Сворачивание тРНК

Актуальность проблемы. Одним из фундаментальных свойств линейных молекул биополимеров является их способность сворачиваться в трехмерные структуры, эффективные в процессах молекулярного узнавания и катализа. При этом пространственная структура, которая образуется в результате сворачивания, полностью определяется первичной структурой биополимера. Изучение принципов, по которым происходит реализация записанной в первичной структуре информации о пространственном строении биополимера необходимо для понимания процессов, протекающих в клетке, и возможное^ в дальнейшем влиять на эти процессы l желаемом направлении.

В настоящее время термин «сворачивание» (folding) в отношении РНК и белков принято относить как к описанию пространственной структуры равновесной нативной формы макромолекулы, так и к последовательности событий при ее образовании из развернутой цепи, образующейся в результате биосинтеза в клетке. Соответственно, изучение сворачивания макромолекул, в частности тРНК, идет в двух направлениях: установление трехмерной структуры и ее равновесных переходов (термодинамический подход) и выявление промежуточных неравновесных этапов сворачивания (кинетический подход). Для понимания механизма и закономерностей сворачивания важны оба аспекта, поскольку они совместно определяют результат сворачивания.

Несмотря на то, что основной интерес исследователей уже долгое время сосредоточен на сворачивании белков, как эффективных катализаторов и регуляторов клеточных процессов, а также важнейших структурных элементов клетки, сворачивание РНК в последнее время приобретает все больший интерес. Прежде всего, это связано с открытием каталитической функции РНК, которая в сочетании с широкими t возможностями отбора in vitro и амплификации представляет большое научное и практическое значение. Кроме того, учитывая ключевую роль РНК в биосинтезе белков и в других процессах, изучение сворачивания РНК тесно связано с проблемой РНК-белкового узнавания и обеспечения высокой точности перевода генетической информации в структуры белков.

В отличие от белков, абсолютным условием существования нативной структуры РНК является присутствие катионов металлов, преимущественно ионов Mg2+, и таким образом исследования сворачивание РНК тесно связаны с изучен-*?!.- связывания Mg2+ и его роли ъ формировании пространственной структуры РНК. Наиболее изученными, с точки зрения структуры и функции, адпяются транспортные РНК, исследоьарпз которых продолжается уже несколько десятилетий. В последние годы, с увеличением числа расшифрованных структур РНК и в результате исследования механизма функционирования рибозимов достигнут большой прогресс в понимании вклада ионов металлов в формирование активной конформации РНК. Все же, несмотря на все увеличивающийся обьем данных о структуре разнообразных РНК и их фрагментов, на сегодняшний день тРНК остаются наиболее изученным семейством РНК, для которых доступны как рентгеновские структуры в кристаллах, так и данные о структуре и конформации в растворе. Поэтому использование тРНК для изучения сворачивания РНК позволяет сочетать результаты более ранних работ с новыми данными. Несмотря на свой малый размер, молекулы тРНК содержат все известные сегодня типы третичных взаимодействий РНК, за исключением псевдоузла. Дополнительный интерес представляет то обстоятельство, что тРНК, в отличие от всех других известных тРНК, содержат множество разных минорных оснований, составляющих в некоторых тРНК до 1Л от всех нуклеотидов, что вносит новые элементы в их трехмерную структуру и стабильность.

Цели работы. В ходе работы ставились следующие задачи:

1. Сравнительное изучение структуры и стабильности зрелой тРНК и транскрипта ее гена, не содержащего минорных оснований, с целью выявления роли минорных оснований в формировании структуры.

2. Исследование сворачивания тРНК, индуцированного ионами М§-. Установление механизма сворачивания в терминах элементарных кинетических этапов и поиск интермедиатов сворачивания.

Научная новизна и практическая значимость. Используя ковалентао присоединенные флуоресцентные метки было впервые продемонстрировано, что при связывании тРНК последовательно претерпевает 4 конформационных перехода. Показано, что два из них не сопровождаются изменением числа пар оснований и относятся к чисто конформационным. На основе кинетических экспериментов определены временные параметры для отдельных этапов формирования нативной структуры. Выявлено присутствие альтернативной конформации тРНК, которая по-видимому имеет вторичную структуру, отличную от «клеверного листа». Эта конформация обуславливает существование параллельного пути сворачивания в нативную конформацию при добавлении Показана значительная стабилизация альтернативной конформация при связывании ионов М§-, что приводит к повышению энергии активации ее перехода в нативную форму и кинетическому затормаживанию этого процесса.

Для тРНК№е из Е. соН и транскрипта ее гена показано влияние минорных.

2+ оснований на стабильность структуры и связывание М^. Продемонстрировано, что присутствие миноров значительно повышает стабильность третичной структуры тРНК и сродство М²±связывающих центров. На основе ряда подходов были сделаны выводы о степени влияния минорных нуклеотидов на компактность и конформацию тРНК, а также на механизм Мд2±индуцированного сворачивания. Показано, что высокая концентрация мё2+ способна компенсировать отсутствие минорных нуклеотидов в молекуле транскрипта.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Изучение пространственной структуры молекул тРНК в растворе началось задолго до того, как в 1965 г. была расшифрована первая нуклеотидная последовательность тРНК Holley et al, 1965). Наряду с чисто физическими подходами (спектроскопия УФ, КД и ЯМР, калориметрия, флуоресценция минорных оснований тРНК и искуственно введенных меток., гидродинамические методы и т. д.) широко использовали также химические и биохимические методы, такие как метод химических модификаций, изучение чувствительности тРНК к гидролизу различными нуклеазами, фотои химические сшивки (Киселев и др., 1984). Позднее к этим методам дебязили эффективные средства генной инженерии, позволяющей осуществлять сайт-направленный мутагенез молекулы тРНК, что сделало возможным проводить систематические исследования связи первичной структуры макромолекулы с ее функцией и трехмерной структурой. Однако, достаточно полные данные по структуре тРНК были получены только в середине 70-х годов после расшифровки рентгенограмм кристаллов дрожжевой тРНКРЬе (Kim et al., 1973; Klug et al., 1974). Кроме последней, с достаточно высоким разрешением (3 ?) на сегодняшний день расшифровано строение дрожжевых тРНКД5р (Westhof et al., 1985) и тРНК&trade-61 (Bassavappa & Sigler, 1991). Были получены кристаллы и других индивидуальных тРНК (тРНКШе1 из Е. coli (Woo et al., 1980) и тРНК01у из дрожжей (Wright et al., 1979)), однако достигнутое разрешение в этих случаях не превысило 3,5−4,0 А, что недостаточно для анализа особенностей пространственной структуры этих тРНК. Рентгеноструктурные модели в целом подтвердили правильность представлений о вторичной и третичной структурах тРНК, вынесенных из результатов работ по исследованию тРНК в растворе. Многие данные указывают на то, что по-видимому возможные изменения конформации тРНК в кристалле по сравнению с ее конформацией в растворе незначительны, и полученные рентгеноструктурные модели адекватно описывают нативную структуру тРНК (Kim, 1978). Сравнение имеющихся рентгеноструктурных данных показало большое сходство между тРНК разной аминокислотной специфичности. Это дает возможность переносить многие из выводов, полученных для индивидуальной тРНК, на все семейство транспортных РНК.

Как уже было отмечено, исследование сворачивания макромолекул, в частности тРНК, состоит из двух подходов: изучение равновесных структурных переходов и исследование кинетики образования нативной структуры. Несмотря на то, что из всех существующих методов исследования структуры рентгеноструктурный анализ наиболее информативен, его применение ограничивается анализом структуры 1А? лромодекуяы в ограниченном и далеком от физиологического диапазоне условий. Поэтому для исследования динамики и сворачивания РНК в растворе перечисленные выше подходы сохраняют свое значение. Кроме того, при исследовании кинетики конформационных переходов структуры набор средств, находящийся в распоряжении исследователей сильно сужается, поскольку для многих методов имеется ограничение по времени измерения. Таким образом, проблема сворачивания РНК является более сложной, чем установление равновесной структуры молекулы. В следующей главе будут рассмотрены как равновесные, так и кинетические подходы к проблеме сворачивания тРНК и результаты этих исследований. Особое внимание будет уделено роли катионов металлов в формировании нативной структуры РНК.

Во второй части обзора литературы будут рассмотрены результаты изучения влияния минорных нуклеотидов конформацию и функциональную активность тРНК. Давно известно, что тРНК содержит многочисленные минорные основания, около половины которых находится в положениях, занятых в третичных взаимодействиях. Таким образом, они могут напрямую влиять на структурную стабильность и конформацию тРНК. Для структурно-функциональных исследований тРНК широко применяют метод транскрипции in vitro, недостатком которого является полное отсутствие минорных оснований в молекуле транскрипта. Учитывая, что удаление миноров может приводить к серьезным искажениям структуры и мешать узнаванию тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами и другими клеточными компонентами, исследование структурной роли модифицированных нуклеогидов вызывает значительный интерес.

выводы.

1. При низкой ионной силе и в отсутствие ионов тРНК существует в двух конформациях. Основная конформация, имеющая каноническую вторичную структуру «клеверный лист», находится в равновесии с альтернативной конформацией, вторичная структура которой не соответствует «клеверному листу».

2. Ионы индуцируют параллельное превращение обеих форм тРНК в нативную форму. Основная конформация переходит в нативную форму по быстрому пути, тогда как альтернативная — по медленному.

3. Низкая скорость превращения альтернативной формы тРНК в нативную форму обусловлена стабилизацией ее специфической структуры при связывании ионов М§-24, что приводит? значительному повышению энергии активации процесса сворачивания.

4. При увеличении концентрации дрожжевая тРНКРЬе претерпевает четыре последовательных конформационных перехода, регистрируемых по изменению флуоресценции ковалентно пришитых меток. Два перехода при миллимолярных. концентрациях М§- (2 и 20 мМ) не сопровождаются изменением числа спаренных оснований и относятся к истинно конформационным.

5. По данным нуклеазного зондирования структуры конформационный переход при 2 мМ связан с изменением конформация двуспиральных участков молекулы и усилением стэкинг-взаимодействий между основаниями тРНК, что может соответствовать переходу в наиболее компактную и жесткую конформацию, близкую к конформации тРНК in vivo. Переходы I и II при 4 и 16 |дМ Mg2+ соответствуют двум этапам формирования третичной структуры и пар оснований D-петли.

6. Для тРНКРЬе из Е. coli и транскркпта ее гена показано влияние минорных нуклеотидов на стабильность структуры и связывание Mg2+. Отсутствие миноров приводит к значительному ослаблению третичной структуры и сродства ионов Mg2+ к связывающим центрам тРНК. При этом не происходит изменения механизма формирования нативной структуры при связывании Mg2+ и характера этого связывания.

7. Высокая концентрация М²+ способна компенсировать отсутствие миноров, и при миллимолярной концентрации М§-2+ транскрипт находится в нативной конформации тРНК.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям Л. Л. Киселеву и Л. Ю. Фроловой за постоянную помощь и поддержкувсей группе Физики белка Института белка за помощь в выполнение работыпрофессору X. Гроссу и доктору Р. Кларку за финансовую поддержку и возможность работать в их лабораторияхК. Василенко за сотрудничество и дискуссииЕ. Гупало за помощь в написании статей.