Изучение условий биосинтеза, выделения и свойств рестриктазы Sal Gl из Streptomyces albus G

Актуальность темы

.

Открытие ферментов рестрикций-модификаций оказало значительное влияние на исследование в области нуклеиновых кислот.

На сегодняшний день из двух составляющих систем рестрикций-модификаций наибольшее практическое применение нашли рест-рикционные эндонуклеазы П типа. Рестриктазы в наши дни стали важнейшими инструментами молекулярной биологии, поскольку они дали возможность расщеплять ДНК у специфических нуклеотидных последовательностей. Благодаря этому стало возможным бурное развитие физического картирования ДНК, определение ее нуклео-тидной последовательности и, что самое важное, открыло широкие возможности для развития генной инженерии. Все эти успехи стали реальностью в большой степени благодаря открытию рестрикционных эндонуклеаз П типа.

Применение в широких масштабах рестрикционных эндонуклеаз делает актуальным поиск новых методов их очистки с целью получения чистых ферментов с большим выходом и за более короткое время. Поэтому большое научное и практическое значение имеют исследования по поиску продуцентов рестриктаз, изучению условий их выделения и очистки.

В настоящее время, несмотря на то, что известно большое количество рестриктаз, применяемых в генной инженерии, их свойства недостаточно изучены. Также мало сведений о факторах, влияющих на их биосинтез в клетке, так как в основном рестрик-ционные эндонуклеазы П типа используются в качестве аналитических инструментов. Важно отметить и то, что производство чистых препаратов рестриктаз мало развито и поэтому разработка технологии получения данных ферментов является задачей важной и актуальной для дальнейшего развития биотехнологии и методов генной инженерии.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось изучение факторов, влияющих на накопление рестриктазы sai Gl культурой strepto-myces albus g, а также разработка методов выделения и очистки из ее биомассы рестриктазы sal Gl и изучение некоторых ее свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— изучение влияния фазы роста на содержание рестриктазы Sai Gl в биомассе;

— оптимизация состава питательной среды, обеспечивающей максимальное накопление фермента;

— изучение условий выделения и очистки рестриктазы Sai gi ;

— йсследование некоторых физико-химических и каталитических свойств фермента.

Научная новизна.

Впервые проведена оптимизация состава питательной среды методами математического планирования экспериментов, обеспечивающая высокое накопление рестриктазы sai gi и установлена взаимосвязь между фазой роста культуры s. albus G и ее способностью накапливать в биомассе максимальное количество фермента.

Разработана простая и эффективная схема выделения и очистки рестриктазы sai gi до электрофоретически гомогенного состояния и впервые показана применимость хроматографии на.

ДЭАЭ-трисакриле вместо ДЭАЭ-целлюлозы, который ранее не применялся для очистки рестриктаз. Определены Km и vmax фермента и впервые установлена изоэлектрическая точка для рестриктазы.

Sal gl ИЗ Streptomyces albus g.

Определены оптимальные для действия фермента условия проведения реакции, и изучены влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы sai gi .

Практическая ценность работы.

В результате проведенных исследований оптимизированы условия культивирования продуцента рестриктазы sai gi: streptomyces albus g и разработан способ выделения в высокоочищенном виде этого фермента. Получены исходные данные, необходимые для создания лабораторного регламента по получению эндонуклеазы рестрикции. Выполненные исследования могут послужить основой для развертывания в КНДР и СССР выпуска этого фермента. Помимо этого, изучение и оптимизация условий осуществления реакции гидролиза ДНК даст возможность более широко и эффективно применять рестриктазу sai c-i в генноинженерных экспериментах.

— 9.

Выход.