Скрининг новых антибиотикорезистентных штаммов лактобацилл

Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcus aureus, выделенной от больного, готовят двукратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне (Бульон Мюллера-Хинтона). Контролями культуры и антибиотика являются, соответственно, бульон без антибиотика и бульон с первым разведением антибиотика. В опытные и контрольные пробирки вносят стандартизованную суспензию молодой агаровой культуры S. aureus и после суточной инкубации учитывают результат.

Учетным признаком является наличие или отсутствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках[4]. В контроле культуры должна быть мутность, в контроле антибиотика — нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации тетрациклина, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен). Серийные разведения в плотных средах (Агар Мюллера-Хинтона, М173) чаще используют для одновременного тестирования большого количества микробных штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхности агара. Метод серийных разведений нередко считают наиболее точным, хотя и относительно трудоемким, дорогим.

В действительности, при правильной постановке и соответствующих контролях диффузионные методы в ряде случаев не уступают ему по точности. Вместе с тем методом серийных разведений можно тестировать чувствительность более широкого круга микроорганизмов (включая анаэробные, медленно-растущие и прихотливые).Диско-диффузионный метод При определении чувствительности методом диффузии в агар чистую культуру возбудителя засевают «газоном» на питательный агар в чашке, например, тампоном, смоченном в стандартизованной (108 КОЕ/мл) суспензии микроорганизма. Затем на поверхность агара укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают 6−7 дисков. После инкубирования в термостате измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику (рис. 4).

Рис. 4. Определение антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом

Существует линейная связь между логарифмом МИК, измеренной при использовании метода серийных разведений, и диаметром зоны задержки роста при использовании диско-диффузионного метода (рис. 5). Рис. 5. Графическое изображение взаимосвязи между Iog2 МИК и диаметром зоны задержки роста, полученным с помощью диско-диффузионного метода при использовании дисков, содержащих аналогичную концентрацию антибиотика

Поскольку для получения результатов методом диффузии в агаре используют стандартизованные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробов, температура и сроки инкубирования, стандартные диски и др.), каждому значению диаметра зоны вокруг диска с антибиотиком соответствует определенное значение МИК. Исходя из значения МИК, можно определить терапевтический индекс: Т=МИК/К (см. выше). Следовательно, по диаметру зоны можно определить степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительные (S), умеренно-устойчивые (I) и устойчивые ®. К категории S (от англ. sensitive, чувствительный) относят те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для трехкратного превышения МИК.

В категорию I (от англ. intermediate, промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические дозы. Категорию R (от англ.

resistant, устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным in vivo (см. выше). Таким образом, определение антибиотико-чувствительности методом серийных разведений и дискодиффузионным методом основаны на одном принципе — сравнении величины МИК для данного микроба со средней концентрацией антибиотика в сыворотке крови. Различие в том, что в первом случае МИК определяют непосредственно в опыте, а во втором случае определяют величину зоны задержки роста, как эквивалент МИК, поэтому цепочка расчетов несколько длиннее: диаметр-МИК-Т-категория чувствительности. Диско-диффузионный метод более прост, дешев и гибок в работе, хотя и имеет свои ограничения[7. 12]. Другие методы Промежуточное положение между двумя вышеописанными методами занимает метод определения чувствительности с помощью Е-тестов (E-test).

Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4, …мкг/мл). Е-тесты, подобно дискам при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде «газона».

В результате диффузии антибиотик формирует в агаре эллипсовидную зону градиента концентраций: более широкую в области высоких концентраций и более узкую — в области низких. После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста, которая, сужается в области малых концентраций и «пересекает» полоску на уровне, соответствующем величине МИК (рис. 6). Тот же принцип используется при определении чувствительности методом стрипов Хай

Комб. Рис. 6. Схема постановки Е-теста (стрелкой показано место пересечения зоны задержки роста с полоской; значение МИК антибиотика — 1,0 мкг/мл).При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам. Это позволяет упростить и ускорить проведение исследования. Наиболее часто применяют метод серийных разведений в планшетах и метод пограничных концентраций (микрометоды)[11].

Список литературы

И.М.Абдуллин Антибиотики в клинической практике, Саламат, 1997

Катцунга Б. Г Базисная и клиническая фармакология, Бином;

СПб.:Нев.Диалект, 2000

Альберт А. Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии: в двух томах / Пер. с англ. М.: Медицина, 1989

Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. с соавт. Молекулярная биология клетки: в двух томах. М.: Мир, 1994

Белоусов Ю.Б., Моисеев В. С., Лепахин В. К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. М.: Универсум Паблишинг, 1997

Гаузе Г. Ф. Молекулярные основы действия антибиотиков. /Пер. с англ. М.: «Мир», 1975

Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986

Елинов Н. П. Химическая микробиология. М.: Высшая школа, 1989.М. Д. Машковский. Лекарственные средства. М., 1993, т.1, с.313−314.Материалы научно-практической конференции «Антибактериальные препараты в практике терапевта». СПб., 16−17 мая 2000

Михайлов И. Б. Клиническая фармакология. СПб.: Фолиант, 1999

Страчунский Л.С., Козлов С. Н. Антибиотики: клиническая фармакология. Смоленск: Амипресс, 1994

Яковлев В. П. Антибактериальная химиотерапия в неинфекционной клинике: новые беталактамы, монобактамы и хинолоны. // Итоги науки и техники. Москва, 1992, 201 стр. Tavakoli N., Comanducci A., Dodd H.M. et al. IS 1294, a DNA element that transposes by RC transposition // Plasmid. —

2000. — V. 44, № 1. — P. 66−84. T

oleman M.A., Bennett P.M., Walsh T. C ommon regions e.g. orf513 and antibiotic resistance: IS91-like elements evolving complex class 1 integrons // J. A ntimicrob. C

hemother. — 2006. — V.

58. — P. 1−6. Woods J.B. Antimicrobials for biological warfare agents // Biological weapons defense. N.J., — 2005.

— P. 285−315. Y im G., Wang H.H. Davies J. A ntibiotics as signaling molecules // Phil.

T rans. R. S oc. B. — 2007.

— V. 362. — P. 1195−1200.