Методы исследований феромонов насекомых

При изучении феромонной коммуникации насекомых исследуются механизмы выделения феромонов, особенности распространения и восприятия феромонного сигнала, цели феромонной коммуникации у определенных видов насекомых, вопросы практического использования феромонов насекомых для управления поведением хозяйственно важных для человека видов. Различные аспекты феромонной коммуникации насекомых находятся на стыке многих естественных научных дисциплин, таких как этология (поведение насекомых), химическая экология (внутривидовые взаимоотношения организма и среды обитания, регулируемые биологически активными веществами), химия (идентификация и синтез феромонов), цитология, морфология и физиология (механизмы выделения и восприятия феромонов), молекулярная биология (молекулярные механизмы хеморецепции) и другие.

Первичные исследования феромонов насекомых и их аналогов включают следующие основные стадии:

• — обнаружение, выделение и идентификацию компонентов природных феромонов различными методами химического анализа или сочетанием этих методов;
• — синтез аналогов природных феромонов насекомых;
• — лабораторные испытания синтетических аналогов феромонов при помощи методов электроантеннографии и ольфактометрии с целью выявления наиболее аттрактивных форм;
• — полевая оценка (полевой скрининг) биологической активности выявленных компонентов.

Как указывалось ранее, впервые химический состав феромона насекомого смог установить А. Бутенандт в 1959 г. Для выделения 6,4 мг бомбикола, полового феромона самки тутового шелкопряда, ему и его команде потребовалось 20 лет тщательных экспериментов и около 500 тыс. самок шелкопряда. Бутенандт и его первые последователи для выделения феромонов использовали экстракцию кончиков брюшка самок тутового шелкопряда, в которых расположена феромонная железа, органическими растворителями. При этом точность этого метода была невысокой, требовалось большое количество насекомых и многоступенчатая очистка феромона. В 1960—1970;х гг. для идентификации феромонов исследователи начали использовать такие методы анализа, как газовая хроматография, массспектрометрия и спектрометрия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (рис. 20). К1965 г. были синтезированы феромоны 3 видов насекомых, к 1972 г. — 37 видов, к 1984 г. — более 200. К 1982 г. были получены данные о строении феромонов более чем 600 видов, к 1986 г. — более 1000 видов чешуекрылых и нескольких сотен других видов насекомых. Развитие высокоточных методов химии позволило к настоящему времени получить сведения о составе феромонов нескольких тысяч видов насекомых из 17 отрядов.

Исследования феромона начинают с изучения особенностей биологии насекомого. Необходимо знать, самец или самка выделяют феромон, как происходит их коммуникация и спаривание. Так, у большинства видов самка выделяет феромон, который привлекает самцов, однако встречается и обратное — например, у большой вощинной огневки (Galleria mellonella L.) — бабочки, чьи гусеницы повреждают пчелиные соты и вощину в ульях, самец выделяет феромон, привлекающий самок. Активные вещества феромона могут быть выделены различными методами экстракции, начиная с перегонки с паром, вымачиванием в растворителе целого насекомого или его частей, экстракции бумаги, на которой выращивают насекомых, и кончая улавливанием вещества из воздуха. В настоящее время наиболее распространен метод выделения феромона из воздуха над живыми насекомыми или пропускания потока воздуха через сосуд, где находится насекомое. В обоих случаях воздух с феромоном пропускают через фильтр из активированного угля; затем адсорбированный на нем феромон смывают и анализируют при помощи различных методов, таких как газовая хроматография, хроматомасс-спектрометрия, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, или комбинации этих методов (см. рис. 20). Установив структуру одного или нескольких компонентов феромона, можно синтезировать их в лабораторных условиях. Синтезированные соединения оценивают при помощи метода электроантеннографии (ЭАГ), реакции антенны насекомого на специфический феромон или биотеста в ольфактометре, специальном устройстве для наблюдения за реакцией насекомого на феромон.

Рис. 20. Современное оборудование для идентификации феромонов насекомых (ориг.):

А — газовый хроматограф и масс-селективный детектор;

Б — электроантеннографическая приставка Метод электроантеннографии был разработан немецким биологом Д. Шнейдером в 1957 г. Он предположил, что антенна насекомого при попадании на нее молекул феромона продуцирует электрический импульс, который можно зарегистрировать (см. рис. 20 Б). Удалив антенну самца тутового шелкопряда и поместив ее в физиологический раствор, чтобы поддерживать клетки живыми, он затем составил цепь из антенны, двух электродов и регистрирующего устройства. В эту систему был направлен поток воздуха, содержащий половой феромон, что немедленно вызвало электрический импульс. Экстракт с феромоном самки тутового шелкопряда Шнейдеру предоставили сам А. Бутенадт и его команда, в то время работавшие над установлением структуры феромона. Этот метод используется и по сегодняшний день, поскольку он, ввиду высокой видоспецифичности феромонов, исключительно эффективен и по чувствительности превосходит любую аналитическую аппаратуру. ЭАГ может использоваться и на этапе идентификации феромона в сочетании с газовой хроматографией.

Смесь веществ, содержащая феромон, разделяется в колонке хроматографа, а затем каждый из компонентов тестируется на антенне насекомого, что позволяет определить вещество, являющееся феромоном.

В 1975 г. ученые X. Эрн, Э. Стедлер и С. Раушер предложили при идентификации феромонов насекомых использовать электроантеннографическую детекторную систему, основанную на сочетании методов газовой хроматографии (ГХ) и электроантеннографии. При этом вещества феромона, разделенные на фракции в газовом хроматографе, подаются на антенну целевого вида насекомого, что позволяет регистрировать реакцию антенны на каждый компонент.

Такое сочетание техник значительно ускоряет процесс исследования феромонов насекомых, позволяя идентифицировать компоненты феромона в течение нескольких недель или даже дней. Техника использования ГХ-ЭАГ сводится к тому, что в газовый хроматограф вводится экстракт феромона или его активная фракция; выходящие из хроматографа компоненты собираются с интервалом 1—2 мин, а затем биотестируются при помощи электроантеннографии. Компоненты, дающие максимальный ЭАГ-сигнал, считаются потенциальными компонентами феромона. Преимущество метода ГХ-ЭАГ состоит в том, что он нуждается в ограниченном количестве особей для экстракции (50—200 особей) и поэтому особенно важен при идентификации минорных компонентов феромона, которые могут быть невидимы на хроматограмме, но давать сигнал ЭАГ, так как чувствительность антенны насекомого на много порядков выше чувствительности хроматографа. Преимущество биотестирования с помощью ЭАГ перед поведенческим или даже полевым биотестом состоит в том, что минорные компоненты феромона, которые сами по себе могут быть и неактивными, всегда дают сигнал на электроантеннограмме и не могут быть пропущены при выделении из природного материала. По размерам пиков на хроматограмме природного экстракта феромона возможно установить соотношение компонентов, приближающееся к природному, составить смесь из идентифицированных таким образом компонентов и проверить ее в полевых условиях.

Методика проведения биотестов в ольфактометре была разработана в 1970;х гг. английским биологом Д. Кеннеди. Ольфактометр представляет собой прозрачный тоннель круглого или квадратного сечения длиной в среднем от 1 до 3 м, обычно изготавливаемый из оргстекла. В ольфактометр с одного конца помещается источник с синтезированным феромоном и при помощи вентилятора подается воздух. С противоположной стороны, против направления потока воздуха, запускается насекомое. Далее наблюдают за реакцией насекомого на испытываемое вещество. При правильно подобранном составе самец (или самка, если у этого вида феромон выделяет самец) начнет зигзагообразный полет в направлении источника запаха (рис. 21).

Рис. 21. Привлечение самца озимой совки на синтетический половой феромон самки в ольфактометре (по Peter Valeur, 1998).

На последнем этапе исследований проводят полевые испытания синтезированного феромона, устанавливая возможность его практического применения. Испытания синтетических феромонов для защиты растений обычно проводят в пяти-десятикратной повторности, размещая варианты (ловушки с тестируемыми феромонными композициями) рендомизированно.

Контрольные вопросы

• 1. Какие методы используют для выделения и идентификации феромонов насекомых?
• 2. Укажите основные стадии исследования феромона насекомого.
• 3. Что такое электроантеннография?
• 4. В чем состоит преимущество сочетания методов электроантеннографии и газовой хроматографии при идентификации феромонов насекомых?
• 5. Для чего используют ольфактометр?
• 6. С какой целью проводят полевые испытания синтетических феромонных препаратов?