Введение. 
Новый продуцент ингибитора альфа-глюкозидаз и его характеристика

При лечении инсулиннезависимого диабета основная задача — это нормализация углеводного обмена. Нежелательные последствия потребления углеводов возможно ослабить или избежать путем ограничения их потребления или замедления усвоения углеводов пищи при помощи ингибитора б-глюкозидаз [1−3].

За рубежом эффективное антидиабетическое средство (торговое название «Глюкобай» или «Акарбоза») создано с использованием микроорганизма-продуцента ингибитора б-глюкозидаз, выделенного из редко встречающихся актиномицетов группы актиноплан.

Для создания отечественного лекарственного препарата на основе ингибитора б-глюкозидаз нами проведен поиск микроорганизма-продуцента с использованием методов, селективных для выделения из почвенных образцов актиномицетов с подвижными спорами из группы актиноплан [4].

В результате проведенного скрининга отобран штамм 839, устойчивый к действию протеаз с уровнем ингибиторной активности, достаточной для разработки технологии отечественного антидиабетического препарата [1−3].

В настоящей работе представлены данные по характеристике морфологических, культуральных, физиологических и биохимических признаках выделенной культуры.

Методы исследования

Культуральные свойства штамма 839 изучали на агаризованных средах: Чапека с крахмалом, Чапека с глюкозой, минеральной Гаузе № 1, органической с переваром Хоттингера № 2, а также на овсяном, крахмало-аммиачном и глицерин-аспарагиновом агарах [4, 5].

Отмечали форму и консистенцию колоний, наличие воздушного и субстратного мицелия на различных средах.

Цвет воздушного субстрата мицелия колоний актиномицета на различных средах определяли по шкале цветов А. С. Бондарцева [6].

Физиологические признаки штамма 839 изучали с использованием общепринятых для актиномицетов методов и схем [5, 7].

Принадлежность выделенных актиномицетов к актинопланам оценивали на основании морфологических признаков, характерных для этой группы микроорганизмов, а именно — наличия спорангиев различной формы и подвижности зооспор. углеводный диабет актиноплан Микроскопическое изучение культур проводили на агаризованной среде Чапека с крахмалом с помощью световых микроскопов «Биолам — Р-15» и МБИ-15−2. Размеры спорангиев определяли под микроскопом с помощью окулярного микрометра [7].

Электронно-микроскопическое исследование спор проводили на электронном микроскопе Hitachi на сеточках с формваровой подложкой.

Подвижность зооспор изучали методом темнопольной микроскопии с использованием телеобъекива, конденсора ОИ-13, объектива 60, окуляра 10.

Подвижность зооспор у штамма 839 дополнительно подтверждали методом хемотаксиса [8]. 3 мл взвеси культуры помещали в чашку Петри. Затем в эту чашку под углом 450 устанавливали два капилляра (l = 50 мм, d = 1 мм) — контрольный и опытный. Контрольный капилляр содержал 0,02 мл фосфатного буфера (рН = 7,0), опытный — 0,02 мл раствора тестируемого аттрактанта в том же буфере. Через 10 минут инкубации содержимое капилляров разводили в 10 мл очищенной воды и высевали на чашки Петри со средой Чапека с крахмалом. Через 5−6 суток производили подсчет выросших колоний с опытного и контрольного капилляра. Хемотаксический ответ оценивали по коэффициенту аттрактации, который рассчитывали по формуле:

Каттракт.= ,.

где: No — количество зооспор в капилляре с аттрактантом; Nk — количество зооспор в капилляре без аттрактанта.

Принадлежность выделенных активных штаммов актиноплан к соответствующему роду определяли на основании данных состава клеточной стенки. Состав диагностических сахаров и форму изомера диаминопимелиновой кислоты (ДАПК) определяли в гидролизатах целых клеток.

Для проведения этих анализов получали биомассу культур. С этой целью колбы Эрленмейера объемом 750 мл, содержащие 100 мл жидкой органической среды № 2, засевали агаровым блоком с культурой и инкубировали на качалке (n = 220 мин-1) при 27 ± 10С в течение 10 суток. Мицелий отфильтровывали и на фильтре промывали очищенной водой и затем спиртом. Осадок сушили при 35 ± 20С в течение 1−2 суток, сухую биомассу хранили до использования в холодильнике при температуре 4 ± 10С.

Определение диагностических сахаров методом бумажной хроматографии [9,10]. 50 мг сухих клеток помещали в ампулу, добавляли 1,0 мл 0,5 М Н 2SO4, ампулу запаивали и гидролизовали 1 час в кипящей водяной бане. Кислый гидролизат нейтрализовали насыщенным раствором Ba (OH)2 и доводили рН раствора до 5,0−5,5, центрифугировали, добавляли к центрифугату 5 мл хлороформа и сушили при 35−400С. Сухой остаток растворяли в 0,4 мл 50−80% этанола [11].

На хроматографическую бумагу наносили 50 мкл раствора гидролизата и по 20 мкл смеси стандартных растворов сахаров. Нисходящую хроматографию проводили в системе растворителей: бензол-бутанол-пиридин-вода (10:50:30:30). Время разделения сахаров 16 часов.

После высушивания хроматограммы проявляли кислым анилин-фталатом, нагревали при 100−1300С в течение 2−5 минут для фиксирования пятен сахаров. Пятна гексоз на хроматограмме имели бурую окраску, пентоз — красную.

Для приготовления смеси сахаров по 10 мг каждого сахара растворяли в 5,0 мл очищенной воды. Для приготовления системы растворителей компоненты в указанном соотношении смешивали в делительной воронке и отстаивали 17−18 часов дважды. Для хроматографии использовали верхний слой. Проявитель готовили перед употреблением в соответствии с методикой.

Определение формы изомера диаминопимелиновой кислоты (ДАПК) методом бумажной хроматографии [12]. К 10 мг измельченной в ступке сухой биомассы добавляли 10 мл 6,0 М HCl и гидролизовали в запаянных ампулах в сушильном шкафу при 1000С в течение 18 часов. Гидролизат фильтровали через мелкопористый бумажный фильтр в фарфоровую чашку, фильтр с осадком промывали 3−5 каплями очищенной воды. Фильтрат упаривали на водяной бане досуха, добавляли 5 капель очищенной воды и упаривали досуха. Процедуру повторяли 3 раза до полного удаления кислоты.

Сухой гидролизат растворяли в 0,3 мл очищенной воды, 30 мкл наносили на хроматографическую бумагу и сушили горячим воздухом. Нисходящую хроматографию проводили в системе растворителей: метанол-вода-10МHCl-пиридин (80:17,5:2,5:10). Время разделения аминокислот 14 часов.

После высушивания хроматограмму проявляли 0,1%-м раствором нингидрина в ацетоне, прогревали в течение 2 минут в сушильном шкафу при температуре 1000С и фиксировали оливково-зеленые пятна ДАПК. Другие аминокислоты более подвижны и образуют пурпурные и фиолетовые пятна. В качестве контроля использовали гидролизаты клеток типовых культур рода Streptomyces (S. griseus) и рода Actynoplanes (A. philippiensis).