Ограничения метода ПЦР

• 1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;
• 2. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т.к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организации таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

ПЦР как экспресс-метод диагностики инфекционных заболеваний

В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением. Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, — начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярно — биологическими методами.

Некультивируемость микроорганизмов — главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем, как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики — иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности.

Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, лежащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены традиционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень). Ключом к расширению клинического применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упрощение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа. Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том числе из лимфоцитов периферической крови, лимфобластоидных клеточных линий, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования берут в количестве около 10 мл с антикоагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА.

Инфекционная патология в ветеринарии охватывает широкий круг болезней, различных как по характеру течения (острые, хронические, латентные), степени распространения (от спорадических случаев до эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Важное, а при некоторых болезнях решающее значение имеют серологические исследования, направленные на выявление антител, вырабатываемых организмом животного в ответ на внедрение инфекционного агента или вакцины. Несмотря на ряд достоинств, методы, основанные на этом принципе, обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существенный прорыв был сделан в последние годы, когда для диагностических целей привлекли методы генной инженерии и биотехнологии. Для диагностики инфекционных заболеваний наибольшее применение нашёл способ амплификации (умножения) нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция, NASBA-метод и др. Активное развитие и внедрение метода ПЦР в диагностическую практику позволило продемонстрировать ос-новные достоинства и эффективность этой реакции, обнаружить недостатки и выработать подходы для их преодоления.

ПЦР в лабораторной диагностике инфекций характеризуется быстротой, непревзойдённой чувствительностью и высокой специфичностью, что позволяет обнаруживать микроорганизмы, присутствующие в очень низких концентрациях (1−10 возбудителей в пробе). При этом ДНК инфекционных агентов может быть достаточно эффективно экстрагирована из любой биологической жидкости или ткани, а также из проб объектов окружающей среды (почвы, воды и т. д.) и продуктов питания. Полимеразная цепная реакция эффективна при обнаружении бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных патогенов.

Одним словом, это метод, основанный на принципе амплификации, — изолированного умножения гена или его определённого фрагмента. Амплификация — один из способов выживания микроорганизмов и клеток животных в условиях действия противоопухолевых и противобактериальных препаратов. ПЦР позволяет проводить ана-логичный процесс in vitro, то есть в пробирке.

В настоящее время разработан ряд подходов, повышающих специфичность реакций. Часто с этой целью применяется так называемая «Nested PCR» (гнездовая ПЦР). Принцип данного метода заключается в использовании двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первого раунда, с внешней парой праймеров. Применение гнездовой ПЦР имеет преимущества: высокая чувствительность методики; отсутствие необходимости использовать другие методы. К недостаткам относят перенос продуктов реакции из одной пробирки в другую, что существенно снижает концентрацию ингибиторов, а также приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов вследствие перекрёстной контаминации проб продуктами амплификации.

В последние годы для повышения чувствительности и специфичности реакции используется «горячий старт». Суть его заключается в том, что прежде чем добавлять Taq-noлимеразу, реакционная смесь прогревается предварительно до 95° С. Это исключает возможность образования неспецифических фрагментов вследствие неспецифического отжига праймеров при температуре ниже оптимальной.

Механизм простой полимеразной цепной реакции непригоден для идентификации рибонуклеиновых кислот (РНК), так как Taq-noлимераза неспособна катализировать синтез ДНК на матрице РНК. Вместе с тем хорошо известно, что геномы многих вирусов состоят из молекул рибонуклеиновых кислот (РНК), и вследствие этого актуальна идентификация РНК-вирусов. Практически это решается с помощью нескольких приёмов, в частности использования дополнительного фермента — РНК-зависимой ДНК-полимеразы — обратной транскриптазы (RT — reverse transcriptase). Реакция, катализируемая этим ферментом, приводит к образованию однонитевых фрагментов ДНК, используемых в дальнейшем в амплификации с помощьюTaq-полимеразы.

Как было отмечено выше, Taq-пoлимераза неспособна катализировать процесс обратной транскрипции, то есть синтез однонитевой ДНК на РНК-матрице. В 1991 году Маерсом и Гельфандом охарактеризован фермент ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, выделенной из другого экстремального термофила Thermusthermophilus (Tth-полиме-раза), который в присутствии ионов магния и хелаторов ионов марганца позволял ферменту катализировать обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию. Этот фермент мог быть использован для одновременного синтеза комплиментарных однонитевых фрагментов ДНК и амплификации.