Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica

Диссертация: Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Одним из важнейших семейств нейрорецепторов являются лигандоуправляемые ионные каналынаиболее изученным их представителем является никотиновый ацетилхолиновый рецептор постсинаптической мембраны (см. обзоры). За прошедшие три десятилетия для изучения молекулярной структуры этого рецептора (в частности, рецепторного белка из электрического органа Torpedo) были использованы практически все… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
  • 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
    • 1. 1. Общие представления о структуре и функции никотинового ацетилхолинового рецептора
    • 1. 2. Изолированные субъединицы и пептидные фрагменты как модельные системы в исследованиях структуры никотинового ацетилхолинового рецептора
    • 1. 3. Изучение пространственной структуры нАХР и его доменов/фрагментов с помощью физико-химических методов
      • 1. 3. 1. Электронная микроскопия
      • 1. 3. 2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)
      • 1. 3. 3. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)
      • 1. 3. 4. Инфракрасная (ИК-) спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (КР)
      • 1. 3. 5. Спектроскопия кругового дихроизма (КД)
      • 1. 3. 6. Люминесцентная спектроскопия и другие оптические методы

Физико-химические исследования функциональных доменов ацетилхолинового рецептора Torpedo californica (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Исследования нейрорецепторов на молекулярном уровне с 1970;х годов являются бурно развивающейся областью физико-химической биологии, которая вызывает большой интерес как в академическом, так и в прикладном плане.

Одним из важнейших семейств нейрорецепторов являются лигандоуправляемые ионные каналынаиболее изученным их представителем является никотиновый ацетилхолиновый рецептор постсинаптической мембраны (см. обзоры [1−7]). За прошедшие три десятилетия для изучения молекулярной структуры этого рецептора (в частности, рецепторного белка из электрического органа Torpedo) были использованы практически все существующие биохимические и физико-химические методы. Однако размер (~270 кДа) и сложность (интегральный мембранный гетероолигомерный (О^Р^б) белок с различными посттрансляционными модификациями) этого белка ограничивают как приложимость к нему многих высокоразрешающих методов (таких, как РСА, спектроскопия ЯМР, избирательная химическая модификация), так и характер получаемой информации. Поэтому на сегодняшний день разумным компромиссом между интегративным и редукционистским подходами представляется более детальное биохимическое и физико-химическое изучение отдельных компонентов и доменов (таких, как изолированные субъединицы и достаточно протяжённые фрагменты) этого рецепторатакой подход можно считать довольно плодотворным в приложении и к другим мембранным белкам (см., к примеру, [8−10]).

Целью данной диссертационной работы являлись физико-химические исследования функциональных доменов никотинового ацетилхолинового рецептора, представленных семью рекомбинантными и синтетическими фрагментами рецептора Torpedo californica, с помощью методов оптической спектроскопии. В качестве необходимой предпосылки для физико-химических (спектральных) исследований нами была проведена большая работа по очистке/ренатурации и хроматографической и биохимической характеристике этих фрагментов, что позволило получить высокоочищенные препараты с достаточно высокой концентрацией. Спектральные исследования проводились в нескольких направлениях:

1) развёрнутое КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры и спектрофлюориметрическое и спектрофотометрическое изучение микроокружения остатков ароматических аминокислот рекомбинантных белков (Х1−209 и синтетического пептида 0С125−145, представляющих N-концевой внеклеточный (лиганд-связывающий) домен (Х-субъединицы;

2) КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры и спектрофотометрическое изучение микроокружения остатков ароматических аминокислот рекомбинантного белка O313−455, представляющего основной внутриклеточный домен («цитоплазматическая петля» и амфипатическая спираль МА) — этот домен играет важную роль в пост-трансляционной регуляции активности рецептора;

3) КД-спектроскопическое изучение вторичной структуры синтетических пептидов СС236−267 (М2) и (Х277−301 (МЗ) в трифторэтаноле;

4) изучение структурных основ лиганд-рецепторного взаимодействия для изолированного домена (XI-209 с помощью спектрофлюориметрии.

Рекомбинантные фрагменты продуцировались в нашей лаборатории Т. А. Алексеевым, к.х.н. А. Ф. Шевалье и О. В. Теляковой. Исследование фрагмента O313−455 проводилось совместно с лабораторией проф. F. Hucho (Свободный университет Берлина, Германия). Пептид (Х125−145 был синтезирован к.х.н. И. Л. Родионовым, пептид (Х236−267 Л. Д. Чикинымпептид (Х277−301 был любезно предоставлен проф. D.В.Cohen'ом. КД-спектроскопические и спектрофлюориметрические эксперименты были выполнены совместно с к.х.н. И. А. Куделиной .

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

выводы.

1. Разработаны методы хроматографической очистки, ренатурации и характеристики рекомбинантных белков, включающих остатки 1−209 СС-субъединицы (N-концевой внеклеточный лиганд-связывающий домен) или 313−455 (основной внутриклеточный домен) 6-субъединицы нАХР Т.californica. Полученные высокоочищенные препараты связывают СС-нейротоксины и низкомолекулярные лиганды и пригодны для физико-химических иследований.

2. Посредством спектроскопии КД даны количественные оценки содержания различных вторичных структур во внеи внутриклеточном доменах нАХР: первый из них (представленный фрагментами (XI-209) содержит 30−35% (Х-спиральной конформации и 45−60%-структуры, в то время как второй (представленный фрагментом 6313−455) — примерно 20% ОС-спирали и 25−35% f3-структуры.

3. С помощью спектроскопии КД и флюоресцентной спектроскопии исследованы структурные основы взаимодействия лигандов с нАХР. Показано, что вторичная структура изолированного N-концевого внеклеточного домена ОС-субъединицы не претерпевает существенных изменений при связывании с холинэргическими лигандами, d-тубокурарином или СС-бунгаротоксином. Показано также, что участки связывания СС-нейротоксинов и холинэргических лигандов включают остатки триптофана этого домена.

4. Посредством сопоставления спектральных данных для фрагментов CCl-209, СС236−267, (Х277−301 и 6313−455 и для интактного нАХР продемонстрирована адекватность использования рекомбинантных фрагментов (Х1−209 и 6313−455 в качестве моделей для исследования пространственной структуры нАХР.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубочайшую признательность своему руководителю д.х.н. Ю. Н. Уткину, чей высокий научный уровень и прекрасные человеческие качества сделали возможным выполнение этой работы. Всемерная поддержка и плодотворное обсуждение результатов со стороны проф. В. И. Цетлина заслуживают большой благодарности. Автор также очень признателен к.х.н. И. А. Куделиной, результаты продуктивного сотрудничества с которой стали краеугольным камнем этой диссертации.

Я также признателен за сотрудничество Т. А. Алексееву и О. В. Теляковой и благодарен к.х.н. И. Е. Кашеверову за помощь в математической обработке экспериментальных данных.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Т., Changeux J. Р. // Ann.Rev.Biochem. 1978. Vol.47. P.317−357
  2. F. // Eur.J.Biochem. 1986. Vol.158. P.211−226
  3. Т. // Frontiers in molecular biology: molecular neurobiology volume (Glover D.M., Harnes B.C., eds.). IRL Press, Oxford, 1989, pp.63−142
  4. Stroud R.M., McCarthy M.P., Shuster M. // Biochemistry. 1990. Vol.29. No.50. P.11 009−11 023
  5. Galzi J.-L., Revah F., Bessis A., Changeux J.-P. // Annu.Rev.Pharmacol. 1991. Vol.31. P.37−72
  6. A., Akabas M.H. // Neuron. 1995. Vol.15. P.1231−1244
  7. Hucho F., Tsetlin V.l., Machold 3. // Eur.3.Biochem. 1996. Vol.239. P.539−5578. de Vas A.M., Ultsch M., Kossiakoff A.A. // Science. 1992. Vol.255. P.306−312
  8. G., Lewis S.a., Murshudov G.N., Dodson G.G., Moody P.C., Turkenburg J.P., Barclay A.N., Brady R.L. // Structure. 1994. Vol.2. No.6. P.469−481
  9. Xue H., Chu R., Hang 3., Lee P., Zheng H. // Protein Sei. 1998. Vol.7. No.1. P.216−219
  10. S., Marchot P., Bougis P.E., Ronin С. // Eur.J.Biochem. 1988. Vol.174. P.543−550
  11. M., Takahashi H., Tanabe Т., Toyosato M., Furutani Y., Hirobe I., Asai M., Inayama S., Miyata Т., Numa S. // Nature. 1982. Vol.299. P.793−797
  12. M., Takahashi H., Tanabe Т., Toyosato M., Kikyotani S., Hirose Т., Asai M., Takashima H., Inayama S., Miyata Т., Numa S. // Nature. 1983. Vol.301. P.251−255
  13. M., Takahashi H., Tanabe Т., Toyosato M., Kikyotani S., Furutani Y., Hirose Т., Takashima H., Inayama S., Miyata Т., Numa S. // Nature. 1983, Vol.302. P.528−532
  14. M.O., Lunt F.G. // Trends Neurosci. 1995. Vol.18. P.121−127
  15. Л., Shelton D., Fujii Y. // Adv.Immunol. 1988. Vol.42. P.233−284
  16. Conti-Tronconi B.M., McLane K.E., Raftery M.A., Grando S.A., Protti M.P. // Crit.Rev.Mol.Biol. 1994. Vol.29. P.69−123
  17. McCormick D.D., Atassi M.Z. // Biochem.a. 1984. Vol.224. Pt 3. P.995−1000
  18. Fulachier M.-H., Mourier G., Cotton д., Servent D., Menez A. // FEBS Lett. 1994. Vol.338. No.3. P.331−338
  19. О., Пешенко И. А., Родионов И. Л., Телякова О. В., Уткин Ю. Н., Цетлин В. И. // Биоорган.химия. 1995. Т.21. № 2. С.152−155
  20. Dv/yer В.P. // Biochemistry. 1SSS. Vol.27. P.55S6−5592
  21. C.R., Yates J.R., Griffin P.R., Shabanowitz J., Martino P.A., Hunt D.F., Cafiso D.S. // Biochemistry. 1989. Vol.29. P.9184−9191
  22. Perez-Ramirez В., Iriarte A., Martinez-Carrion M. // 3. Protein Chem. 1994. Vol.13. No.l. P.67−76
  23. M., Weise С., Franke P., Hucho F. // J.Protein Chem. 1997. Vol.16. No.3. P.161−170
  24. Go M. // Adv.Biophys. 1985. Vol.19. P.19−131
  25. R.F. // Annu.Rev.Biochem. 1995. Vol.64. P.287−314
  26. J.G., Froehner S.C. // J.Biol.Chem. 1981. Vol.256. No.16. P.8294−8297
  27. Tarrab-Hazdai R., Goldfarb V. // Eur.J.Biochem. 1982. Vol.121. No.3. P.545−551
  28. Tzartos S.O., Changeux J.-P. // EMBO J. 1983. Vol.2. No.3. P.381−387
  29. Tzartos S.O., Changeux J.-P. // J.Biol.Chem. 1984. Vol.259. No.18. P.11 512−11 519
  30. P.Т., Lentz T.L., Hawrot E. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1985. Vol.82. No.24. P.8790−8794
  31. Wilson P.Т., Lentz T.L.//Biochemistry. 1988. Vol.27. No.18. P.6667−6674
  32. P.Т., Hawrot E., Lentz T.L. // Mol.Pharmacol. 1988. Vol.34. P.643−650
  33. Donnelly-Roberts D.L., Lentz T.L. // Biochemistry. 1991. Vol.30. P.7484−7491
  34. T.L. // Biochemistry. 1995. Vol.34. No.4. P.1316−1322
  35. Fujita N., Nelson N., Fox T.D., Claudio Т., Lindstrom J., Riezman H., Hess G.P. // Science. 1986. Vol.231. P.1284−1287
  36. Т., Mauron A., Roth В., Alliod C., Tzartos S.J., Ballivet M. // Science. 1987. Vol.235. P.77−80
  37. J.M. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1987. Vol.84. P.4318−4321
  38. A., Eshel Y., Mosckovitz R., Gershoni J.M. // J.Biol.Chem. 1988. Vol.263. No.20. P.9933−9937
  39. S., Danho W., Madison V., Montal M. // Proc.Natl.Acad.Sei.USA. 1988. Vol.85. No.22. P.8703−8707
  40. G.J., Tomich J.M., Montal M. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1989. Vol.162. No.l. P.352−356
  41. Oblatt Montal M., Iwamoto Т., Tomich J.M., Montal M. // FEBS Lett. 1993. Vol.320. No.3. P.261−266
  42. Т., Grove A., Montal M.O., Tomich Э.М. // Int.J.Pept.Protein Res. 1994. Vol.43. No.6. P.597−607
  43. M. // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct. 1995. Vol. 24.1. P.31−57
  44. Opella S.O., Gesell J., Valente A.P., Marassi F.M., Obiatt-Montal M., Sun W., Ferrer-Montiel A., Montal M. // Chemtracts-Biochemistry and Molecular Biology. 1997. Vol.10. P.153−174
  45. M., Fukuda K. // D.Biochem.(Tokyo). 1993. Vol.114. P.140−147
  46. Gorne-Tschelnokow U., Strecker A., Kaduk C., Naumann D., Hucho F. // EMBO J. 1994. Vol.13. No.2. P.338−341
  47. M., Krauss M., Herrmann A., Hucho F. // Biochemistry. 1997. Vol.36. No.4. P.839−847
  48. Ю.Н., Мунд M., Хухо Ф., Цетлин В. И. // Биоорган.химия. 1996. Т.22. № 5. С.387−389
  49. U., Schonfeld G., Schroder В., Schrattenholz А. // Anal.Biochem. 1996. Vol.233. No.l. P.67−70
  50. West A.P., Dr., Bjorkman P.J., Dougherty D.A., Lester H.A. // J.Biol.Chem. 1997. Vol.272. No.41. P.25 468−25 473
  51. J., Methot N., Wang H.H., Baenziger D.E., Blanton M.P. // J.Biol.Chem. 1998. Vol.273. No.2. P.771−777
  52. I., Utkin Yu., Weise С., Franke P., Hucho F., Tsetlin V. // Protein Express.Purif. 1998. Vol.12. No. 2. P.226−232
  53. M. // Ann.N.Y.Acad.Sei. 1993. Vol.681. P.168−171
  54. M.W., Stroud R.M. // J.Mol.Biol. 1979. Vol.128. No.3. P.319−334
  55. Bon F., Lebrun E., Gomel 0., van Rapenbusch R., Cartaud 3., Popot J.-L., Changeux J.-P. // J.Mol.Biol. 1984. Vol.176. No.l. P.205−238
  56. Brisson A., Unwin P.N.T. // Nature. 1985. Vol.315. No.6019. P.474−477
  57. E., Ralston S., Lindstrom J., Unwin N. // O.Cell Biol. 1987. Vol.105. No.l. P.9−18
  58. C., Unwin N. // Nature. 1988. Vol.336. No.6196. P.247−250
  59. N., Toyoshima C., Kubalek E. // J.Cell Biol. 1988. Vol.107. No.3. P.1123−1138
  60. C., Unwin N. // J.Cell Biol. 1990. Vol.111. No.6 (Pt 1). P.2623−2635
  61. N. // 0.Mol.Biol. 1993. Vol.229. No.4. P.1101−1124
  62. N. // Nature. 1995. Vol.373. P.37−43
  63. R., Unwin N. // Neuron. 1995. Vol.15. No.2. P.323−33 165
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!