Функциональные свойства эритроцитов при хронических рецидивирующих воспалительных заболеваниях

Реферат тема: Функциональные свойства эритроцитов при хронических рецидивирующих воспалительных заболеваниях

Аннотация

Объектом исследования были 23 больных с хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии.

Оценивали показатели агрегационной способности эритроцитов у больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии и здоровых лиц: V — скорость агрегации за первые 60 секунд после добавления индуктора (%/мин.); MAX — максимальная степень агрегации (%); Т — время, соответствующее максимальной степени агрегации ©.

Выявлено, что у больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии по сравнению со здоровыми лицами отмечается увеличение скорости агрегации эритроцитов, но снижение максимальной степени агрегации под воздействием 0,2% раствора альцианового голубого; достоверных различий между больными с воспалительным процессом стафилококковой этиологии и нестафилококковой этиологии по показателям агрегации эритроцитов не выявлено; обнаружено наличие достоверной обратной связи (r = -0,45, р<0,029) между скоростью агрегации и временем максимальной степени агрегации; статистически достоверной корреляции между показателем СОЭ и показателями агрегации эритроцитов у обследованных больных выявлено не было.

Перечень условных обозначений

АД — артериальное давление ГВ — геморрагический васкулит ИБС — ишемическая болезнь сердца ИМ — инфаркт миокарда ОАЭ — обратимая агрегация эритроцитов ОВГ — острый вирусный гепатит ПА — показатель агрегации ПНЭ — процент неагрегированных эритроцитов СОЭ — скорость оседания эритроцитов СРА — средний размер агрегата ЧДБ — часто длительно болеющие

Uo — минимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов

Ud — максимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов

— полупериод спонтанной агрегации эритроцитов

Ja — индекс агрегации эритроцитов

V — скорость агрегации за первые 60 секунд после добавления индуктора

T — время, соответствующее максимальной степени агрегации

MAX — максимальная степень агрегации

Способность эритроцитов к агрегации является одним из проявлений их функциональной активности. Функциональное состояние эритроцитов в значительной степени зависит от физико-химических свойств и химического состава плазмы крови. На свойства эритроцитов влияют множество факторов: белковый состав плазмы крови, рН среды, уровень экстрацеллюлярного и внутриклеточного кальция, регуляторных молекул и белков свертывающей системы крови, а также активация процессов перекисного окисления липидов и белков, воздействие мембраноповреждающих агентов (например, бактериальных токсинов) и многие другие. Воздействие данных факторов приводит к конформации белково-фосфолипидного бислоя мембраны эритроцитов, уплотнению их с резким снижением трансмембранной транспортной функции, формированием, так называемой, жесткой мембраны. Все это приводит к усиленной деформируемости, изменению формы, снижению сорбционной способности эритроцитов, и как следствие нарушению их агрегационной способности.

При различных патологических состояниях, таких как облитерирующий атеросклероз, артериальная гипертензия, ИМ, геморрагический васкулит, сифилис, ОВГ, острая пневмония отмечается изменение агрегационной способности эритроцитов [2, 3, 4, 5, 6, 7].

Интерес к данной теме обусловлен незначительным количеством в литературных источниках данных по показателям агрегации эритроцитов при хронических воспалительных заболеваниях. Внимание к агрегации эритроцитов объясняется также тем, что в настоящее время появилось много лекарственных средств, которые в силу своего механизма действия могли бы ее регулировать. Очевидно, что внедрение таких препаратов в клиническую практику также требует оценки названного процесса.

Цель работы: оценить агрегационную способность эритроцитов у больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии.

Задачи:

1. Произвести подбор оптимальной концентрации индуктора агрегации (альцианового голубого) для оценки функциональных свойств эритроцитов.

2. Оценить агрегационную активность эритроцитов у больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями по сравнению со здоровыми лицами.

3. Сравнить агрегационную активность эритроцитов у больных хроническими воспалительными заболеваниями различной этиологии.

Оценить наличие взаимосвязей между показателями агрегации эритроцитов и показателем СОЭ.

Глава 1. Общее представление об агрегации эритроцитов

1.1 Агрегация эритроцитов. Факторы, влияющие на агрегационную способность эритроцитов

В системе микроциркуляции эффективность кровотока и сосудистое сопротивление в значительной мере зависят от агрегации эритроцитов. Данный процесс реализуется в основном в венулярном отделе микрососудистого русла и создает до 60% сопротивления в этом сосудистом сегменте [16,17]. При многих патологических состояниях негативно изменяется весь комплекс реологических характеристик крови, что ухудшает ее транспортный потенциал. Одним из компонентов этих нарушений является агрегация эритроцитов. При таком патологическом состоянии как воспаление наблюдают повышенную агрегацию эритроцитов.

Процесс объединения эритроцитов в «монетные столбики» и более крупные агрегаты происходит в условиях кровотока, при которых сдвиговые силы ниже критического уровня. Это свойство эритроцитов является одним из главных детерминант вязкости крови. Некоторые авторы отмечают положительные эффект агрегации. Так, например, P.Gaehtgens. (1987) указывает на то, что агрегация эритроцитов в некоторой степени полезна для микрососудистой перфузии, так как облегчает прохождение агрегатов по микрососудистому руслу, минимизируя затраты энергии. Повышенная агрегация эритроцитов приводит к окклюзии прекапилляров и капилляров эритроцитарными агрегатами, медленному прохождению эритроцитов в узких участках русла, общему замедлению скорости периферического кровотока. Агрегация эритроцитов является непосредственной причиной капиллярного стаза. В результате длительного склеивания эритроцитов в них уменьшается содержание кислорода, затрудняется выведение двуокиси углерода, что оказывает выраженное отрицательное влияние на тканевой метаболизм. К тому же агрегация эритроцитов сопровождается их повреждением с последующим выделением в кровь эритроцитарных факторов свертывания, что способствует возникновению гиперкоагуляции.

Среди факторов, способствующих агрегации эритроцитов, можно выделить три основные группы:

· плазматические

· эритроцитные

· гемодинамические.

Роль плазматических факторов заключается в нарушении равновесия между низкомолекулярными и высокомолекулярными белками плазмы. Именно преобладание последних ведет к появлению агрегации. Особенно четко данный фактор прослеживается при воспалительных заболеваниях: острое воспаление сопровождается увеличением в плазме крови уровня би вглобулинов, а хроническое воспаление — г-глобулинов и снижением низкомолекулярного белка альбумина [17,22]. Наиболее вероятным механизмом возникновения этого вида агрегации эритроцитов является, по-видимому, образование вокруг эритроцитов патологической пленки, лишающей его отрицательного электрического заряда и способствующей склеиванию эритроцитов друг с другом. Заряд поверхности эритроцитов определяется высоким содержанием N-ацетил нейраминовой кислоты в составе гликофорина — главного гликопротеина плазматических мембран эритроцитов. Наиболее известной на сегодняшний день является теория мостикового механизма, согласно которой на поверхности эритроцита адсорбируются мостики из фибриногена или других крупномолекулярных белков, в частности гамма-глобулинов, которые при уменьшении сдвиговых сил способствуют агрегации эритроцитов. Чистая сила агрегации является разностью между силой в мостиках, силой электростатического отталкивания отрицательно заряженных эритроцитов и сдвиговой силой, вызывающей дезагрегацию. Механизм фиксации на эритроцитах отрицательно заряженных макромолекул: фибриногена, гамма-глобулинов — пока не вполне понятен. Имеется точка зрения, что сцепление молекул происходит за счет слабых водородных связей и дисперсных сил Ван-дер-Ваальса. Существует объяснение агрегации эритроцитов посредством истощения — отсутствия высокомолекулярных белков вблизи эритроцитов, в результате чего появляется «давление взаимодействия», сходное по природе с осмотическим давлением макромолекулярного раствора, что приводит к сближению суспендированных частиц [16, 23].

Гемодинамические факторы могут быть причиной агрегации эритроцитов при замедлении тока крови в капиллярах различной этиологии. Экспериментально оно может быть вызвано возбуждением симпатических нервных волокон или местным применением сосудосуживающих веществ[22].

Первичные изменения самих эритроцитов также могут быть причиной их агрегации. Это наблюдается при некоторых заболеваниях и введении в кровь определенных веществ, ведущих к изменениям формы эритроцитов (серповидные эритроциты при дрепаноцитозе, зазубренные эритроциты после внутрисосудистого введения больших доз рентгеноконтрастных веществ).

По данным литературы и многочисленным исследованиям отмечается влияние уровня кислотности плазмы в физиологических пределах, катехоламинов, простагландинов и белков свертывающей системы крови на процесс агрегатообразования, стимулирующая роль ионизированного кальция (как экстрацеллюлярного, так и внутриклеточного) в процессе объединения красных клеток крови в агрегаты. Выявлен дозозависимый характер изменения степени агрегации при повышении уровня свободного кальция плазмы. Доказаны механизмы адренергических воздействий на эритроциты: показано, что при высоких концентрациях катехоламинов их влияние на процесс агрегатообразования эритроцитов опосредуется активацией преимущественно б-адренергических рецепторов.

1.1.1 Влияние уровня рН среды на агрегацию эритроцитов

Метаболизм эритроцитов направлен на обеспечение их основной функции — транспорта кислорода, причем выполнение этой функции в значительной степени зависит от уровня кислотности крови. При ацидификации плазмы отмечается снижение степени агрегации эритроцитов, а при добавлении щелочного раствора — повышение агрегации эритроцитов.

Среди возможных причин изменения степени агрегации при сдвигах рН можно рассматривать следующие: известно, что при изменении рН в мембранах эритроцитов происходят различные изменения в структуре (нарушения связи между белковыми и липидными компонентами, между компонентами и ионами кальция и т. д.). Роль ионов кальция в межклеточных взаимодействиях хорошо известна, в бескальциевой среде нарушаются любые клеточные контакты. При снижении рН плазмы усиливается конкуренция между ионами водорода и кальция за места адсорбции, что приводит к уменьшению количества мембраносвязанного кальция и, как следствие, к уменьшению агрегации. При алкалозе концентрация ионов водорода снижается, что обеспечивает увеличение количества мест связывания кальция с мембраной эритроцитов и рост степени агрегации.

Одним из факторов, ингибирующих процесс агрегатообразования при снижении рН в кислую область, является изменение формы эритроцитов (эхиноцитоз). Сдвиг рН в щелочную сторону вызывает уплощение формы эритроцитов (т.е. увеличение соотношения площадь поверхности — объем).

При повышении рН происходит ингибирование кальциевого насоса, который в эритроцитах является единственным механизмом удаления кальция из клетки. Следовательно, при повышении рН увеличивается возможность связывания экстрацеллюлярного кальция с мембраной эритроцита и вероятность повышения его внутриклеточного уровня. Таким образом, изменение рН среды может влиять на проявление регуляторных механизмов, обусловленных сигнальной ролью ионизированного кальция [13,17].

1.1.2 Влияние уровня свободного экстрацеллюлярного кальция на агрегацию эритроцитов

Около половины общего кальция плазмы находится в ионизированном состоянии, а, следовательно, физиологически активно. Даже умеренное повышение содержания свободного кальция в плазме (на 20,6%) приводит к интенсификации агрегатообразования эритроцитов. Повышение содержания ионизированного кальция в плазме крови вызывает увеличение доли мембраносвязанного кальция, который способен связываться с мембранными анионами (главным образом с карбоксильными группами белков и кислыми фосфолипидами). Мембраносвязанный кальций способен значительно изменять не только поверхностный клеточный заряд, но и свойства и структуру клеточной мембраны. Связывание ионизированного кальция во внеклеточной среде может снизить его поступление в клетку. По литературным данным блокирование кальциевых каналов мембраны эритроцитов верапамилом сопровождается выраженным снижением агрегации эритроцитов. Показатель агрегации снижается на 51% по сравнению с контролем.

Таким образом, можно предположить, что концентрация ионизированного кальция в плазме оказывает влияние на процесс агрегатообразования эритроцитов. Изменения агрегабельности при этом связаны с модификацией мембранных свойств красных клеток крови.

1.1.3 Роль внутриклеточного ионизированного кальция в процессе агрегации эритроцитов

В эритроцитах универсальной, единственной системой, регулирующей удаление кальция из клетки, является Са-насос, функционирование которого обеспечивается специальным ферментом — Мg-зависимой, Са-стимулируемой АТФазой [11,12].

Контролируемое изменение внутриклеточного пула кальция можно достичь двумя способами: увеличением потока входящего в клетку кальция — с этой целью используются стимуляторы этого процесса (Са ионофор А23 187, тромбин и фторид натрия); и ингибированием удаления кальция из клетки (инкубацией с ванадатом натрия, трифторперазином и стауроспорин агликоном).

Инкубация эритроцитов со стимуляторами входа кальция приводит к росту их агрегируемости. Присутствие различных ингибиторов Са-АТФазы также способствует повышению степени агрегации. Общим свойством всех реагентов является их способность повышать внутриклеточный пул кальция (независимо от механизма действия).

Увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ приводит к открытию высокоселективных К-каналов в эритроцитах (Гардош-эффекту). При физиологических концентрациях внутриклеточного Са (~ 20−50 нМ) Гардош-каналы инактивированы, но они активируются при повышении содержания Са в патологических или экспериментальных условиях. В интактных эритроцитах человека уровень Са, при котором активируются эти каналы, составляет ~ 150 нМ. Количество Гардош-каналов в эритроцитах точно не установлено, по приблизительным оценкам оно составляет порядка 100−200 [16,17].

1.1.4 Влияние регуляторных молекул на агрегацию эритроцитов

Форменные элементы крови первыми соприкасаются не только с компонентами плазмы, но и с теми биологически активными соединениями, которые транспортируются к месту своего воздействия и, по всей видимости, могут влиять на функциональные свойства самих клеток крови.

Результаты воздействия некоторых гормонов, нейромедиаторов и простагландинов на процесс агрегатообразования эритроцитов представлены в таблице 1.1

Таблица1.1 — Агрегатные свойства эритроцитов, обработанных растворами биологически активных веществ

Из данной таблицы видно, что все биологически активные вещества (за исключением инсулина) вызывают выраженную стимуляцию агрегатообразования [17,19].

Согласно литературным данным при воспалении повышается тонус симпатоадреналовой системы, в том числе происходит увеличение концентрации адреналина и норадреналина. Это изменение уровня катехоламинов в периферической крови может стимулировать эндокринный путь доставки сигнальных молекул, эффекторной частью которого, является агрегация эритроцитов. Механизмы изменения агрегации эритроцитов могут быть связаны с влиянием катехоламинов на обмен внутриклеточного кальция, а также с активацией взаимосвязей между разными внутриклеточными сигнальными системами. Известно, что на мембране человеческих эритроцитов имеются функционально активные — и — рецепторы. Адренорецепторы разных подтипов активируют каскад внутриклеточных биохимических реакций.

1.1.5 Влияние белков свертывающей системы крови на объединение эритроцитов в агрегаты

В механизме свертывания крови фибриноген занимает исключительное положение, так как представляет собой единственный субстрат, из которого под действием протеолитического фермента тромбина возникает волокнистая сеть фибрина — материальная основа сгустка, предупреждающая потерю крови.

Из литературных источников известно, что при инкубации эритроцитов с тромбином происходит рост их агрегабельности на 43,9%, средний размер агрегата увеличился 18,2%. Тромбин одновременно является и мощным ингибитором аденилатциклазы, и эффективным агентом, повышающим уровень внутриклеточного кальция. В присутствии дибутирильного аналога цАМФ и хлорида бария, препятствующего повышению уровня внутриклеточного кальция, проагрегантный эффект тромбина полностью нивелируется [15,16,17].

1.2 Агрегация эритроцитов при различных патологических состояниях

1.2.1 Агрегационные свойства эритроцитов при сосудистой патологии

Изменение сосудистого тонуса проявляется сдвигами артериального давления. В этих условиях изменение реологических свойств крови может или компенсировать, или ухудшать транспортные возможности системы кровообращения. Высокая вязкость крови при низких скоростях сдвига в значительной мере может быть обусловлена агрегацией эритроцитов. Показатель агрегации эритроцитов, в группе лиц с гипертонией, на 90% больше, чем у здоровых. Высокая агрегация эритроцитов является одним из факторов, влияющих на величину АД, поскольку она является причиной изменения вязкости цельной крови при низких величинах напряжения сдвига, которая в свою очередь положительно коррелирует с диастолическим артериальным давлением [18,20].

Также отмечается в литературных источниках значительное увеличение индуцированной агрегации эритроцитов у больных облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей. При этом наиболее высокие показатели отмечаются у больных со II и III-IV стадиями заболевания: выраженное возрастание максимума светопропускания (на 25 и 53% соответственно) и размеров агрегатов (на 25 и 62% соответственно). Исследования проводились на лазерном агрегометре LA 230 с индуктором агрегации алциановым голубым.

В ряде работ показано, что нарушение различных звеньев системы гемостаза и в частности агрегационной способности эритроцитов наблюдается и при развитии геморрагического васкулита. При изучении обратимой агрегации эритроцитов и оценке показателей, характеризующие минимальную Uо и максимальную Ud механическую прочность агрегатов эритроцитов, В; полупериод спонтанной агрегации эритроцитов, с; индекс агрегации эритроцитов Ja = Ud/, отражающий соотношение агрегационных и дезагрегационных процессов, приводятся следующие данные, отраженные в таблице 1.2

Таблица 1.2 — Реологические показатели крови у здоровых и больных геморрагическим васкулитом

Примечание.

Uo — минимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

Ud — максимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

— полупериод спонтанной агрегации эритроцитов;

Ja — индекс агрегации эритроцитов.

Из данной таблицы видно, что при геморрагическом васкулите отмечаются высокие показатели минимальной и максимальной механической прочности агрегатов эритроцитов, индекса агрегации эритроцитов, укорочение полупериода спонтанной агрегации эритроцитов в сравнении с аналогичными величинами у здоровых [5,6].

1.2.2 Агрегационные свойства эритроцитов при инфаркте миокарда

В патогенезе острых форм ИБС большое значение имеют нарушения реологических свойств крови и микроциркуляции.

В литературных источниках отмечается увеличение показателя агрегации эритроцитов при развитии острого ИМ по сравнению со здоровыми лицами. Так, если у здоровых он равен 1,18, то у больных ИМ с зубцом Q — 1,34, а у больных ИМ без зубца Q — 1,52. Процент неагрегированных эритроцитов наиболее низок при ИМ с зубцом Q (63,35%) и существенно отличается от показателя у больных без зубца Q (71,81%), а у здоровых лиц составляет 82,06%. Средний размер эритроцитарного агрегата увеличивается с глубиной поражения миокарда и составляет у здоровых лиц 4,36, у больных ИМ без зубца Q — 4,87, а с зубцом Q — 5,35. Данные показателей агрегации эритроцитов при остром ИМ приведены в таблице 1.3.

Таблица 1.3 — Показатели агрегации эритроцитов при остром ИМ.

Примечание.

1) ПА — показатель агрегации:

ПА= (СРАЧКА+КСЭ)/(КА+КСЭ),

где СРА — средний размер агрегата, КА — количество агрегатов, КСЭ — количество свободных эритроцитов;

СРА= СЭА/КА,

где СЭА — сумма всех эритроцитов в агрегате;

3) ПНЭ — процент неагрегированных эритроцитов:

ПНЭ= (КСЭЧ100)/(СРАЧКА+КСЭ) Данные приведены при исследовании агрегации эритроцитов прямым оптическим методом.

Таким образом, у больных с острым ИМ показатели хуже, чем у здоровых лиц. Выраженность этих изменений зависит от глубины поражения миокарда и проявляется более значимо при ИМ с зубцом Q.

1.2.3 Агрегационные свойства эритроцитов при воспалительных заболеваниях

Агрегация эритроцитов при сифилисе Как известно, инфекционный процесс при сифилисе охватывает все структуры организма. Генерализованность, вазотропность возбудителя, а также интоксикация, обусловленная эндотоксином бледной трепонемы и продуктами распада сифилом, проявляются разнообразием клинической картины при сифилисе.

В литературе имеются лишь единичные данные об участии системы циркулирующих эритроцитов в патологическом процессе при сифилисе. Так, к примеру, приводятся данные показателей ОАЭ (минимальная (Uo, B) и максимальная (Ud, B) прочность агрегатов эритроцитов, скорость спонтанной агрегации (, с), индекс агрегации (Ja = Ud/)) при первичном и вторичном сифилисе.

У пациентов с диагнозом первичный серопозитивный сифилис увеличивается Ud в 1,2 раза и Ja в 2 раза, а скорость спонтанной агрегации красных клеток () снижается в 1,6 раза по сравнению с соответствующими показателями у здоровых лиц.

У больных вторичным сифилисом выявляются еще более выраженные изменения показателей ОАЭ. Так, значения Uo, Ud, Ja увеличены по сравнению с нормой соответственно в 1,6; 1,3 и 2,5 раза, а, напротив, уменьшилась в 1,8 раза по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц. Данные показателей ОАЭ у больных первичным и вторичным сифилисом представлены в таблице 1.4.

Таблица 1.4 — Показатели ОАЭ у больных первичным и вторичным сифилисом

Примечание.

Uo — минимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

Ud — максимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

— полупериод спонтанной агрегации эритроцитов;

Ja — индекс агрегации эритроцитов.

Агрегация эритроцитов при гепатите В и С Одним из ведущих факторов патогенеза вирусных гепатитов являются нарушения в системе микроциркуляции, оказывающие существенное влияние на кровообращение в целом, на тканевой гомеостаз, что отражается на функциях важнейших систем организма.

При вирусных гепатитах В и С отмечается увеличение Uo, Ud в 1,5 раза, увеличение Ja более чем в 3 раза, а также снижение в 2,9 раза по сравнению с таковыми показателями у здоровых. В таблице 1.5 представлены данные показателей ОАЭ периферической крови у больных ОВГ в различные периоды заболевания.

Таблица 1.5 — Показатели ОАЭ периферической крови у больных ОВГ в различные периоды заболевания

Примечание. Периоды: I — разгар, II — угасание клинических симптомов, III — ранняя реконвалесценция, IV — поздняя реконвалесценция.

Uo — минимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

Ud — максимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

— полупериод спонтанной агрегации эритроцитов;

Ja — индекс агрегации эритроцитов.

Указанные изменения функционального состояния красных кровяных клеток закономерно приводит к развитию расстройств микроциркуляции, возникновению гипоксии ткани, осложняющих течение основного патологического процесса, усугубляя цитопатическое действие гепатотропных вирусов.

Агрегация эритроцитов при острой пневмонии Отклонения в реологических характеристиках крови в микрососудах играют важную роль и при развитии острой пневмонии.

При данном воспалительном процессе отмечается изменение показателей ОАЭ по сравнению со здоровыми лицами: увеличение максимальной механической прочности агрегатов эритроцитов (Ud, В), индекса агрегации эритроцитов (Ja) и уменьшение значений минимальной механической прочности агрегатов эритроцитов (Uo, В), полупериода спонтанной агрегации эритроцитов (, с). Данные показателей ОАЭ представлены в таблице 1.6.

Таблица 1.6 — Показатели ОАЭ у больных острой пневмонией

Примечание.

Uo — минимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

Ud — максимальная механическая прочность агрегатов эритроцитов;

— полупериод спонтанной агрегации эритроцитов;

Ja — индекс агрегации эритроцитов.

Таким образом, при воспалительных процессах различной этиологии отмечается усиление агрегационной способности эритроцитов. Однако данный показатель при воспалительных заболеваниях изучен не достаточно.

1.3 Методы определения агрегационной способности эритроцитов

1.3.1 Скорость оседания эритроцитов (СОЭ)

Одним из самых широкоизвестных и доступных методов непрямого измерения агрегационных свойств крови является оценка скорости седиментации эритроцитов. В настоящее время в клинико-диагностических лабораториях применяется ручной метод определения скорости седиментации эритроцитов в вертикальной пробирке, при котором пробирку с исследуемой пробой помещают в аппарат Панченкова, и процесс оседания эритроцитов наблюдается визуально, а измерение величины СОЭ проводится через ограниченный промежуток времени — один час. Однако в своем традиционном варианте этот тест является малоинформативным, так как не учитывает реологические характеристики крови [16,23].

1.3.2 Оценка агрегационных свойств крови при прямом микроскопическом наблюдении

Предложен ряд методов, основанных на прямом микроскопическом наблюдении, в том числе наблюдение в тонком мазке крови, часто с помощью микрофотографии. Однако данный метод позволяет охарактеризовать агрегацию эритроцитов в основном качественно, кроме того, на результаты исследования влияет целый ряд факторов (скорость растекания крови, неравномерность концентрации клеток по длине мазка и др.).

Биомикроскопия является прижизненным исследованием и позволяет оценивать агрегатное состояние эритроцитов непосредственно в кровеносном русле. Основным преимуществом этого метода является его высокая чувствительность и информативность при нарушениях микроциркуляции. Как уже было сказано выше феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов имеет определенное диагностическое и прогностическое значение, поскольку связан с изменениями соотношения белковых фракций плазмы, фибриногена, липидов, нарушениями кровотока в микрососудах, электрического потенциала эритроцитов, появлениям в крови токсических веществ, метаболитов, непосредственно вызывающих агрегацию эритроцитов. Установлено, что агрегация эритроцитов в различных участках кровотока и в органах, особенно при патологии, выражена неодинаково и может иметь как местное, так и генерализованное распространение в организме. Одним из способов реализации таких исследований является применение микрофотографии и телевизионных систем анализа изображений. Наряду с несомненными достоинствами этот метод обладает рядом недостатков, к которым относятся незначительное число исследуемых структур, большая трудоемкость подсчета количества клеток и определения размеров эритроцитарных агрегатов, а также влияние неблагоприятных условий оперативного вмешательства. Этот метод больше относится к научно-исследовательским методам и не может быть использован в амбулаторных условиях.

1.3.3 Фотометрические методы оценки агрегационных свойств крови

Фотометрический метод является наиболее распространенным методом исследования агрегационных свойств эритроцитов. С помощью этого метода возможна количественная оценка агрегатного состояния крови — размеров и плотности микроагрегатов эритроцитов. Кроме этого, фотометрический анализ отличается от других методов (биомикроскопия, микрофотография) простотой и доступностью, что объясняет его широкое применение в клинической практике.

Существуют различные формы фотометрических методов. В 1950 г. К. С. Шифриным был предложен так называемый метод малых углов для измерения микроструктуры объектов, основанный на измерении углового распределения света, рассеянного внутри конуса малого угла около направления распределения основного пучка. Применение метода малых углов в практическом здравоохранении затрудняется, в частности, из-за необходимости выполнения сложных математических вычислений для каждого случая отдельно.

Для изучения агрегационных свойств эритроцитов применяется метод «силлектометрии», сущность которого состоит в светорассеянии кровью после прекращения размешивания. Внезапная остановка вызывает дезориентацию диспергированных клеток, интенсивность прошедшего света вначале снижается, а затем в результате агрегации начинает нарастать. На основании этих данных вычисляют индекс скорости агрегации.

Интенсивность света, прошедшего через слой суспензии эритроцитов, изменяется в соответствии с их агрегатным состоянием, которое характеризуется размерами и плотностью образующихся микроагрегатов. Этот принцип используется в фотометре для количественной автоматической регистрации агрегации эритроцитов. При агрегации оптическая плотность эритроцитарной взвеси снижается, что и регистрируется на агрегометре. Этот принцип был предложен G. Born и J. O`Brien, его реализация на анализаторе агрегации тромбоцитов позволяет значительно повысить чувствительность метода, что делает его пригодным для исследования спонтанной агрегации и агрегации эритроцитов под действием низких концентраций индукторов.

В качестве последних можно использовать различные вещества, способные влиять на агрегационную способность эритроцитов: адреналин, норадреналин, АДФ, тромбин, хлористый лантан (предварительно зафиксировав исследуемые клетки в растворе глутарового альдегида), полилизин, алциановый голубой и многие другие [1,14,23].

Глава 2. Объект и методы исследования

агрегация эритроцит кровь заболевание Материалы и методы:

В исследование были включены 23 пациента в возрасте от 10 до 70 лет с хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями. Из них 16 лиц женского и 7 лиц мужского пола.

С диагнозом рецидивирующий фурункулез — 16 больных с тяжелой степенью заболевания, с частыми рецидивами до 10 раз в год, с различной локализацией хронических очагов инфекции (лице, шее, руках, груди, спине). Всем больным ранее проводилось хирургическое лечение.

С диагнозом герпетическая инфекция — 3 больных со средней степенью тяжести, частота обострений до 5 раз в год. С диагнозами хронический синусит и хронический ларингит — 3 больных; и один больной с диагнозов ЧДБ. Показатель СОЭ был в пределах нормы. Все больные на момент исследования находились в состоянии ремиссии.

Контрольную группу составили 12 здоровых доноров сопоставимого возраста со станции переливания крови.

Оценка агрегационной способности эритроцитов проводилась фотометрическим методом. В качестве стандартного агрегирующего агента использовался алциановый голубой в концентрации 0,2%. Для этого утром натощак из локтевой вены в пластиковую пробирку брали 5 мл крови, которую стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Для приготовления клеточной суспензии эритроцитов полученную пробу отстаивали в течение 30 минут (при 200 С), отбирали плазму, затем трижды отмывали в 10 мл физиологического раствора. Осаждали эритроциты при центрифугировании со скоростью 1000 об/мин в течение 10 минут.

Ход измерения:

Предварительно прибор калибровали по двум точкам. При этом светопропускание образца эритроцитарной суспензии принимали за 0%, а светопропускание индуктора в физиологическом растворе — за 100%. Для оценки агрегации в кювету прибора последовательно вносили 380 мкл суспензии отмытых эритроцитов, стандартизованной по оптической плотности, и магнитную мешалку. Скорость вращения мешалки 700 оборотов в минуту. Кювету предварительно термостатировали в течение 5 минут при 370С. На десятой секунде в кювету добавляли 80 мкл 0,2% раствора алцианового голубого. Запись показателей агрегации эритроцитов проводили в течение 10 минут, через каждые 30 секунд.

Для оценки агрегации эритроцитов использовали следующие расчетные показатели:

1. V — скорость агрегации за первые 60 секунд после добавления индуктора (%/мин.).

V = степень агрегации на первой минуте после добавления индуктора Ч 100/ максимальная степень агрегации.

2. MAX — максимальная степень агрегации (%).

3. Т — время, соответствующее максимальной степени агрегации ©.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 6.0».

Глава 3. Результаты собственных исследований

На первом этапе работы нами проведен подбор оптимальной концентрации индуктора агрегации эритроцитов (альциановый голубой). По данным литературы альциановый синий является катионным красителем фталоцианиновой группы и обладает способностью связываться с гликолипидами, гликопротеидами и кислыми мукополисахаридами мембраны эритроцитов и тем самым вызывать их агрегацию. В низкой концентрации алциановый голубой не повреждает клетки, не проникает в цитоплазму, но сорбируется в количестве, пропорциональном содержанию белков и углеводов в гликокаликсе. Данный индуктор используется для определения агрегационных свойств эритроцитов в концентрации 0,05% - 0,4%.

Мы проанализировали агрегацию эритроцитов здоровых лиц с использованием раствора альцианового синего в концентрации от 0,05% до 0,4%. При этом выявлено дозозависимое увеличение агрегации эритроцитов под действием данного индуктора. При концентрации 0,05% агрегация эритроцитов практически не наблюдалась, при 0,1% - слабовыраженная агрегация, при 0,2% - выраженная агрегация, при 0,4% - максимально выраженная агрегация эритроцитов, уже на первой минуте наблюдалось 100% светопропускание в пробе. На рисунке 3.1. представлены данные об изменении степени агрегации эритроцитов при различных концентрациях альцианового голубого.

Рисунок 3.1. — Степень агрегации эритроцитов на первой минуте, в зависимости от концентрации индуктора (альциановый голубой).

Значения показателей агрегации эритроцитов у обследованных пациентов и здоровых лиц при использовании в качестве индуктора агрегации 0,2% раствор альцианового голубого представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1 — Показатели агрегации эритроцитов у обследованных пациентов и здоровых лиц

Примечание. * - различия достоверны при сравнении с группой здоровых лиц (р < 0,05). Индуктор — 0,2% раствор алцианового голубого.

Как видно из таблицы 3.1., у больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями по сравнению со здоровыми лицами отмечается увеличение скорости агрегации эритроцитов (37,3±2,2%/мин. — у больных, 28,8±1,7%/мин. — у здоровых, р<0,0136). Изменение данного показателя может быть связано с нарушением структуры и функциональных свойств мембран эритроцитов. Основным звеном конформационных изменений эритроцитарной мембраны является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и белков с накоплением высокотоксичных первичных и вторичных продуктов обмена веществ, что влечет за собой повышение вязкости цитозоля, особенно в примембранных слоях — гликокаликсе. Кроме того, длительное влияние аномальных продуктов метаболизма, приводит к конформации белково-фосфолипидного бислоя мембраны эритроцитов, уплотнению их с резким снижением трансмембранной транспортной функции, формированием, так называемой, жесткой мембраны. С другой стороны, под действием мембраноповреждающих агентов (например, бактериальных токсинов) происходит образование дополнительных каналов проницаемости — кластеров, что влечет за собой увеличение диффузии пластических и энергетических субстратов, а также электролитов в клетку. Такие изменения приводят к нарушению деформируемости, формы и сорбционной способности эритроцитов, и как следствие нарушению их агрегационной способности. Таким образом, данный показатель можно считать одним из факторов нарушения реологических свойств крови, и, в частности, при хроническом воспалении.

Интересно отметить, что показатель максимальной степени агрегации (MAX) имел более высокие значения в контрольной группе, чем в общей группе больных: 79,8±2,7% и 70,0±1,9% соответственно (р<0,006). По данным Акулёнка А. В. и Козловского В. И. максимальная степень агрегации эритроцитов у здоровых лиц при использовании в качестве индуктора альциановый синий в концентрации 0,05% составляет в среднем 36,4±1,45%. Возможно расхождение наших данных с результатами этих авторов связано с использованием нами более высокой концентрации индуктора. Эти же авторы отмечают, что у лиц с артериальной гипертензией наблюдалось увеличение агрегационной способности эритроцитов МАХ — 49,6±0,87%. В наших исследованиях показано, что при воспалительных процессах различной этиологии максимальная степень агрегации эритроцитов ниже, чем у здоровых лиц. В литературных источниках авторами приводятся лишь изменения показателей обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) при воспалительных заболеваниях. Их изучение осуществлялось вибрационным фотометрическим способом. Они отмечают увеличение максимальной механической прочности агрегатов эритроцитов (Ud, В), индекса агрегации эритроцитов (Ja) и уменьшение значений минимальной механической прочности агрегатов эритроцитов (Uo, В), полупериода спонтанной агрегации эритроцитов (, с), что в целом согласуется с нашими данными.

Показатель времени максимальной степени агрегации (Т) в группе больных и контроле не отличался: 8,2±0,2 мин. и 8,3±0,3 мин. соответственно.

С целью сравнения показателей агрегации эритроцитов у больных воспалительными заболеваниями различной этиологии были выделены и проанализированы следующие группы больных лиц: первая — больные с хроническим рецидивирующим фурункулезом, вторая — больные с другими воспалительными заболеваниями (герпетическая инфекция, хронический синусит, хронический ларингит и ЧДБ).

У больных с фурункулезом обнаружены достоверные различия показателей агрегации эритроцитов по сравнению с соответствующими значениями у здоровых: скорость агрегации (V) — 38,8±2,8%/мин. и 28,8±1,7%/мин. (р<0,009); максимальная степень агрегации (МАХ) — 70,4±2,4% и 79,8±2,7% (р<0,015) соответственно.

При сравнении двух отдельных групп (первая — больные с рецидивирующим фурункулезом, вторая — больные с герпетической инфекцией, хроническим синуситом, хроническим ларингитом и ЧДБ) статистически достоверных различий в показателях агрегации эритроцитов выявлено не было. Таким образом, роли этиологического фактора в нарушении агрегационных свойств эритроцитов установлено не было.

Нами проведен анализ взаимосвязи между показателями агрегации эритроцитов. При этом установлена статистически достоверная обратная связь между скоростью агрегации эритроцитов и временем максимальной степени агрегации эритроцитов (r = -0,45, р<0,029).

Как известно одним из косвенных способов оценки агрегации эритроцитов является определение СОЭ. Однако нами не выявлено статистически достоверной корреляции между показателем СОЭ и показателями агрегации эритроцитов у обследованных больных (показатель СОЭ находился в пределах нормы). Это доказывает, что СОЭ является достаточно малоинформативным методом для оценки агрегационных свойств эритроцитов, так как скорость седиментации эритроцитов находится в тесной зависимости от белкового состава плазмы крови и может указывать на наличие воспалительного процесса, но при этом не отражает функционального состояния мембраны эритроцитов.

1. У больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии по сравнению со здоровыми лицами отмечается достоверное увеличение (р<0,0136) скорости агрегации эритроцитов, но снижение максимальной степени агрегации (р<0,006) под воздействием 0,2% раствора альцианового голубого.

2. Достоверных различий между больными с воспалительным процессом стафилококковой этиологии и нестафилококковой этиологии по показателям агрегации эритроцитов не выявлено.

3. Обнаружено наличие достоверной обратной связи (r = -0,45, р<0,029) между скоростью агрегации и временем максимальной степени агрегации.

Статистически достоверной корреляции между показателем СОЭ и показателями агрегации эритроцитов у обследованных больных выявлено не было.

Заключение

В ходе проведенной работы было изучено изменение агрегационной способности эритроцитов, как одного из показателей функциональных свойств красных клеток крови, у больных с хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии.

При проведении исследований была определена оптимальная концентрация индуктора агрегации (альцианового голубого) — 0,2% для оценки функциональных свойств эритроцитов. Нами установлено, что у больных хроническими рецидивирующими воспалительными заболеваниями различной этиологии по сравнению со здоровыми лицами отмечается увеличение скорости агрегации эритроцитов, но снижение максимальной степени агрегации под воздействием 0,2% раствора альцианового голубого; достоверных различий между больными с воспалительным процессом стафилококковой этиологии и нестафилококковой этиологии по показателям агрегации эритроцитов не выявлено; обнаружено наличие достоверной обратной связи (r = -0,45, р<0,029) между скоростью агрегации и временем максимальной степени агрегации; статистически достоверной корреляции между показателем СОЭ и показателями агрегации эритроцитов у обследованных больных выявлено не было.

Таким образом, нарушение структурно-функциональных свойств эритроцитов и особенно их агрегационной способности является одним из патогенетических механизмов развития заболеваний и их осложнений, и в частности при хроническом воспалении. Данный процесс требует более детального изучения при конкретном заболевании, необходимо также определить наиболее эффективную методику для его оценки и внедрить в практическую лабораторную диагностику, как показатель нарушения функциональных свойств эритроцитов и реологических свойств крови.

Список использованных источников

1. Изучение агрегации эритроцитов на лазерном агрегометре / А. А. Спасов [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. — № 5. — С. 21 — 23.

2. Особенности агрегационных свойств эритроцитов при сифилисе на фоне монои комбинированной терапии (с использованием имунофана) / Е. В. Савина [ и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2004. — № 2. — С. 27 — 32.

3. Особенности морфологической структуры эритроцитов и их агрегационной способности у больных острым гепатитом В и В+С на фоне опийной наркомании / К. И. Чуйкова [ и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2004. — № 2. — С. 32 — 36.

4. Цитоархитектоника и показатели агрегации эритроцитов у больных острым инфарктом миокарда / М. В. Березин [и др.] // Кардиология. — 2006. — № 3. — С. 25 — 29.

5. Нагаева, Т. А. Нарушения периферического звена эритрона и микрогемоциркуляции при геморрагическом васкулите / Т. А. Нагаева // Бюллетень сибирской медицины. — 2005. — № 4. — С. 43 — 49.

6. Фазлыев, М. М. Исследование структурно-метаболических свойств эритроцитов у больных системными васкулитами / М. М. Фазлыев, А. Ж. Гильманов // Клиническая лабораторная диагностика. — 2005. — № 5. — С. 34−37.

7. Новицкий, В. В. Показатели обратимой агрегации эритроцитов периферической крови у больных с острой пневмонией / В. В. Новицкий [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. — 2001. — № 6. — С. 36 — 37.

8. Минеев, В. Н. Феномен влияния видимого света и адреналина на агрегацию эритроцитов у больных бронхиальной астмой / В. Н. Минеев, И. И. Нестерович // Аллергология. — 2006. — № 3. — С. 13 — 15.