Определение чистых культур с помощью секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) участков генома

Во многих случаях у выделенных в чистую культуру организмов не удается получить те структуры, которые бы позволили определить объект до вида (конидиеносцы с конидиями, половое спороношение и др.). В этом случае остается один выход — секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) участок генома изучаемого фитопатогена и поискать аналогичный фрагмент, но которому можно определить объект до вида, в базе данных. Для грибов, как правило, используют последовательности ядерных и митохондриальных рибосомных генов и межгениых участков (спейсеров); для бактерий — участок рибосомного гена 16S. Для других групп живых организмов используются и некоторые другие участки генома.

Для того чтобы секвенировать определенный участок генома, сначала надо его выделить из общей массы ДНК и размножить. Проще всего сделать это с помощью ПЦР (см. подпараграф 5.4.3). Использование ПЦР позволяет многократно увеличить число копий нужного участка генома и использовать его для дальнейшего секвенирования. После секвенирования полученную последовательность нуклеотидов можно сравнить с имеющимися в мировых базах последовательностями известных живых организмов. Если кто-то уже секвеиировал эту последовательность у известного живого организма, то высокое сходство с ней (близкое к 100%) позволит успешно определить исследуемый объект. Наиболее популярен при сравнении последовательностей поисковик Blast базы данных Genbank (ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Трудности при определении с помощью секвенирования могут возникнуть в том случае, если культура не является микробиологически чистой, т. е. в ней присутствуют сопутствующие микроорганизмы. Участки генома сопутствующих микроорганизмов могут амплифицироваться теми же праймерами, что используются и для целевого организма. В этом случае не удастся достоверно прочитать амплифицированную последовательность нуклеотидов. Отделить ДНК целевого фитопатогена от сопутствующих можно с помощью клонирования в клетках бактерии Escherichia coli. Методы клонирования описаны во многих учебных и методических пособиях, а также в справочном разделе сайта molbiol.ru. Можно также попытаться провести очистку культуры исследуемого микроорганизма микробиологическими методами, как описано выше (см. параграф 5.2).