Медико-генетические аспекты обследования супружеских пар с бесплодием, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ.

Более двадцати лет назад было положено начало успешному лечению женского бесплодия с помощью прогрессивного метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (метод ЭКО и ПЭ) женщине. Благодаря расширению методов ЭКО и ПЭ, применению интраплазматической инъекции одного сперматозоида в ооплазму яйцеклетки (ИКСИ), в настоящее время удается преодолевать ранее неизлечимые тяжелые формы мужского бесплодия.

Преодоление бесплодия с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) высветило важную проблему — получение здорового потомства. Возникновение патологических состояний репродуктивной системы часто обусловлены хромосомными аномалиями, генными мутациями и наличием наследственной предрасположенности к заболеванию. По данным Loan et al. (1987) и Ворсановой с соавт. (1995) каждая 8 супружеская пара с нарушением репродуктивной функции нуждается в проведении цитогенетического исследования лимфоцитов крови. Jacobs et al. (1974) и Thompson et al. (1991) обнаружили среди супружеских пар с бесплодием повышенную частоту сбалансированных транслокаций в десятки раз по сравнению с популяцией. Однако к настоящему времени не определены частота и характер аберраций кариотипа у супружеских пар с бесплодием, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ.

Дополнительным риском формирования аномальных гамет при суперовуляции у супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ является мощная гормональная терапия, необходимая для стимуляции. В связи с вышесказанным, пациенты программы ЭКО и ПЭ,.

ИКСИ нуждаются в медико-генетическом обследовании до применения к ним ВРТ.

Особое место в структуре бесплодия отводится мужскому фактору, который по данным В. И. Кулакова и Б. В. Леонова (2000) составляет 50%. Существует ряд причин, приводящих к бесплодию у мужчин. Одной из них являются нарушения сперматогенеза, обусловленное хромосомными аберрациями кариотипа (Testart, 1996). Другими причинами, приводящими к бесплодию у мужчин, являются различные физические, химические или биологические факторы, также приводящие к нарушению сперматогенеза: олиго-, астеноили тератозооспермия (ОАТ). Очевидно, что помимо развития патозооспермии, причиной бесплодия может служить гормональный дисбаланс, нарушения эвакуации половых клеток, копуляция и др.

В настоящее время нет единого мнения о том, существует ли корреляция между нарушениями сперматогенеза и изменением набора хромосом в сперматозоидах. Pang et al. (1999) обнаружили высокую долю дисомии в сперматозоидах мужчин, включенных в программу ИКСИ по сравнению с контролем (5.4% и 0.2% соответственно). По данным других исследователей (Colombero et al., 1999) частота анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин с нарушением сперматогенеза были 2.7% и 1.8% в контроле соответственно.

В связи с этим, важным является выяснение частоты ошибок в хромосомном наборе сперматозоидов при различных формах нарушений сперматогенеза, а также обнаружение корреляции кариотипа пациента с формой заболевания и частотой хромосомных аберраций в сперматозоидах. Кроме того, остается неясным, существует ли корреляция между наличием нормального и/или аберрантного кариотипа в лимфоцитах крови и изменением хромосомного набора в половых клетках мужчин с нормозооспермией и ОАТ (Шаронин, 1998). К настоящему времени в литературе высказаны противоречивые мнения и имеются немногочисленные данные по этим вопросам (Blanco, 2000; Colls, 1997; Estop, 2000; Morel, 2001), поэтому продолжение исследований в этом направлении необходимо.

Изучение корреляции между нарушениями хромосом в соматических и половых клетках расширяют представления о механизмах генетического контроля этого процесса. Изучение характера хромосомных аномалий в половых клетках необходимо для понимания механизмов их происхождения и наследования. Это стало более актуальным с момента использования репродуктивных технологий, поскольку к последним прибегают супружеские пары в возрасте за 35 лет, когда возрастает риск рождения ребенка с хромосомными аберрациями (ПрокофьеваБельговская, 1986).

Происходящие в мейозе процессы давно волнуют исследователей в области биологии и медицины. Исследования половых клеток до середины 70-х годов проводили с использованием светового микроскопа. В 80−90 годах была усовершенствована техника приготовления тотальных препаратов мейотических хромосом из яичек (материал биопсий). С 1978 г совершенствуется и используется техника экстракорпорального оплодотворения ооцитов золотистого хомячка сперматозоидами человека. (Дыбан, 1970; Holm et al., 1983; Rudak et al.- 1978; Solari, 1980). В настоящее время одним из наиболее информативных доступных методов для исследования хромосом в сперматозоидах является молекулярно-цитогенетический FISH метод (Флуоресцентная in situ гибридизация) который позволяет идентифицировать определенные хромосомы или их локусы (Курило, 1989).

Исследования поведения гоносом в процессе мейоза не только расширят возможности диагностики форм мужского бесплодия, но и помогут в расшифровке патогенетических механизмов их развития, что в свою очередь, будет способствовать разработке лечебных и профилактических мероприятий в практическом здравоохранении (Курило, 1989).

Для исследования сперматозоидов многие авторы рекомендуют использовать зонды к специфическим участкам хромосом X и Y, для анализа дисомии гоносом в зрелых гаметах, даже в тех случаях, когда в кариотипе лимфоцитов периферической крови имеются хромосомные перестройки аутосом (Blanco, 2000; Colls, 1997; Estop, 2000; Morel, 2001,). Существует мнение о том, что аберрации хромосом в кариотипе периферической крови влияют на общие процессы мейоза, вызывая их нарушения. В половых клетках образуются хромосомные изменения, связанные не только с выявленными в лимфоцитах периферической крови аберрациями хромосом, но и мутации de novo. Это явление получило название — «интерхромосомный эффект» (Blanco et al, 2000).

Таким образом, перед введением пациентов в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ требуется проведение медикогенетического консультирования с включением цитогенетического и молекулярно-цитогенетического обследования не только лимфоцитов периферической крови, но и половых клеток. Важно информировать супружеские пары о характере генетических изменений (если таковые имеются), о риске наследования хромосомных и генных нарушений потомством, о возможностях прегтплантационной генетической диагностики, т.к. решение о лечении путем вспомогательных репродуктивных технологий, включая ИКСИ, принимает супружеская пара.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Определить частоту и характер хромосомных аберраций у супружеских пар в лимфоцитах периферической крови, а также в сперматозоидах у мужчин с нормозооспермией и у мужчин с ОАТ, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ в связи с бесплодием. Выявить корреляцию между кариотипом в лимфоцитах периферической крови и частотой нерасхождения гоносом в сперматозоидах у мужчин программы ЭКО И ПЭ, ИКСИ.

Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:

1) оценить семейный анамнез и провести цитогенетическое обследование супружеских пар программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ по лимфоцитам периферической крови;

2) выявить корреляцию по частоте хромосомных изменений в лимфоцитах периферической крови и частотой нерасхождения хромосом X и Y в сперматозоидах у мужчин с нормозооспермией и у мужчин с ОАТ;

3) разработать показания к применению молекулярно-цитогенетического метода у мужчин программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ для выявления хромосомных аберраций в сперматозоидах;

4) разработать показания к формированию группы риска по рождению детей с хромосомной патологией среди пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые определены особенности кариотипа супружеских пар, страдающих бесплодием и включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ, выявлены удельный вес и тип хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови.

Впервые определена частота нерасхождения X и Y хромосом в сперматозоидах у мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ. Выявлено соотношение клонов с нормальным и аберрантным хромосомным набором (по дисомии гоносом) в сперматозоидах у мужчин с нормозооспермией и/или с ОАТ.

Разработаны показания к применению молекулярно-цитогенетического метода (FISH) при нарушениях репродуктивной функции у мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Полученные данные позволяют расширить и углубить рамки медико-генетического консультирования, а также указывают на необходимость проведения цитогенетического обследования обоим супругам, нуждающимся в лечении бесплодия методами ВРТ. Разработаны рекомендации для проведения молекулярно — цитогенетического исследования сперматозоидов у мужчин с различными показателями спермограммы, а также лимфоцитов периферической крови у пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ при подозрении на хромосомный мозаицизм. Разработаны рекомендации для проведения молекулярноцитогенетического исследования лимфоцитов крови и сперматозоидов у пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ.

Результаты исследования позволяют составить индивидуальный алгоритм лечения методами ВРТ конкретной супружеской пары и разработать рекомендации по формированию группы риска пациентов, у которых в потомстве могут быть хромосомные изменения. Проведение преимплантационной с последующей пренатальной диагностик, с целью профилактики рождения детей с хромосомной патологией, позволяет повысить эффективность программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Высокая частота хромосомных аберраций в кариотипе пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ по сравнению с общепопуляционными показателями, обусловливают необходимость проведения медико-генетического консультирования с проведением цитогенетического исследования по лимфоцитам периферической крови обоим супругам до начала применения вспомогательных репродуктивных технологий.

2. Между кариотипом, установленном по лимфоцитам периферической крови и частотой нерасхождения половых хромосом в сперматозоидах выявляется четкая корреляция. При наличии хромосомных аберраций в кариотипе лимфоцитов периферической крови повышается частота нерасхождения гоносом в мейозе.

3. У мужчин с нарушением сперматогенеза выявляется высокая частота анеуплоидии гоносом в сперматозоидах, что свидетельствует о существовании корреляции между особенностями сперматогенеза и хромосомным набором в сперматозоидах. В связи с этим, необходимо обязательное молекулярно-цитогенетическое исследование сперматозоидов мужчин с отклонениями в показателях спермограммы: пониженной концентрации сперматозоидов, при сниженной их подвижности и отклонении морфологии даже при нормальном кариотипе в лимфоцитах крови.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

: Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель включает 156 литературных источника, из которых 45 работы отечественных и 111 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ.

1. До включения в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ, супружеским парам необходимо пройти медико — генетическое консультирование в комплексе с исследованиями: кариотипа в лимфоцитах периферической кровисперматозоидов молекулярно — цитогенетическим FISH методом (по показаниям) — преимплантационной и/или пренатальной диагностик (при проведении программы).

2. У женщин из супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, доля хромосомных изменений в кариотипе лимфоцитов периферической крови была обнаружена в 9% наблюдений, что значительно выше, чем у мужчин этой же программы — 2%. Основные хромосомные изменения у женщин программы ЭКО и ПЭ представлены аберрациями в комплексе половых хромосом с преобладанием хромосомного мозаицизма — в 7 наблюдениях из 9 (78%).

3. Мужчины из супружеских пар, включенных в программу ИКСИ, имеют высокую частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови (11%>) по сравнению с женщинами этой же программы — 1%. Хромосомные аберрации аутосом у мужчин программы ИКСИ составляют основную долю хромосомных изменений — в 7 наблюдениях из 11 (63%).

4. Существует корреляция между кариотипом мужчин в лимфоцитах крови и частотой нерасхождения хромосом X и Y в сперматозоидах. Высокая доля анеуплоидии гоносом в сперматозоидах наблюдается у мужчин с изменениями в комплексе половых хромосом. Только у пациентов с кариотипом 47, XYY соотношение частоты нерасхождений в сперматозоидах хромосом YY к хромосомам XX больше единицы. Хромосомные аберрации аутосом могут привести к нарушению расхождения половых хромосом в мейозе, что подтверждает теорию существования интерхромосомного эффекта.

5. У мужчин с нормальным кариотипом существует корреляция между особенностями сперматогенеза (олиго, — астено, — терато, ОАТ) и повышенной частотой анеуплоидии гоносом в сперматозоидах. При ОАТ наблюдается наиболее высокая частота нерасхождения хромосом X и Y в сперматозоидах -0.83%.

6. У мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ с нормальным кариотипом и пограничными показателями спермограммы, а также у мужчин с изменениями в кариотипе и нормальными показателями спермограммы, наблюдается повышенная частота сперматозоидов с нерасхождением гоносом относительно мужчин группы сравнения (0.5%- 1.7% (средний) и 0.21% соответственно). Этим мужчинам следует проводить исследование частоты нерасхождения хромосом в сперматозоидах FISH методом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Пациентам с бесплодием перед включением их в программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ рекомендуется пройти медико — генетическое консультирование.

2. Исследование кариотипа лимфоцитов периферической крови следует проводить обоим супругам программ ЭКО и ПЭ, ИКСИ.

3. При подозрении на мозаицизм у пациентов программ ЭКО и ПЭ, ИКСИ необходимо проведение молекулярно — цитогенетического исследования лимфоцитов крови для уточнения процентного соотношения клонов с нормальным и аберрантным кариотипом.

4. Мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, с нормальным кариотипом и пограничными показателями спермограммы (по концентрации, подвижности и морфологии), а также мужчинам с изменениями в кариотипе и нормальными показателями спермограммы, необходимо проведение молекулярно — цитогенетического исследования половых клеток с целью определения индивидуального уровня сперматозоидов с анеуплоидией.

5. Мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ИКСИ и имеющих отклонения в спермограмме, рекомендуется проведение молекулярно — цитогенетического исследования половых клеток с целью определения индивидуального уровня сперматозоидов с анеуплоидией.

6. Супружеским парам, в которых один из супругов является носителем хромосомных аберраций в кариотипе по лимфоцитам периферической крови, а также, если у мужей в сперматозоидах имеется повышенная частота анеуплоидии, и у которых беременность наступила в программе ЭКО и ПЭ, ИКСИ, следует соответственно проводить преимплантационную и/или пренатальную диагностики.