Споры как фактор защиты и размножения у микроорганизмов. 
Термоустойчивость вегетативных клеток и спор бактерий и грибов

Вопрос № 1. Споры как фактор защиты и размножения у микроорганизмов. Значение спорообразования бактерий и грибов для практики

Споры — своеобразная форма покоящихся фирмикутных бактерий, т. е. бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий, сопровождающихся высушиванием, дефицитом питательных веществ и т. д. При этом внутри одной бактерии образуется одна спора. Поэтому образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразующие аэробные бактерии, у которых размер споры не превышает диаметра клетки, называются бациллами, а спорообразующие анаэробные бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки и они поэтому принимают форму веретена, называются клостридиями (от лат. clostridium. веретено).

Процесс спорообразования проходит ряд стадий, в течение которых часть цитоплазмы и хромосома отделяются, окружаясь цитоплазматической мембраной; образуется проспора, затем формируется многослойная плохо проницаемая оболочка. Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. После формирования всех структур спора приобретает термоустойчивость, которую связывают с наличием дипиколината кальция. Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга Емцев В. Т. Микробиология: Учебник для вузов / Емцев В. Т Мишустин Е. Н. — 5-е изд.; перераб. и доп. — М. Дрофа, 2005. — с 38.

Форма спор может быть овальной, шаровидной; расположение в клетке терминальное, на конце палочки (возбудитель столбняка), субтерминальное, ближе к концу палочки (возбудители ботулизма, газовой гангрены) и центральное (сибиреязвенная бацилла).

Специфические элементы споры, включая многослойную оболочку и дипиколинат кальция, обусловливают ее свойства: она долго может сохраняться в почве, например возбудители сибирской язвы и столбняка, десятки лет. В благоприятных условиях они прорастают, проходя три стадии: активацию, инициацию, вырастания. При этом из одной споры образуется одна бактерия. Активация — готовность к прорастанию. Она ускоряется при прогревании при температуре 60−80 ⁰С. Инициация прорастания длится несколько минут. Вырастание характеризуется быстрым ростом, сопровождающимся разрушением оболочки споры и выходом проростка.

Вегетативные клетки прокариот для перенесения неблагоприятных условий образуют специфические клетки (эндоспоры), обладающие повышенной устойчивостью. В основе морфологического дифференцирования лежат биохимические процессы, запрограммированные соответствующей генетической информацией. Образование эндоспор происходит только у прокариот.

Эндоспора формируется внутри материнской клетки (спорангия), обладает специфическими структурами: многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней мембранами, кортексом (рис. 1)

Рис. 1. Схема образования споры: а и б — образование септы; в и г — окружение протопласта споры протопластом материнской клетки; д — образование кортекса и оболочек споры; е — схема строения зрелой споры; 1 — экзоспориум; 2 — наружная оболочка споры; 3 — внутренняя оболочка споры; 4 — кортекс; 5 — клеточная стенка зародыша; 6 — цитоплазматическая мембрана; 7 — цитоплазма с ядерным веществом.

Эндоспоры устойчивым к повышенным температурам, дозам радиации, которые летальны для вегетативных клеток. К спорообразующим бактериям относится большое число прокариот из 15 родов. Все они имеют клеточную стенку, характерную для грампложительных прокариот. В каждой бактериальной клетке образуется, как правило, одна эндоспора.

Эндоспоры прокариот характеризуются очень низким уровнем метаболизма, они очень устойчивы к воздействию факторов внешней среды: высоким и низким температурам, обезвоживанию, литическим факторам, высокой кислотности среды, радиации, механическим воздействиям и т. п. Механизмы устойчивости эндоспор пока мало изучены. Считается, что эндоспорам прокариот придают устойчивость обезвоженное состояние цитоплазмы, термостойкость споровых ферментов, наличие дипиколиновой кислоты и большое количество двухвалентных катионов. Устойчивости эндоспор способствуют также поверхностные структуры: мембраны, кортекс, покровы, механически защищающие содержимое эндоспоры от проникновения извне агрессивных веществ Гусев М. В. Микробиология: Учебник для вузов. — 4-е изд., — М.: Академия, 2003. — с. 33.

Сформировавшиеся покоящиеся эндоспоры могут находиться в жизнеспособном состоянии в течении разного времени: от нескольких суток до 1000 лет и более.

При микроскопическом исследовании эндоспоры хорошо видны. В сомнительных случаях можно использовать специальное окрашивание, для чего фиксированный препарат надо прокипятить с карболовым раствором фуксина. Эндоспоры прочно связывают краситель и не обесцвечиваются даже при обработке этанолом или уксусной кислотой; все остальное содержимое клетки при этом обесцвечивается.

Основное функциональное отличие спор у бактерий и грибов: у бактерий споры обеспечивают переживание в неблагоприятных условиях окружающей среды, у грибов образование спор — способ размножения.

Вопрос № 2. Термоустойчивость вегетативных клеток и спор бактерий и грибов. Строение и особенности химического состава бактериальной споры. Микробиологическое обоснование пастеризации и стерилизации

Споровые покровы в основном состоят из белков и в небольшом количестве из липидов и гликолипидов. Белки покровов обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям и обеспечивают спорам защиту от действия литических ферментов, других повреждающих факторов, а также предохраняют спору от преждевременного прорастания. Оказалось, что споры мутантов, лишенные покровов, прорастают сразу же после выхода из материнской клетки, даже если условия для последующего роста неблагоприятны. Кортекс построен в основном из молекул особого типа пептидогликана.

Основное функциональное отличие спор у бактерий и грибов: у бактерий споры обеспечивают переживание в неблагоприятных условиях окружающей среды, у грибов образование спор — способ размножения Микробиология: Учебник дл вузов / О. Д. Сидоренко, Е. Г. Борисенко, А. А. Ванькова, Л. И. Войнова. — М.: Инфа_М, 2005. — с 55.

Рис. 2 — Схема строения зрелой бактериальной эндоспоры

Споры бывают круглыми, овальными или эллиптическими; некоторые снабжены «рёбрами жёсткости», усиливающими устойчивость к механическим воздействиям. При микроскопическом исследовании споры выделяются высоким коэффициентом светопреломления, аналогичный таковому у обезвоженного белка.

В зрелой споре различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма), двухслойная ЦПМ и оболочка споры.

Спороплазма (протопласт споры) включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового синтеза и некоторые другие (например, анаэробного энергообразования) Асонов Н. Р. Микробиология: Учебник -4-е изд., перераб. и доп.- М.: КолосC, 2002. — с 65.

Оболочка споры двухслойная: пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму. Внутренний слой (стенка споры) образован пептидогликанами, аналогичными таковым вегетирующей клетки. Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью.

Экзоспориум. У некоторых бактерий материнская клетка образует экзоспориум — двух-трёхслойное желатинообразное покрытие образованное липопротеинами и углеводами и во многом аналогичное капсуле бактерий. При созревании споры экзоспориум может сохраняться в виде пустого и отстающего от споры «мешка».

У бактерий спора, покрытая особо прочной оболочкой, — средство для переживания не6лагоприятных условий. Грибы образуют споры для размножения.

Грибы размножаются половым и бесполым (вегетативным) способом. При вегетативном размножении образуются специализированные репродуктивные структуры — споры — конидии. Они могут располагаться в специализированных вместилищах — спорангиях (эндоспоры) или отшнуровываться от плодоносящих гиф (экзоспоры). Реже наблюдают образование спор внутри клеток (оидии), являющихся сегментами гиф. Дрожжевые клетки размножаются почкованием, мицелий не образуют. Половое размножение включает взаимодействие специализированных клеток, имеющих существенные различия в морфологии у различных грибов и часто используемых как дифференциально-диагностический признак.

Для большинства видов грибов, имеющих медицинское значение, характерно наличие конидий (или экзоспор), являющихся формами неполового размножения. Их классификация во многом основывается на морфологических формах конидий. Их наиболее частые формыбластопоры, хламидоспоры, артроспоры, конидиоспоры.

Бластоспоры — простые структуры, которые образуются в результате почкования, с последующим отделением почки от родительской клетки, например у дрожжевых грибов.

Хламидоспоры образуются в результате увеличения гифальных клеток с образованием толстой оболочки, защищающей споры от неблагоприятных условий окружающей среды.

Артроспоры — споры, образующиеся путем фрагментации гиф на отдельные клетки. Они встречаются у дрожжеподобных грибов, возбудителя кокцидиоидоза, тканевых форм дерматофитов в волосе, кожных чешуйках и в ногтях.

Конидиоспоры — зрелые наружные споры, возникающие на дифференцированных конидиофорах (конидионосцах), отличающихся от других нитей мицелия по форме и размерам (у аспергилл, пеницилл) или располагающиеся по бокам и на концах любой ветви мицелия, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой.

К эндоспорам совершенных грибов относятся спорангиоспоры мукоровых грибов, развивающихся в специальных органах (спорангиях), располагающихся на вершине спорангиеносца. Споры освобождаются при разрыве стенки спорангия.

Эндоспоры обнаруживают также у тканевых форм возбудителей кокцидиоидоза. Они развиваются в круглых образованиях — сферулах, при разрыве стенки зрелой сферулы попадают во внешнюю среду.

Спорообразование — способ сохранения определенных видов бактерий в неблагоприятных условиях среды. Эндоспоры образуются в цитоплазме, представляют собой клетки с низкой метаболической активностью и высокой устойчивостью (резистентностью) к высушиванию, действию химических факторов, высокой температуры и других неблагоприятных факторов окружающей среды. При световой микроскопии часто используют метод выявления спор по Ожешко. Высокая резистентность связана с большим содержанием кальциевой соли дипиколиновой кислоты в оболочке спор. Расположение и размеры спор у различных микроорганизмов отличается, что имеет дифференциально-диагностическое (таксономическое) значение. Основные фазы «жизненного цикла» спор — споруляция (включает подготовительную стадию, стадию предспоры, образования оболочки, созревания и покоя) и прорастание, заканчивающееся образованием вегетативной формы. Процесс спорообразования генетически обусловлен.

Микроорганизмы проявляют разную чувствительность к средствам, применяемым для их уничтожения. Существуют видовые различия в чувствительности, а также различия, зависящие от влажности и рН среды, от возраста вегетативных клеток или спор и т. д. Эффективность различных агентов, применяемых для уничтожения микроорганизмов, характеризуют величиной D10 (время, необходимое для того, чтобы в определенной популяции при определенных условиях среды вызвать гибель 90% клеток).

Полная или частичная стерилизация осуществляется с помощью:

1) влажного жара,

2) сухого жара,

3) фильтрации,

4) облучения

5) различных химических средств.

1. Влажный жар Вегетативные клетки большинства бактерий и грибов гибнут через 5−10 мин уже при температуре около 60 °C, споры дрожжей и мицелиальных грибов лишь при температурах выше 80 °C, а споры бактерий — выше 120 °C (15 мин). Время воздействия влажным жаром, необходимое для уничтожения спор некоторых видов бактерий, отличающихся чрезвычайной термоустойчивостью. При этом следует учитывать, что окончательный результат стерилизации зависит также от степени загрязнения обрабатываемого материала, т. е., например, от числа терморезистентных спор: чем их больше, тем длительнее должен быть нагрев. Для достижения температур выше точки кипения воды пользуются автоклавом. Температура насыщенного пара зависит от давления.

При доступе воздуха определенному давлению соответствует значительно более низкая температура. Продолжительность стерилизации, естественно, зависит от объема (теплоемкости) сосудов, в которых ее проводят.

Тиндализация — нередко удается достичь того же эффекта дробной стерилизацией в текучем паре при 100 °C. Жидкость стерилизуется в этом случае при 100 °C три дня подряд по 30 мин ежедневно; в промежутках между нагреваниями ее хранят в термостате, для того чтобы споры проросли, а затем вегетативные клетки были уничтожены при следующем нагревании.

Для многих целей довольствуются частичной стерилизацией, т. е. уничтожением вегетативных форм микроорганизмов. Такого эффекта обычно достигают путем пастеризации — выдерживания в течение 5−10 мин при 75 или 80 °C.

Пастеризацией частично стерилизуют, в частности, молоко; однако, чтобы не испортить его вкуса, время воздействия в этом случае сокращают. Применяют два метода пастеризации молока: кратковременное нагревание (20 с при 71,5−74°С) и сильное нагревание (2−5 с при 85−87°С). Стерилизации молока добиваются в результате сверхсильного нагревания: При этом в молоко вводят перегретый водяной пар, доводя температуру смеси до 135−150°С. Молоко подвергается действию этой температуры в течение 1 -2 с. Затем, пропуская молоко через форсунку, понижают давление и одновременно охлаждают молоко; при этом из него удаляется вода, введенная в виде пара.

Способы консервирования ягод и косточковых плодов тоже следует рассматривать как частичную стерилизацию. При обычном нагревании консервных банок в течение 20 мин при 80 °C гибнут только вегетативные клетки и споры многих грибов, в то время как споры бактерий остаются жизнеспособными. Прорастанию бактериальных спор препятствуют низкие значения рН, обусловленные присутствием кислот во фруктовом соке. На пастеризованной клубнике часто появляется так называемый «клубничный гриб» Byssochlamys nivea. Его аскоспоры выдерживают 86 °C; при этой температуре составляет 14 мин.

2. Сухой жар. При стерилизации сухим жаром бактериальные споры переносят более высокие температуры и притом дольше, чем при стерилизации влажным жаром. Поэтому жаростойкую стеклянную посуду, порошки, масла и т. п. стерилизуют в течение 2 ч при 160 °C в сухом стерилизаторе. В тех случаях, когда это позволяет стерилизуемый материал, в настоящее время применяют 30-минутный нагрев при 180 °C. Как показывает опыт, при этом погибают все споры. Стерилизация жаром основана на коагуляции клеточных белков.

3. Фильтрация. Растворы, содержащие термолабильные вещества, удобнее всего стерилизовать фильтрованием. В лабораториях и для стерилизации питьевой воды используют фильтры Беркефельда (из прессованного кизельгура). Часто употребляют также асбестовые пластинки (в фильтрах Зейца), стеклянные фильтры и мембранные фильтры. Некоторые из них выпускаются с различной величиной пор, что позволяет даже разделять организмы разной величины и формы.

4. Облучение. Для полной или частичной стерилизации применяют ультрафиолетовые, рентгеновские и гамма-лучи. В лабораторных условиях наибольшее значение имеют ультрафиолетовые лучи. В спектре УФ-ламп преобладает излучение в области 260 нм, поглощаемое главным образом нуклеиновыми кислотами и при достаточно длительном воздействии вызывающее гибель всех бактерий. УФ-облучение используется для частичной стерилизации помещений; при этом бактерии погибают очень быстро, а споры грибов, гораздо менее чувствительные к ультрафиолету, значительно медленнее. Ионизирующее излучение применяют для стерилизации пищевых продуктов и других компактных материалов.

5. Химические средства. При стерилизации пищевых продуктов, лекарственных препаратов и разного рода приборов, а также в лабораторной практике оправдало себя применение окиси этилена, которая убивает и вегетативные клетки, и споры, но действует только в том случае, если подвергаемые стерилизации материалы содержат некоторое количество (5−15%) воды. Окись этилена применяют в виде газовой смеси (с N₂ или СО₂), в которой ее доля составляет от 2 до 50%.

Для сохранения термолабильных веществ, содержащихся в питательных средах, в практику была введена стерилизация пропиолактоном. Он значительно активнее окиси этилена, но обладает, видимо, довольно сильным канцерогенным действием и вызывает ряд других побочных физиологических эффектов. Его добавляют в количестве 0,2% в готовые питательные среды, которые затем инкубируют 2 ч при 37 °C. Если оставить среду на ночь, пропиолактон полностью разложится.

Углеводы при этом не затрагиваются. Напитки стерилизуют также дизтилпирокарбонатом (0,003−0,02%) Асонов Н. Р. Микробиология: Учебник -4-е изд., перераб. и доп.- М.: КолосC, 2002. — с 44.

Для стерилизации семян, используемых при выращивании стерильных растений, пригодны такие обычные антимикробные средства, как бромная вода (1%), сулема (HgCl₂; 1%-ный раствор в спирте), AgNO₃ (0,05%), гипохлорит кальция [1% Са (С1О)₂], успулун и др., которыми воздействуют в течение 5−30 мин. Перед этим семена следует обработать мылом или другим поверхностно-активным веществом, чтобы обеспечить полное смачивание поверхности Гусев М. В. Микробиология: Учебник для вузов. — 4-е изд., — М.: Академия, 2003. — с 29.

спора бактерия гриб микробиологический

1. Асонов Н. Р. Микробиология: Учебник -4-е изд., перераб. и доп.- М.: КолосC, 2002. — 352с.

2. Емцев В. Т. Микробиология: Учебник для вузов / Емцев В. Т Мишустин Е. Н. — 5-е изд.; перераб. и доп. — М.Дрофа. 2005. — 448 с.

3. Микробиология: Учебник дл вузов / О. Д. Сидоренко, Е. Г. Борисенко, А. А. Ванькова, Л. И. Войнова. — М.: Инфа_М, 2005. — 287 с.

4. Гусев М. В. Микробиология: Учебник для вузов. — 4-е изд., — М.: Академия, 2003. — 464 с.

5. Современная микробиология: Прокариоты: В 2-х т.: Пер. с англ. Т.1 / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древиса, Г. Шлегеля. — М.: Мир, 2005. — 656 с.