесообразность включения в комплексную терапию детей с АтД им-муномодулятора ликопида путем оценки влияния ГМДП на уровень содержания в сыворотке аллерген-специфических гомоцитотропных IgE-антител и функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов лабораторных мышей.

3. Исследовать влияние ликопида, включенного в традиционную базисную терапию детей с обострением IgE-опосредованного атопиче-ского дерматита на показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и содержание сывороточного IgE.

4. Оценить клинические эффекты ликопида у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита.

5. Разработать программу иммунокоррекции нарушений в системе нейтрофильных гранулоцитов детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита средней степени тяжести, с помощью им-муномодулятора ликопида.

3. НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ:

В проведенных исследованиях впервые:

1. Проведено углубленное тестирование системы нейтрофильных гранулоцитов параллельно с оценкой концентрации сывороточного IgE у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита средней степени тяжести с выявлением диагностически значимых маркеров.

2. Экспериментально доказаны иммуномодулирующие эффекты ГМДП — активного действующего начала иммуномодулятора ликопида в отношении функционирования нейтрофильных гранулоцитов лабораторных мышей и содержания гомоцитотропных IgE-антител в условиях иммунизации животных аллергеном амброзии

3. Определена клинико-иммунологическая эффективность ликопида, включенного в традиционную базисную терапию детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита, заключающаяся в нормализации функционирования нейтрофильных гранулоцитов и снижении содержания общего IgE в сыворотке крови.

4. НАУЧНО ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

1. Выявлены диагностически значимые маркеры дисфункций в системе нейтрофильных гранулоцитов у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита средне-тяжелого течения.

2. Экспериментально обоснована целесообразность включения имму-номодулятора ликопид в традиционную комплексную терапию детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита.

3. Получены позитивные клинико-иммунологические эффекты применения иммуномодулятора ликопид в коплексной терапии IgE-опосредованного атопического дерматита средне-тяжелого течения и предложен метод иммунотропной терапии детей с данным заболеванием.

5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.У детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита имеют место существенные нарушения в системе нейтрофильных гранулоцитов, заключающиеся в резком возрастании числа циркулирующих НГ, экспрессирующих активационные маркеры (CD25+, CD95+), и функционально-значимые рецепторы адгезии (CDllb+) и цитотоксичности (CD 16+), сопровождающиеся депрессией фагоцитарной функции нейтрофилов.

2. Традиционная комплексная терапия детей с атопическим дерматитом не позволяет полностью устранить обнаруживаемые дефекты в системе нейтрофильных гранулоцитов, что обуславливает необходимость включения в таковую иммуномодулятора.

3. Экспериментально обоснована целесообразность включения лико-пида в комплексную терапию детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита по результатам выявленных позитивных иммуно-модулирующих эффектов ГМДП (активного действующего начала лико-пида) в отношении дисфункций нейтрофилов крови лабораторных мышей, иммунизированных аллергеном амброзии, и уровня их аллерген-специфических гомоцитотропных IgE-антител.

4. Включение ликопида в комплексную терапию детей с атопическим дерматитом оказывает выраженное иммуномодулирующее действие в виде нормализации показателей функционирования системы нейтрофильных гранулоцитов, и снижения содержания общего сывороточного IgE, сочетающихся с высокой клинической эффективностью.

ВЫВОДЫ

1. При обострении IgE-опосредованного атопического дерматита средне-тяжелого течения у детей отмечается активация рецепторной функции нейтрофильных гранулоцитов в виде достоверного увеличения CD1 lb (+)-, CD16(+)-, CD25(+) — и CD95(+)-HT, с резким уменьшением количества активных фагоцитов, угнетением их поглотительной и переваривающей способности, и достоверным дефектом оксидазной биоцидно-сти, наиболее ярко проявляющимися при дополнительной антигенной нагрузке in vitro.

2.

Введение

лабораторным мышам ГМДП на пике продукции IgE (10 сутки) продемонстрировало его выраженные иммунотропные эффекты как в ранние (через 24 часа), так и более отдаленные сроки (на 5-е сутки), заключающиеся в восстановлении сниженного количества циркулирующих НГ, клеток способных к активному фагоцитозу, в усилении поглотительной-, переваривающей способности и оксидазной биоцидности с адекватным ответом последней на нагрузку антигеном in vitro.

3. ГМДП, введенный мышам, иммунизированным аллергеном амброзии на пике продукции IgE, достоверно снижает содержание аллерген-специфических IgE-антител (в 3,6 раза) с сохранением эффекта спустя 5 суток после введения препарата (в 2,2 раза от исходного).

4. Проведение традиционной комплексной терапии у детей с обострением IgE-опосредованного АтД среднетяжелого течения не позволяет полностью устранить наблюдаемые дефекты функционирования системы нейтрофильных гранулоцитов, тогда как включение в нее ликопида привело к восстановлению фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов с нормализацией оксидазной биоцидности клеток и снижением количества НГ, несущих функционально-значимые и активационные маркеры до уровня таковых у практически здоровых детей.

5. В отличие от изолированной традиционной терапии детей с обострением IgE-опосредованного АтД, включение в таковую ликопида обнаружило его способность достоверно снижать исходно высокий (в 5 раз выше физиологического) уровень общего сывороточного IgE до значений практически здоровых детей.

6. У иммунокомпрометированных детей с обострением IgE-опосредованного АтД, получавших в комплексной терапии ликопид, отмечена положительная клиническая эффективность с сокращением площади поражения кожи в 3,5 раза (при комплексной терапии — в 1,8 раза) через 1 месяц, а ко 2 месяцу — в 3 разас более выраженным снижением интенсивности клинических проявлений (в 3,6 раза — через 1 месяц, в 8,4 раза — через 2 месяца), и с более резким снижением (в 37 раз) субъективных проявлений. Суммарное значение индекса SCORAD было снижено после терапии с использованием ликопида в 4,2 раза (первый месяц лечения) и в 14 раз (второй месяц лечения), а после изолированной традиционной терапии — в 2,5 раза и в 4,4 раза, соответственно.

7. Комплексная иммунотропная терапия детей с обострением IgE-опосредованного АтД средней степени тяжести с использованием ликопида по предлагаемой схеме, позволяет получить достоверный клинико-иммунологический эффект с нормализацией функционирования системы НГ и содержания общих IgE-антител, и обеспечить более полный контроль за течением заболевания с существенным улучшением качества жизни пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с «Согласительным документом Ассоциации детских аллергологов и иммунологов России» (2004), атопический дерматит является хроническим аллергическим лихенифицирующим воспалением кожи, возникающим в результате готовности иммунной системы к развитию аллергической реакции, способной быть запущенной как атопическими, так и неатопическими механизмами. Сопровождается кожным зудом и частым инфицированием, что обусловлено изменениями в иммунном ответе, носящими выраженный гетерогенный характер.

В детском возрасте аллергодерматозы занимают первое место, на их долю приходится 50−66,4% всех форм аллергических заболеваний, среди которых преобладает АтД [И.И.Балаболкин, 1998]. Наиболее частыми признаками нарушений в иммунном ответе являются: уменьшение количества CD3(+)-, CD4(+)-, СВ8(+)-лимфоцитов и снижение функциональной активности эффекторов гиперчувствительности замедленного типа и моноцитов [В.А. Ревякина, Н. Д. Дигилова, Т. Б. Сенцова, Л. С. Намазова, Н. И. Вознесенская., 2000]. Параллельно у больных АтД более чем в 1,5 раза увеличивается общее количество СВ20(+)-В-лимфоцитов, а содержание лимфоцитов, экспрессирующих низкоафинный рецептор для IgE (CD23(+)-лимфоциты) возрастает почти в 2,5 раза. [Ж.М.Салмаси, А. Н. Казимирский, Е. С. Феденко и соавт., 1999, Е. С. Феденко, 2005]. Этими же авторами показано значительное увеличение при АтД количества активированных лимфоцитов, несущих активационные маркеры 1САМ-1(+) — (в 3,5 раза), CD25(+) — (в 2 раза), CD71(+) — (более чем в 2 раза), HLA DR (+) — (в 1,5 раза). Это позволяет заключить, что при АтД наблюдается выраженная активация иммунной системы, преимущественно В-звена, сопровождающаяся нарушениями Т-звена иммунитета. Причем обнаруживаемые при АтД дефекты в Т-системе иммунитета приводят к дисбалансу продукции сывороточных иммуноглобулинов, выражающемуся в гипериммуноглобулинемиии по классу IgE (более чем у 85% больных) [J.A.D.Cooper, Y. Sibille et all, 1991].

Исследования последних лет обогатили понимание механизма аллергии прежде всего тем, что был значительно расширен перечень клеток, которые можно рассматривать как клетки-мишени аллергии, выполняющие эффекторную функцию и вовлекаемые в аллергический процесс за счет действия на них медиаторов тучных клеток и базофилов. Одними из таких клеток являются нейтрофильные гранулоциты [И.С.Гущин, 1994]. Известно, что у больных с атопическим дерматитом отмечается нарушение регуляции, пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников гра-нулоцитои моноцитопоэза [Б.Г.Яровинский, А. В. Зурочка, А. А. Важенин, О. В. Биргер, 1999], сопровождающееся существенными изменениями основных функций нейтрофилов крови. Вполне очевидно, что наряду с дефектами Т-клеточного иммунного ответа недостаточность хемотаксиса и фагоцитоза моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов при АтД может быть причиной повышенной восприимчивости к инфекциям, в частности, к золотистому стафилококку и другим бактериальным антигенам [О.П.Гурина, И. С. Подосинников, А. Е. Блинов и соавт., 1994]. Исследования показали, что если по отношению к клеточному и гуморальному компоненту иммунитета при АтД можно сложить вполне ясную картину функциональной и количественной дефектности, то в системе нейтрофильных гранулоцитов многие вопросы являются недостаточно изученными, особенно в связи с типом течения АтД, возрастом пациентов и прочими факторами. Это, в свою очередь, придает актуальность исследованиям, направленным на расширенное тестирование звена нейтрофильных гранулоцитов при АтД не только с целью расширения наших представлений о роли данных клеток в патогенезе и течении атопических заболеваний, но и в плане определения наиболее значимых диагностических и прогностических критериев их функциональной активности, и как основание для использования в комплексном лечении заболевания иммуномодулято-ров направленного действия.

В связи с изложенным, целью исследования явилось: углубленное изучение функционирования системы нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита с оптимизацией клинико-иммунологической эффективности комплексной традиционной терапии заболевания, путем включения в нее иммуномодулятора ликопида. Последнее обусловлено тем, что перспективной для медицины группой бактериальных иммуномодуляторов сегодня являются мурамил-содержащие гликопептиды (мурамилдипептиды) [A.Adam, 1985] - фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий и их синтетические аналоги [E.Lederer, 1988], обладающие широким спектром биологической активности [В.А.Несмеянов, 1998]. К настоящему времени накоплено достаточно сведений, позволяющих считать достоверными иммунотропные эффекты глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) и современного лекарственного препарата, созданного на его основе — ликопида — в отношении НГ — «профессиональных» микрофагоцитов крови, играющих важную роль в противомикробной защите организма [Б.В. Пи-негин, Т. М. Андронова, М. И. Карсонова, 2005; Н. В. Колесникова, 1999; М. Г. Кулагина, 2003; М. Мохд, 2005; О. В. Первишко, 2006].

Для реализации намеченной цели исследования было обследовано 150 детей с атопическим дерматитом, наблюдаемых с 2003 по 2006 г на кафедре клинической иммунологии и лабораторной диагностики ФПК и 1111С Кубанского государственного медицинского университета. Из данной группы детей была искусственно отобрана группа детей с обострением IgE-опосредованного АтД средней степени тяжести, не имеющих на момент обследования признаков клинической манифестации сопутствующей бактериальной, вирусной и микотической инфекции. В итоге было отобрано 46 детей в возрасте от 6 до 9 лет с диагнозом IgE-опосредованный ато-пический дерматит средней степени тяжести в состоянии обострения.

Проведенными исследованиями установлено, что у детей с обострением IgE-опосредованного АтД имеет место достоверное (в 1,5 раза) снижение относительного содержания нейтрофилов периферической крови, тогда как абсолютное содержание клеток входит в пределы физиологической возрастной нормы за счет возрастания общего числа лейкоцитов на 26% (р>0,5). При изучении рецепторного аппарата клеток по содержанию FIT периферической крови, экспрессирующих функционально-значимые рецепторы адгезии (CDllb+) и цитотоксичности (CD 16+), у детей с АтД выявлено достоверное увеличение их содержания, как в относительном, так и в абсолютном выражении показателей. По сравнению с практически здоровыми детьми того же возраста, при обострении IgE-опосредованного АтД отмечено возрастание процентного содержания CD11Ь (+)-НГ в 2,2 раза, а абсолютного — в 1,7 раза (р<0,01), а также увеличение процентного и абсолютного содержание клеток, несущих CD 16-рецепторы в среднем в 1,8 раза. Сходный характер изменений отмечен в отношении количества клеток, несущих маркеры ранней (CD25+) и поздней (CD95+) активации: выявлено достоверное возрастание количества CD25(+)-HT в процентном и абсолютном выражении показателя (в 1,5 раза), а также более существенное увеличение CD95(+)-HF — в 2,25 раза. Следует отметить, что в литературе имеются данные о достоверном увеличении числа лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих акти-вационные маркеры (CD25+, CD95+), коррелирующие с результатами наших исследований [Н.И.Ильина, Е. С. Феденко, 2004] и свидетельствующие об общей направленности изменений рецепторной функции лейкоцитов крови при АтД.

Наряду с этим, бнаруженное нами возрастание CD25(+)-Hr находится в определенной связи с данными о том, что у детей с АтД в крови обнаружены высокие концентрации ИЛ-2, особенно при тяжелом экзематозном процессе [F.L.Van-der Heiden е.а., 1998]. Кроме того, известно, что при АтД, аллергены, накапливаясь в организме, оказывают влияние на миграционную функцию, лизосомальную секрецию клеток, усиливают их дефектность. Дефект фагоцитарного звена снижает клиренс аллергенов, дезинтеграцию и нейтрализацию вирусов и бактерий, отягощает течение аллергического заболевания, повышает опасность инфицирования [О.А.Маталыгина, О. П. Гурина, Л. А. Березина, 1994]. В этой связи интерес представляла оценка основной функции НГфагоцитарной — при обострении IgE-опосредованного АтД у детей.

Фагоцитарную активность НГ оценивали по интенсивности захвата и переваривания бактерий St. aureus, определяя при этом количество активно фагоцитирующих НГ (ФАН %), фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ), как показатели, характеризующие объем захваченного бактериального антигена (БАГ), а также оценивали процессы переваривания БАГ, выраженные в проценте переваривания (%П) и индексе переваривания (ИП).

Установлено, что при обострении IgE-опосредованного АтД отмечается достоверное снижение %ФАН, ФИ и ФЧ со снижением %П на 20% от контроля (р<0,001), а индекс переваривания — в 2,38 раза от уровня такового у практически здоровых детей .

Известно, что завершенность фагоцитарного акта во многом обусловлена состоянием кислород-зависимой микробицидной системы клеток, о которой при обострении IgE-опосредованного АтД судили по показателям среднего цитохимического индекса (СЦИ), проценту фармазан-позитивных клеток (%ФПК) и коэффициенту мобилизации (КМ) в спонтанном и стимулированном NBT-тесте. NBT-тест отражает итоговую реакцию одной из ключевых ферментных систем, ответственных за эффек-торный потенциал фагоцитов: нарушение способности к восстановлению нитросинего тетразолия совпадает с патологией кислород зависимых механизмов биоцидности, а стимулированный тест можно рассматривать как биохимический критерий готовности к завершенному фагоцитозу [И.В. Нестерова, 1980,1992; Д. Н. Маянский, А. Н. Маянский, 1989]. Таким образом, стимулированный NBT-тест вскрывает резервные возможности НГ, а коэффициент мобилизации (КМ), представляющий отношение уровней %ФПК в стимулированном и спонтанном тесте, количественно демонстрирует выраженную напряженность микробицидных энзимологических кислород-зависимых процессов.

Исследованиями показано, что при обострении IgE-опосредованного атопического дерматита у детей выявлено девятикратное увеличение значений СЦИ в спонтанном тесте, и в 5,3 раза — в стимулированном, по сравнению с таковыми показателями в контрольной группе, что позволило констатировать напряженность оксидазной системы НГ при данной патологии. Между тем в отношении содержания формазан-позитивных клеток было выявлено их снижение как в спонтанном (1,5 раза), так и в стимулированном (1,7 раза) NBT-тесте. Дополнительная антигенная нагрузка in vitro выявила истощение резервных возможностей кислород-зависимой микробицидной системы НГ, что отразилось в двукратном снижении величины коэффициента мобилизации.

Анализируя полученные данные в целом, следует заключить, что при обострении IgE-опосредованного атопического дерматита средне-тяжелого течения у детей циркулирующие нейтрофильные гранулоциты находятся в состоянии гиперактивации, о чем свидетельствуют результаты оценки ре-цепторного аппарата клеток. Следует предположить, что она является длительной, приведшей к истощению функциональной активности клеток, так как при этом обнаруживаются существенные нарушения в их фагоцитарной функции в виде резкого уменьшения доли клеток, способных к активному фагоцитозу, а также достоверного угнетения способности к поглощению и перевариванию ими антигенного материала.

Обнаруженные нами у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита нарушения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, обуславливает интерес к исследованию иммунотропных эффектов ликопида как в клинике (дети с АтД), так и в эксперименте — на модели гиперчувствительности немедленного типа — у мышей, иммунизированных аллергеном амброзии.

G целью обоснования целесообразности использования ликопида при аллергических заболеваниях в эксперименте in vivo на беспородных мышах, иммунизированных аллергеном амброзии, исследовались эффекты глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) — активного действующего начала препарата ликопид, в отношении количества циркулирующих НГ и доли среди них активно-фагоцитирующих клеток (%ФАН), их поглотительной способности и переваривающей активности по отношению к БАГ, а также показателей спонтанного и стимулированного NBT-теста. Для этого 100 белых беспородных мышей-самцов массой 20,00±5,00 г. были разделены на следующие группы: первую и вторую группу составили мыши, иммунизированные аллергеном амброзии в дозе 4 ед/мышь, с оценкой состояния системы НГ на Юсуткй (группа 1) иТ 5 сутки (группа

2). Третью и четвертую группу мышей иммунизировали аллергеном амброзии в той же дозе, но на пике продукции IgE (10 сутки) вводили ГМДП из расчета 4 мкг/кг. массы мышей. Через 24 часа (группа 3) и на 5-е сутки (группа 4) оценивали показатели функционирования НГ. Мышам пятой группы вводили ГМДП из расчета 4 мкг/кг, с оценкой эффектов препарата на систему НГ через 24 часа. Контролем служили мыши, забитые, соответственно, на 10 сутки (контроль 1) и на 15 сутки (контроль 2) от момента иммунизации аллергеном, а также фоновые животные (контроль

3). Поскольку изучаемые параметры функционирования НГ в контрольных группах не имели между собой достоверных отличий, они были объединены в общую контрольную группу.

Анализ полученных данных позволил установить, что по сравнению с контролем на 10-е.сутки после иммунизации мышей аллергеном амброзии имеет место достоверное снижение общего числа лейкоцитов (в 1,3 раза), HF (в 1,7 раза), а также числа активных фагоцитов (в 1,3 раза) с выраженными дефектами завершенности фагоцитарного акта.

Выявленное угнетение фагоцитарной функции при иммунизации аллергеном сочеталось со снижением оксидазного микробицидного потенциала НГ животных. Так величина СЦИ и %ФПК в спонтанном тесте была выше контрольного уровня в 2 раза, но при дополнительной антигенной нагрузке in vitro не сохранялся адекватный/ответ, поскольку СЦИ и % ФПК при этом не отличались от таковых в спонтанном тесте и были достоверно выше фоновых значений.

Спустя 15 дней от введения аллергена наблюдалось восстановление общего количества лейкоцитов по сравнению с фоновыми значениями и показателями 1 группы, а относительное и абсолютное содержание НГ было достоверно ниже контрольных. При этом отмечено увеличение %ФАН (в 1,6 раза) и их поглотительной способности (увеличение ФИ в 1,3 раза) относительно таковых в 1 опытной группе. Однако переваривающая способность НГ была еще более значительно угнетена, чем в 1 группе животных: %П был снижен в 1,5 раза, а ИП — в 1,3 раза. Нарушение переваривающей функции фагоцитов может быть обусловлено выявленными дефектами оксидазной биоцидности НГ, поскольку как в первой, так и во второй группах отмечалось снижение величины коэффициента мобилизации в 3,5 и в 7 раз, соответственно.

Введение

интактным мышам ГМДП с оценкой эффектов через: 24 часа (5 группа) позволило выявить иммуностимулирующее его влияние на фагоцитарную и биоцидную функцию НГ у мышей. Так однократное введение препарата приводило к усилению переваривающей способности НГ, тогда как показатели их поглотительной способности оставались на уровне фоновых значений. Исследование кислород-зависимого метаболизма НГ в 5 группе мышей показало, что введение ГМДП привело к увеличению СЦИ и %ФПК в спонтанном тесте в 2 раза по сравнению с контролем с сохранением адекватного ответа на дополнительную антигенную нагрузку in vitro.

Ведение мышам ГМДП на пике продукции IgE (10 сутки) продемонстрировало его выраженные иммунотропные эффекты как ранние (через 24 часа — 3 группа), так и более отдаленные (через 5 суток — 4 группа). В частности, достоверно увеличивался %ФАН, усиливались процессы переваривания БАГ, как по сравнению с показателями 1 группы, так и по отношению к фоновым значениям. Наряду с этим спустя 24 часа после введения ГМДП на фоне иммунизации аллергеном наблюдается значительное увеличение СЦИ и %ФПК в спонтанном NBT-тесте, более выраженное (в 3 раза), относительно фоновых значений, а антигенная нагрузка in vitro выявила увеличение КМ на 18% относительно 1 группы животных.

Через 5 дней после однократного введения ГМДП иммунизированным аллергеном мышам (группа 4), общее количество лейкоцитов, процентное и абсолютное количество циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов восстанавливалось до уровня контрольных значений, тогда как на 15 сутки после иммунизации аллергеном отмечалась лишь слабая тенденция к нормализации данных показателей. Сравнение показателей фагоцитарной функции НГ на 5 день после введения препарата с соответствующими значениями фагоцитарной активности системы НГ на 15 день после введения аллергена свидетельствовало о позитивном иммунотропном эффекте ГМДП. Важно подчеркнуть при этом, что однократное введение ГМДП позволило восстановить все изучаемые показатели фагоцитарной функции НГ до фоновых значений.

Тестирование состояния кислород-зависимого метаболизма НГ у мышей 2 и 4 опытных групп в отдаленные сроки исследования выявило достоверное усиление его активности как в спонтанном NBT-тесте, так и при дополнительной антигенной нагрузке in vitro. При этом в 4 группе сохранялся адекватный ответ на антигенную нагрузку, сочетающийся с усилением переваривающей способности, а во 2-й группе (на 15 сутки после введения аллергена) отмечалась инверсия КМ и, как следствие, ухудшение процессов переваривания.

Таким образом, введение мышам ГМДП на пике продукции IgE продемонстрировало его выраженные иммунотропные эффекты (как в ранние, так и более отдаленные сроки), заключающиеся в восстановлении количества циркулирующих НГ, способных к активному фагоцитозу с усиленной поглотительной и переваривающей способностью, и высокой активностью кислород-зависимой микробицидной системы с восстановлением адекватного реагирования последней на дополнительную нагрузку бактериальным антигеном.

Уровень аллерген-специфических IgE-антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных аллергеном амброзии, определяли с помощью метода пассивной кожной анафилаксии по B. Levin, N. Vas (1970). Для этого иммунизацию мышей осуществляли внутрибрюшинным введением натив-ного аллергена амброзии (4 едмышь), хроматографически очищенного [Р.А.Ханферян, 2005].

Анализ полученных результатов продемонстрировал достоверное повышение содержания в сыворотке мышей содержания гомоцитотропных IgE-антител на 10 сутки после введения аллергена, тогда как на 15 сутки после однократного введения аллергена выявлено достоверное снижение уровня IgE-антител по сравнению с показателями, определяемыми на 10 сутки с сохранением превышения контрольного уровня данного показателя. Между тем введение мышам, иммунизированным аллергеном амброзии, ГМДП на пике продукции IgE (10 сутки) вызывало достоверное (р<0,01) снижение содержания аллергенспецифических IgE-антител в 3,6 раза. Обнаруженный достоверный эффект снижения содержания аллерген-специфических IgE-антител, индуцированный ГМДП, сохранялся и через 5 дней после введения последнего (в 2,2 раза от исходного). Следует заметить, что в основе ранних (через 24 часа после введения ГМДП) и более отдаленных (через 5 дней) эффектов ГМДП в отношении содержания в сыворотке гомоцитотропных IgE-антител могут лежать различные механизмы. Так спустя сутки после введения ГМДП мышам на пике продукции у них IgE, может происходить связывание избытка IgE активированными лимфоцитами, несущими С023-антиген, либо НГ, наличие на которых IgE-связывающего рецептора в настоящее время считается доказанным [А.А.Тотолян, И. С. Фрейдлин, 2000]. В то же время в основе снижения IgE в сыворотке крови мышей на 5-е сутки после введения ГМДП может находиться ГМДП-индуцированное усиление продукции макрофагами у-ИФН с последующим переключением дифференцировки наивных Тх в Тх 1 порядка [Б.В.Пинегин, Т. М. Андронова, М. И. Карсонова, 2005].

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования позволили установить достоверные иммуномодулирующие эффекты ГМДП как по отношению к дефектам функциональной активности НГ лабораторных мышей, иммунизированных аллергеном амброзии, так и по отношению к содержанию в сыворотке гомоцитотропных IgE-антител, что может иметь важное патогенетическое значение при лечении атопического дерматита и обуславливают целесообразность включения иммуномодулятора ликопид в комплексную терапию детей с обострением IgE-опосредованного АтД.

В отличие от изолированной комплексной терапии, при оценке имму-номодулирующих эффектов ликопида, включенного в таковую у детей с обострением IgE-опосредованного АтД среднетяжелого течения в суммарной дозе 25 мг спустя 1 месяц после начала терапии была установлена нормализация ряда функционально-значимых параметров функционирования НГ со снижением содержания в сыворотке общего IgE.

В частности, исследование рецепторного аппарата НГ показало, что использование комплексной традиционной терапии детей с обострением IgE-опосредованного АтД приводило к увеличению абсолютного и относительного количества НГ до уровня таковых показателей у здоровых детей, и снижению среди них количества CD 16- и CD95-(p>0,05), тогда как уровень CDllbи CD25- позитивных НГ не изменялся относительно исходных данных при АтД.

Включение в комплексную традиционную терапию ликопида у детей с обострением IgE-опосредованного АтД привело к восстановлению относительного и абсолютного количества нейтрофильных гранулоцитов до уровня показателей здоровых детей и к уменьшению проявлений гиперактивации НГ, выражающемуся в снижении относительного количества CD1 lb (+)-, CD16(+)-, CD25(+)-, CD95(+)-Hr до уровня контроля, а соответствующих абсолютных показателей рецепторной функции НГ к снижению в среднем на 25% относительно исходных значений до лечения.

Оценка фагоцитарной функции НГ продемонстрировало значительную эффективность проводимой комплексной иммунокорригирующей терапии, которая способствовала восстановлению функциональной активности НГ до уровня таковой у здоровых детей. В частности, показано, что после лечения ликопидом число активно-фагоцитирующих клеток и их переваривающая способность восстанавливались до показателей контроля, тогда как у больных, получавших изолированную традиционную терапию имела место лишь тенденция к увеличению показателей. Способность к поглощению БАГ в клинических группах также достоверно усиливалась, однако более выражено — после комплексной иммунотропной терапии. Позитивные эффекты иммунотропной комплексной терапии в отношении фагоцитарной функции НГ коррелируют с известными данными о том, что действуя на макрофагальное звено нммунокомпетентных клеток, ГМДП усиливает продукцию супероксид-аниона, значительно стимулируя завершенность фагоцитарного акта [E.Lederer, 1988; Б. В. Пинегин, Т. М. Андронова, М. А. Карсонова, 2005].

Исследование состояния микробицидной кислород-зависимой системы НГ у больных АтД, получавших в комплексной терапии ликопид, также позволило установить более значимое восстановление изучаемых показателей, чем при традиционной терапии заболевания. Изменение коэффициента мобилизации (КМ) четко отразило динамику активности микробицидной оксидазной системы НГ при обострении IgE-опосредованного АтД и в течение лечения. Полученные результаты указывают на достоверное (р<0,05) снижение величины КМ при АтД, на его повышение после традиционного лечения и на более выраженную, чем при традиционной терапии, нормализацию КМ после лечения с использованием ликопида.

Таким образом, полученные результаты в целом свидетельствуют о выраженном иммуномодулирующем влиянии ликопида, включенного в комплексную традиционную терапию, на состояние рецепторного аппарата, фагоцитарной функции и оксидазной биоцидности НГ у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита.

Обсуждая возможные механизмы клинико-иммунологической эффективности при лечении АтД, следует учесть, что главными мишенями действия ликопида в организме являются клетки моноцитарно-макрофагального ряда и НГ [Б.В.Пинегин, Т. М. Андронова, М. И. Карсонова, 2005; Н. В. Колесникова, 1999; М. Г. Кулагина, 2004; О. В. Первишко, 2006; М. Мохд, 2005], в которых он усиливает микроби-цидную функцию, образование активных форм кислорода, активность ли-зосомальных ферментов, цитотоксичность, экспрессию DR-антигенов HLA, синтез уинтерферона, ИЛ-1, ФНО, колониестимулирующих факторов (КСФ) и других цитокинов, что в целом приводит к адекватному реагированию со стороны врожденного и адаптивного иммунитета.

Исследование уровня IgE в клинических группах после включения в терапию ликопида позволило выявить достоверное снижение содержания общего сывороточного IgE. Так, если содержание общего IgE в сыворотке крови до лечения у детей с обострением IgE-опосредованного АтД почти Гв 5 раз превышал показатели практически здоровых детей того же возраста, и применение изолированной комплексной традиционной терапии практически не изменило его, то включение в комплексную терапию ликопида привело к снижению содержания IgE до значений контрольной группы спустя 1 месяц после начала терапии.

Резюмируя изложенное, следует сделать заключение о полученном нами доказательстве в эксперименте и клинике целесообразности включения иммуномодулятора ликопида в комплексную терапию детей с обострением IgE-опосредованного АтД. Определенный интерес представляют выявленные нами эффекты ликопида в отношении снижения содержания IgE в эксперименте in vitro на модели аллергии немедленного типа у мышей и у детей с обострением IgE-опосредованного атопического дерматита.

Поскольку главной задачей при лечении больных АтД является достижение ремиссии и более высокого качества жизни пациента при минимальных осложнениях, интерес представляла оценка клинической эффективности иммуномодулятора ликопид при обострении IgE-опосредованного АтД у детей .

Анализ анамнеза детей с обострением IgE-опосредованного АтД свидетельствовал о том, что большинство обследуемых имели сопутствующие заболевания в виде поллиноза рино-конюктивальной формы (у 23% пациентов), астмы (у 19%), аллергического ринита (у 10,8%), сухого ночного кашля (у 19%), однако на момент обследования у них не обнаруживались клинические признаки сопутствующих заболеваний и инфекций. Тем не менее дети имели склонность к развитию простудных заболеваний в виде острых респираторных инфекций (от 8 раз в год до 2-х раз в месяц) — у 47%, кроме того, 10,8% детей страдали ангинами, рецидивирующей стрептодермией — 4,8%, рецидивирующим фурункулёзом и ячменём -4,8%. Важно подчеркнуть, что почти у 60% детей обострение АтД совпадало с симптомами кишечной дисфункции (неустойчивый стул, склонность к запорам), дискинезии желчевыводящих путей (по данным УЗИ), диспанкреатизма. В группе обследуемых детей обострением IgE-опосредованного атопического дерматита была выявлена склонность к поражению вирусной инфекцией, в частности — вирусом простого герпеса у 24%, что объясняется снижением у пациентов с АтД цитотоксической способности естественных киллеров [F.S.Larsen et. al., 1985], а так же обнаруженной нами функциональной несостоятельностью системы фагоцитов.

Для объективной клинической оценки обследуемых детей с АтД на фоне традиционной комплексной терапии и терапии с включением ликопида, нами проводился анализ специальных карт, заполненных в соответствии с системой SCORAD, рекомендованных научно-практической программой «Атопический дерматит и инфекции кожи у детей: диагностика, лечение и профилактика» (2004), для оценки распространённости кожных поражений, так как клинические проявления атопического дерматита довольно многообразны и зависят от различных факторов, среди которых особое место занимает возраст, определяющий стадийность заболевания. Следует заметить, что данный подход к оценке клинической эффективности имму-нотропной терапии обусловлен рекомендациями по использованию системы SCORAD, как наиболее адекватного метода оценки эффективности новых методов лечения аллергических заболеваний в научных исследованиях.

Показано, что кожные проявления обострения IgE-опосредованного АтД у обследуемой группы детей носили полиморфный характер: кожа была сухая с сероватым оттенком, со скрытым или отрубевидным шелушением, высыпания имели эритематоинфильтративный характер. У большей части больных детей (66%) воспалительные фолликулярные и лихе-ноидные папулы сливались и образовывали очаги лихенификации, имелись экскориации. У 23% обследуемых детей наблюдалось утолщение нижних век с гиперпигментацией наружного угла глаз.

Проявления IgE-опосредованного АтД в стадии обострения укладывались преимущественно в 2 клинические формы: эритематосквамозную и лихеноидную, а так же отмечались сочетания вышеописанных клинических форм.

Изучение клинической эффективности терапии IgE-опосредованного АтД в стадии обострения с использованием в комплексном лечении ликопида показало, что уже через 1 месяц от начала ее применения наблюдалось сокращение площади поражения в 3,5 раза (при комплексной терапии — в 1,8 раза), а ко второму месяцу от начала сочетанной терапии площадь поражения кожи у детей сократилась в 3 раза (по сравнению с показателями через месяц лечения). При этом у 40% пациентов не выявлялись кожные проявления АтД.

Анализ интенсивности клинических проявлений АтД (В) через месяц от начала терапии выявил снижение индекса в обеих группах, однако более выраженным оно было в группе с применением ликопида (в 3,6 раза — через месяц, в 8,4 раза — через 2 месяца).

Оценка субъективных данных (кожный зуд и нарушения сна) уже на первом месяце сочетанной терапии свидетельствует об их более выраженном снижении (в 37 раз), чем на фоне изолированной комплексной терапии (в 6,3 раза), причем у 85% детей 1-й группы кожный зуд и нарушение сна к концу первого месяца терапии отсутствовали. Позитивный клинический эффект при этом можно объяснить известной способностью ликопида усиливать продукцию у-интерферона макрофагами [Б.В.Пинегин, Т. М. Андронова, М. И. Карсонова, 2005] и подтверждается данными S. Stevens et al. (1998) о высокой клинической эффективности в виде снижения кожного зуда при терапии пациентов с АтД рекомбинант-ным человеческим у-интерфероном с сохранением эффекта в течение 1−2 лет после терапии.

Установлено, что после иммунотропной терапии детей с обострением IgE-опосредованного АтД суммарное значение индекса SCORAD было снижено у больных 1-й группы в 4,2 раза (первый месяц лечения) и в 14 раз (второй месяц лечения), тогда как во 2-й группе отмечено снижение лишь в 2,5 раза и в 4,4 раза соответственно срокам лечения.

Проведённое исследование позволило заключить, что у иммуноком-прометированных больных детей с обострением IgE-опосредованного АтД, получавших в комплексной терапии ликопид, отмечались положительные клинико-иммунологические сдвиги со значительным улучшением клинических показателей, отражающих интенсивность, степень тяжести и распространённость патологического процесса, что может быть во многом обусловлено способностью ликопида вызывать снижение содержания в сыворотке крови пациентов патогенетически значимого IgE.

Полученные результаты исследования свидетельствует о целесообразности включения ликопида в комплексную терапию лечения IgE-опосредованного АтД среднетяжёлой формы в стадии обострения, позволяющего обеспечить более полный контроль за течением заболевания и существенно улучшить качество жизни растущего организма, а также открываю перспективы к дальнейшему изучению эффектов данного иммуномодулятора при аллергических заболеваниях.