Полимеразная цепная реакция, ее модификации и применение для идентификации фитопатогенных организмов

ПЦР была изобретена в 1983 г. американским биохимиком Кэри Муллисом^[1].

Для того чтобы понять, как работает метод ПЦР, представим цепочку ДНК в виде закрученной винтовой лестницы, состоящей из двух цепей — «перил», удерживаемых вместе «ступеньками» — парами азотистых оснований, соединенных водородными связями. Оснований (дезоксирибонуклеотидов) всего четыре: производные аденина (А), гуанина (Г), цитозина © и тимина (Т).

В двойных цепочках ДНК остатки аденина связаны только с остатками тимина, а остатки гуанина — только с остатками цитозина. Это называется принципом комплементарности, который позволяет ДНК воссоздавать саму себя. При репликации двойная цепь разделяется, и каждая из нитей служит матрицей для создания еще одной цепочки. Строит цепочку в соответствии с принципом комплементарности фермент ДНК полимераза:

напротив аденина на матрице он присоединяет к строящейся цепи тимин, а напротив гуанина — цитозин.

При ПЦР каждая построенная цепочка служит матрицей для следующей цепочки и т. д. В результате размножение построенных цепочек (называемых обычно «ампликон» или, в совокупности, «ПЦР-продукт») происходит почти в геометрической прогрессии (рис. В.9).

В результате ПЦР получается ПЦР-продукт, представляющий собой многократно умноженный участок исходной ДНК, ограниченный прямым и обратным праймерами. В качестве праймеров используют короткие (около 20 нуклеотидов) фрагменты ДНК. Детально механизм ПЦР будет рассмотрен в подпараграфе 5.4.3.

Таким образом, ПЦР — быстрый и удобный метод обнаружения и многократного увеличения (амплификации) определенных участков генома, причем искомый фрагмент может присутствовать в очень малых количествах среди огромного количества других фрагментов ДНК. Это обеспечивает очень высокую чувствительность метода ПЦР. Метод удобен и тем, что его проведение обеспечивается работой всего одного фермента — ДПКполимеразы, и он может быть в высокой степени автоматизирован.

В самом общем случае проведение ПЦР сводится к следующему: в тонкостенную микропробирку помещается смесь реактивов, включающая прямой и обратный праймеры, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP), фермент ДНК-полимеразу и буфер для него, деионизованную воду, соли магния, дающие при диссоциации ионы Mg²⁺. Последней в смесь добавляют небольшое количество (обычно не более 1 мкл при концентрации ДЫК в растворе от 50 до 1000 нг/мкл) исследуемой ДНК. После приготовления смесь в пробирке помещают в специальный прибор — термоциклер, обеспечивающий прохождение ПЦР. После ПЦР остается только зафиксировать результаты: либо их визуализировать (сделать видимыми) на агарозном геле, либо зафиксировать каким-либо другим способом.

Смесь для проведения ПЦР включает следующие компоненты:

• 1. ДНК-матрицу, содержащую тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. В нашем случае это будет выделенная из чистой культуры или из пораженного участка растения ДНК. В пробу (пробирку) обычно добавляют от 50 до 1000 нг ДНК.
• 2. Праймеры — короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало или конец амплифицируемого участка. Оптимальная концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 0,1—0,5 мкмолей. Прямой праймер совпадает с одной из цепей ДНК амплифицируемого участка, а обратный — совпадает с комплементарной нитью и пишется в обратном направлении.
• 3. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который проводит реакцию полимеризации ДНК, т. е. удлиняет строящуюся цепь с 3' конца, наращивая ее нуклеотидами, комплементарными цепи ДНК-матрицы. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность после инкубации при 95 °C. Поэтому широкое использование получили полимеразы, выделенные из термофильных бактерий: Thermits aquaticus (Taq- полимераза), Thermus thermophilus (Tth-полимераза), Pyrococcus furiosus (Рfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Рwо-полимераза) и др. Для разных приложений ПЦР используют разные ферменты или их смеси. В настоящее время большинство ферментов получают путем наработки в генетически модифицированных клетках Escherichia coli или в других системах экспрессии генов. Основными характеристиками полимераз служат скорость работы, наличие 5'—3' или 3'—5' экзонуклеазной активности, наличие в ампликонах выступающих 3' концевых нуклеотидов. Выраженная 5' 3' экзонуклеазная активность помогает ферменту расчищать себе путь на ДНК-матрице, удаляя случайно присоединившиеся к ней нуклеотиды и олигонуклеотиды. Полимеразы с хорошей 5'—3' экзонуклеазной активностью быстро работают, по могут вносить ошибки в строящуюся цепь и не способны их корректировать. 3'—5' экзонуклеазная активность служит для коррекции ошибок в строящейся цепи нуклеотидов. В случае обнаружения ошибки фермент, обладающий 3'—5' экзонуклеазной активностью, может разрушить участок цепи до места ошибки (т.е. вернуться назад), скорректировать се и построить цепь заново.

При постановке ПЦР чаще всего используют Taq-полимеразу. Фермент представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой около 95 кДа. Это высокопроцессивный (быстро работающий) фермент, который может амплифицировать фрагменты длиной 2—3 тыс. пар нуклеотидов (максимально до 5 тыс. пн). У него хорошо выражена 5'—3' экзонуклеазная активность и нет 3'—5' экзонуклеазной активности. Получаемые при использовании Год-полимеразы ПЦР-фрагменты содержат выступающий З'-концевой нуклеотид (аденозин), что позволяет эффективно клонировать ПЦР-продукт в векторы с З'-выступающим тимидином.

Tth-полимераза по свойствам близка к Га#-полимеразе. Это высокопроцессивный фермент с массой 94 кДа, высокой 5'—3' экзонуклеазной активностью и отсутствующей 3'—5' экзонуклеазной активностью. Особенностью Tth-полимеразы является наличие ревертазной активности, т. е. способности использовать в качестве матрицы молекулу РНК. Поэтому ее используют в тест-системах, предусматривающих проведение обратной транскрипции и ПЦР в одной пробирке, что очень удобно при анализе PHК-содержащих вирусов. Синтез ДНК по матрице РНК происходит также в направлении 5' —" 3' в присутствии ионов Мп²⁺. Получаемые при использовании Tth -полимеразы ПЦР-фрагменты содержат выступающий З'-концевой нуклеотид (аденозин).

Pwo- и Рfu-полимеразы обладают меньшей скоростью синтеза по сравнению с Taq- и Tth-полимеразами, образуют «тупые концы» без выступающих нуклеотидов и не имеют 5'—3' экзонуклеазной активности. Однако они обладают 3'—5' (корректирующей) экзонуклеазной активностью, что позволяет применять их в случаях, когда необходимо получение продукта с высокой точностью синтеза (например для последующего секвенирования). Рfu-полимеразу используют для «полировки» ПЦР-фрагментов, т. е. удаления выступающих З'-концевых фрагментов. Это может понадобиться при необходимости клонирования полученных с помощью Taq- или Tth-полимераз ПЦР-фрагментов по тупым концам. Для «полировки» проводят дополнительную инкубацию ампликона с Рfu-полимеразой.

• 4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTPs), представляющие собой смесь dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Это «строительный материал», из которого полимераза строит новые цепи ДНК. Концентрация dATP, dGTP, dCTP, dTTP в смеси должна быть одинаковой; неравная концентрация ведет к увеличению ошибок ДНК-полимеразы. Оптимальная концентрация dNTPs в реакционной смеси 200 мкмолей (4×50 мкмолей).
• 5. Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Ионы Mg²⁺ образуют растворимые комплексы с dNTPs, формируя субстрат для ДНКполимеразы. Оптимальной считается концентрация ионов магния 2 ммоля (при суммарной концентрации dNTPs 200 мкмолей). При увеличении концентрации dNTPs следует увеличивать и концентрацию ионов Mg²*. Концентрация ионов магния в смеси может колебаться в пределах 1 —5 ммолей. Повышение концентрации ионов магния увеличивает вероятность неспецифического отжига праймеров; понижение концентрации может снижать выход ПЦР-продукта. Для достижения оптимальных результатов можно рекомендовать подбирать концентрацию ионов Mg²⁺ опытным путем.
• 6. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции. Прежде всего, буферный раствор должен поддерживать оптимальный pH среды в диапазоне от 8,0 до 9,0.
• 7. Минеральное масло, необходимое для предотвращения испарения реакционной смеси. В пробирку добавляют масло с высокой температурой кипения, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

ПЦР проводят в программируемом термостате (амплификаторе) приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °С. Основой современного амплификатора служат полупроводниковые термоэлектрические элементы Пельтье. Они представляют собой «тепловые насосы», переносящие тепло с одной грани элемента на другую при прохождении электрического тока. В зависимости от направления тока один и тот же элемент может работать и как охладитель, и как нагреватель, что очень удобно в портативных конструкциях. Для ускорения нагрева термоблока в него, кроме элементов Пельтье, устанавливают резистивные нагреватели. ПЦР-аппарат тем лучше, чем быстрее происходит смена температурных режимов.

Другим показателем качества амплификатора является равномерность распределения температуры по всему термоблоку. В некоторых моделях термоциклеров используют термоблок с возможностью установки градиента температуры: температура с одной стороны блока может быть задана на несколько градусов выше, чем с другой. Такая конструкция упрощает подбор оптимальной температуры отжига праймеров при проведении ПЦР. Хороший амплификатор не должен менять свои характеристики в течение всего срока службы — не менее 10 лет (рис. В.10)^[2].

• [1] Изобретение К. Муллиса было удостоено Нобелевской премии 1993 г.
• [2] URL: dna-technology.ru (дата обращения: 20.08.2015).