Механизм полимеразной цепной реакции

Необходимые компоненты

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.

1. Праймеры — искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:

ѕ Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза (термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности) начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то это приведет к значительной потере чувствительности.

ѕ Не должны образовывать димеры и петли — не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом.

ѕ Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.

2. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (используется Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК):

ѕ дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ).

ѕ дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ).

ѕ дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ).

ѕ дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).

• 3. Буфер — смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
• 4. Анализируемый образец — подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.