Биологическая активность эндогенных фрагментов гемоглобина в культурах нормальных и трансформированных клеток

Выводы.

1. Проведено исследование воздействия 39 эндогенных фрагментов гемоглобина, выделенных из экстрактов тканей млекопитающих на пролиферацию и жизнеспособность трансформированных клеток в бессывороточной среде in vitro. Установлено, что 31 пептид обладает достоверной активностью, выражающейся в способности ингибировать или стимулировать пролиферацию клеток.

2. Показана способность двух групп пептидов, соответствующих сегментам а-глобина (1−32) и (134−141), восстанавливать пролиферацию клеток красного костного мозга, обработанных эпирубицином и ускорять пролиферацию трансформированных клеток в присутствии факторов роста сыворотки, соответственно.

3. Сравнительное исследование эффектов 11 фрагментов р-глобина, образующихся из участка 32−41, имеющих общий фрагмент, отвечающий за реализацию опиатной активности (YPW), так называемых геморфинов, показало способность пептидов данной группы подавлять пролиферацию и индуцировать цитолиз трансформированных клеток.

4. Показано, что геморфины обладают однонаправленной активностью в культуре трансформированных и нормальных клеток in vitro, причем их активность значительно выше (в 2 раза, в случае наиболее активного вещества, Л/-геморфина-5) в отношении трансформированных клеток, по сравнению с первичными культурами спленоцитов и клеток красного костного мозга мыши.

5. Установлено, что W-геморфин-б, аналогично ряду пептидных гормонов, обладает способностью индуцировать набор дискретных цитотоксических процессов при инкубации с трансформированными клетками.

6. Показано, что антипролиферативная активность в культуре трансформированных клеток W-геморфина-б связана с блокированием пролиферации в фазе S клеточного цикла.

Заключение

.

Так как гемоглобин является основным источником тканевых пептидов и образование этих пептидов хорошо изучено, в качестве модели для изучения биологической активности фрагментов функциональных белков были использованы фрагменты гемоглобина. В число исследованных пептидов вошли фрагменты гемоглобина, образующиеся в результате внутриэритроцитарного протеолиза этого белка, секретируемые во внешнюю среду эритроцитами и, а также присутствующие в тканях и, очевидно, образующиеся при действии клеточных протеиназ непосредственно в тканях. В результате проведенных исследований показано, что подавляющее большинство фрагментов гемоглобина активны в культуре трансформированных клеток. При этом, спектр их эффектов включает ингибирование или стимуляцию пролиферации, а также индукцию клеточной гибели. В результате данной работы установлено, что стадийность и механизм протеолиза гемоглобина имеет прямое отношение к образованию биологических пептидов. Первичная фрагментация гемоглобина в эритроцитах сначала приводит к образованию длинных практически не активных пептидов, а последующее отщепление 1М-и С — концевых остатков приводит к появлению веществ, обладающих способностью стимулировать пролиферацию трансформированных клеток в бессывороточной среде и способных, видимо, при определенных условиях (недостатке факторов роста) поддерживать пролиферацию клеток. Уровень их активности также регулируется за счет последовательного укорочения и, в конечном итоге, приводит к образованию неактивных пептидов. Таким образом длинные внутриэритроцитарные фрагменты гемоглобина, за исключением одного пептида, а-глобина-(1−33), незначительно стимулируют пролиферацию трансформированных клеток (< 20%), в то время как пептиды, образующиеся из а-глобина-(1−33) и а-глобина-(105−106) проявили высокий пролиферативный потенциал. Величина пролиферативного эффекта пептидов меняется при последовательном отщеплении Ми С-концевых аминокислотных остатков от группообразующего пептида. Таким образом, наличие биологической активности фрагментов гемоглобина напрямую коррелирует с первичной деградацией по сайтам а-глобина (33−34) и (105−106), а величина эффекта регулируется за счет отщепления концевых аминокислотных остатков.

Необходимо отметить, что две группы пролиферативных пептидов, изначально образующихся из концевых фрагментов а-глобина-(1−33) и а-глобина-(106−141), различаются по своим биологическим свойствам. Продукты деградации а-глобина-(1−33) эффективно стимулируют пролиферацию трансформированных клеток в высоких концентрациях и обладают определенным антипролиферативным эффектом при низких концентрациях. С другой стороны, эти пептиды обладают способностью восстанавливать пролиферацию клеток костного мозга, обработанных цитостатическим препаратом. Эти пептиды, также как и длинные С-концевые фрагменты а-глобина неактивны в присутствии сыворотки, т. е., в норме, очевидно, их эффект реализуется в условиях нарушения гомеостаза ткани (недостаток факторов роста или подавление пролиферации ксенобиотиками). В отличие от продуктов деградации а-глобина-(1−33), природа эффектов пептидов, выщепляющихся при протеолизе а-глобина-(106−141) не зависит от концентрации, и эти вещества не обладают способностью восстанавливать пролиферацию клеток костного мозга при обработке цитостатиками.

Учитывая зависимость природы эффекта от концентрации в случае пептидов образующихся из фрагмента а-глобина-(1−33), можно предположить, что значительное повышение содержания этих пептидов в эритроцитах больных онкологическими заболеваниями и лимфогранулематозом, по сравнению с образцами здоровых доноров, может приводить к потенцированию нарушений пролиферации в случае данных заболеваний. Так например, при различных видах рака легкого внутриэритроцитарное содержание а-глобина-(1−29) увеличивается в 1,5−3 раза, при болезни Ходжкина в 3−5 раз повышается содержание пептидов а-глобина-(1−31) и а-глобина-(1−32) [216]. Также известно, что внутриэритроцитарное содержание пептида а-глобина-(108−141) у больных с различными видами лимфосарком в несколько раз выше, чем у здоровых индивидуумов [262]. Таким образом, нарушение протеолиза гемоглобина может быть тесно сопряжено с канцерогенезом. С другой стороны, накопление продуктов деградации этого пептида в головном мозге при болезни Альцхеймера дает основание предполагать, что они также могут участвовать в регенерации клеточных популяций, например, в случае нейродегенеративных заболеваний. Необходимо отметить, что внутриэритроцитарные пептиды в норме не детектируются в плазме, но, как следует из приведенных выше примеров, могут высвобождаться из эритроцитов в результате гемолиза в стрессорных состояниях или при патологиях. С другой стороны, эти пептиды присутствуют в тканях, возможно, при участии клеток, обогащенных протеолитическими ферментами, например, макрофагов и лимфоцитов. Необходимо отметить, что эти клетки, активирующиеся как при онкологических, так и некоторых тканедегенеративных заболеваниях, могут вносить значимый вклад в накопление таких веществ непосредственно в пораженном органе или ткани. Таким образом, длинные внутриэритроцитарные пептиды, в отличие от подавляющего большинства секретируемых и тканевых фрагментов гемоглобина обладают способностью стимулировать пролиферацию трансформированных клеток в бессывороточной среде, очевидно, частично замещая факторы роста. Наличие корреляции между накоплением таких пептидов в организме при заболеваниях, связанных с нарушениями гомеостаза тканей (клеточная гибель и нарушение пролиферации, в случае рака и болезни Альцхеймера), позволяет предположить что характерная для этих веществ активность проявляется при изменении соотношения функциональных клеток ткани (т.е. гомеостаза). При этом, накопление пептидов, и вследствие этого, направленное изменение интегральной активности компонентов тканеспецифических пептидных пулов может быть как причиной (нарушение протеолиза функциональных белков), так и попыткой организма скомпенсировать нарушения, вызванные заболеванием.

Дальнейшее расщепление длинных пролиферативных пептидов приводит к образованию веществ, обладающих, как правило, противоположными эффектами, вызывающими цитолиз и ингибирующими пролиферацию трансформированных клеток. Изучение активности пептидов, секретируемых эритроцитами и присутствующих в экстрактах тканей показало, что все вещества, за исключением (3-глобина-(1−10), в отличие от внутриклеточных пептидов, обладают активностью, и их эффекты, в большинстве случаев, связаны со способностью ингибировать пролиферацию и индуцировать цитолиз трансформированных клеток.

Как показано на примере геморфинов, такие пептиды обладают однонаправленным (т.е. приводящим к уменьшению количества клеток) эффектом как в трансформированных, так и нормальных клеточных культурах. Значительно более выраженные в случае трансформированных клеток эффекты указывают на то, что их активность зависит от пролиферативного потенциала клеток и в нормальной ткани может быть связана с негативным контролем пролиферации. В случае коротких пептидов также прослеживается выраженная зависимость эффектов (как цитотоксических так и антипролиферативных) от механизмов их образования. Учитывая тканеспецифичность таких пептидных наборов, можно предположить, что их суммарное содержание коррелирует со способностью клеток к пролиферации (наиболее низкоев мозге, где нормальная пролиферация практически отсутствует, значительно более высокоев легких и селезенке). Продолжая данное предположение, можно резюмировать, что такие пептиды могут отвечать за предупреждение избыточной пролиферации и размножения трансформированных клеток в рамках самой ткани. Возможно, именно эти пептиды, широко представленные в тканях и секретируемые эритроцитами, играют непосредственную роль в противоопухолевой защите организма. Используя геморфины, как пример таких пептидов, показано, что фрагменты гемоглобина могут обладать высокой цитотоксичностью и антипролиферативной активностью в опухолевых клетках, не обладая при этом выраженной токсичностью для нормальных клеток.

По сравнению с антипролиферативными и цитотоксическими пептидами, набор коротких пролиферативных пептидов в тканях не велик и представлен неокиоторфином (а-глобином-(137−141)), также продуцируемым эритроцитами и близкими по структуре веществами, а-глобином-(134−141), а-глобином-(134−140) и а-глобином-(137−140). Выраженность их пролиферативного эффекта зависит от С-концевого остатка Arg и, видимо, связана с цитотоксичностью пептидов с отщепленным С-концевым остатком. Как неокиоторфин, так и а-глобин-(134−141), в отличие от длинных внутриэритроцитарных пептидов, обладают пролиферативной активностью в присутствии факторов роста. Пролиферативный эффект неокиоторфина в культуре нормальных клеток позволяет предположить, что эта группа веществ может участвовать в регенерации ткани в тех случаях, когда происходит гибель значимой части клеточной популяции. В норме такие пептиды, могут принимать участие в стимуляции пролиферации нормальных клеток, усиливая эффекты факторов роста. С другой стороны, нарушение содержания пептидов, в потенциале способных стимулировать рост опухолей может приводить к стимуляции роста злокачественных новообразований, на что указывает накопление неокиоторфина в ткани карциномы легкого.

Необходимо отметить, что в экстракте селезенки, также как и внутри эритроцитов присутствуют пептиды, природа эффекта которых зависит от концентрации. В частности, группа веществ, соответствующая сегменту а-глобина-(12−25), в отличие от их внутриэритроцитарных потенциальных «предшественников», т. е., пептидов, соответствующих сегменту а-глобина-(1−32), ингибирует пролиферацию при высоких концентрациях и эффективно стимулирует — при низких, причем, оба типа активности напрямую зависят от присутствия концевых аминокислотных остатков. Как видно на примере проанализированных веществ, для которых показана разнонаправленная активность в зависимости от концентрации, содержание пептидов, играет важную роль в поддержании суммарной активности пептидного комплекса.

Анализ биологической активности 39 эндогенных фрагментов гемоглобина свидетельствует о ключевой роли протеолиза в регуляции интегральной активности пептидных комплексов ткани. В случае гемоглобина, протеолиз внутриклеточных пептидов приводит к образованию веществ, обладающих иным спектром биологической активности. Из рассмотренных результатов следует, что специфичность протеолиза определяет наличие и характер биологической активности с одной стороны и локализацию фрагментов — с другой. Важным фактором регуляции эффективности действия пептидов во всех случаях, включая ингибирование и стимуляцию пролиферации трансформированных клеток, цитотоксичность и стимуляцию гемопоэза является отщепление концевых аминокислотных остатков «группообразующего», т. е. определяющего природу эффекта пептида. При этом, зависимость всех типов активности от наличия концевых аминокислотных остатков, позволяет утверждать, что такой вариант протеолитической деградации является общим механизмом регуляции активности компонентов тканевых комплексов пептидов. В результате, протеолиз фрагментов функциональных белков, очевидно, направлен на поддержание определенного для каждой ткани соотношения пептидов с различными активностями, что и определяет, в результате суммарную активность пептидного комплекса ткани.

В результате изучения биологической активности эндогенных фрагментов гемоглобина определен основной спектр биологических активностей компонентов пептидных комплексов тканей: ингибирование или стимуляция пролиферации трансформированных клеток, индукция цитотоксичности, восстановление пролиферации клеток костного мозга обработанных цитостатиками. Все описанные эффекты подтверждают концепцию об участии фрагментов функциональных белков в поддержании гомеостаза, или соотношения функциональных, делящихся, дифференцирующихся и элиминируемых клеток ткани. Большое количество проанализированных веществ из различных источников и различных структурных групп позволяет утверждать, что установленные закономерности в спектрах активностей внутриклеточных фрагментов гемоглобина, и пептидов, секретируемых эритроцитами и присутствующих в экстрактах тканей, а также взаимосвязь между их протеолитическим образованием и биологической активностью являются общими не только для фрагментов гемоглобина, но и для фрагментов других функциональных белков, входящих в состав пептидных комплексов тканей и отражают принципы эндогенной регуляции их активности.

Материалы и методы.

Используемые линии клеток.

В качестве клеток-мишеней использовали клетки линии К562 (эритролейкемия человека) и L929 (трансформированные фибробласты мыши), МЗ (меланома мыши), А549 (карцинома легкого человека) и MCF7 (рак молочной железы человека).

Клетки линии К562 впервые были выделены в 1970 году из плевральной жидкости больного хронической миелоидной лейкемией. Это полипотентные клетки, которые могут спонтанно дифференцироваться в предшественники эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов. Их время удвоения в среде RPMI-1640 в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки составляет от 26 до 30 часов. Культура клеток является суспензионной, туморогенной при инъекции в бестимусных мышей. К562 высокочувствительны к цитолизу под действием естественных киллеров и NT II и сравнительно резистентны к действию TNF.

Клетки линии L929 были получены в 1952 году из жировой ткани мыши линии С ЗН/An. Культура туморогенна при инъекции в мышей линии СЗН/NeN. Время удвоения L929 в среде RPMI-1640 в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки составляет ~ 23 часа. Клетки растут в монослое, сорбируясь на пластике. L-929 чувствительны к широкому спектру цитолитиков, высокочувствительны к TNF.

Клетки линии МЗ были получены из мыши. Время удвоения L929 в среде RPMI-1640 в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки составляет ~ 23 часа. Клетки растут в монослое, сорбируясь на пластике.

Клетки линии А549 впервые были получены из легочной ткани больного карциномой легкого. Эти клетки эпителиального происхождения. Время их удвоения при ведении в среде RPMI-1640 (Gibco BRL, США) в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки составляет ~ 30 часов. Клетки растут в монослое, сорбируясь на пластике. А549 -высоко чувствительны к цитолитическому и антипролиферативному действию лигандов опиатных рецепторов.

Клетки линии MCF7 впервые выделены из плеврального кровоизлияния пациента с раком молочной железы. Эти клетки сохраняют некоторые свойства эпителиальных клеток, в частности способность продуцировать эстрадиолы. Время их удвоения при ведении в среде RPMI-1640 (Gibco BRL, США) в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки и инсулина (0.1 U/ml) составляет ~ 48 часов. Клетки растут в монослое, сорбируясь на пластике. MCF7 — высоко чувствительны к цитолитическому и антипролиферативному действию лигандов опиатных рецепторов.

Клетки были получены в банке клеточных культур (Санкт-Петербург). Препаративное наращивание клеточного материала производилось в ИБХ РАН.

Культивирование клеток.

Клетки культивируются в стерильных условиях (ламинарный бокс Gelaire, class 100, Flow Laboratories, Великобритания) в стандартной среде RPMI-1640 (Gibco BRL, США) с добавлением следующих компонентов: 10% фетальной телячьей сыворотки, 600 мкг. мл L-глутамина, 5×10″ М 2-меркаптоэтанола, 0.01 М бикарбоната натрия, 12,5 мМ HEPES, 10 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco BRL, США), 1/100 от общего объема среды препарата витаминов (Flow Laboratories, Великобритания), в С02-инкубаторе (5% СО2) при 37 С (Heraeus, Германия), в стандартных пластиковых флаконах на 25 мл. (Flow Laboratories, Великобритания). Для клеток линии MCF7 в среду для культивирования добавляли Spite medium supplement (SIGMA, США).

K562 представляют собой клетки округлой формы, растущие в суспензии. При пересаживании клеток половину общего объема переносят в другой флакон и добавляют равный объем среды для культивирования. Пересаживание клеток производят через 1−2 дня (время достижения концентрации клеток~ 2×106 клет./мл.).

L929 представляют собой клетки, растущие в монослое при сорбции на пластике. Для переведения в суспензию клеток линии L929 при пересаживании их последовательно обрабатывали 0.25% раствором трипсина в течение 1 минуты и версеном (ЭДТА, 0.2г/л) в течение 5 минут, затем суспензию интенсивно перемешивали серологической пипеткой (Pipet-aid, Япония) с наконечником на 10 мл (Costar, США). Часть клеточной суспензии переносили в другой флакон и добавляли по 5−7 мл среды для культивирования. Пересаживание клеток производили через 1−2 дня (время образования монослоя).

МЗ представляют собой клетки, растущие в монослое при сорбции на пластике. Для переведения в суспензию клеток линии МЗ при пересаживании их после отбора среды обрабатывают версеном (ЭДТА, 0.2г/л) в течение 10 минут, затем суспензию интенсивно перемешивают серологической пипеткой на 10 мл (Costar, США). Часть клеточной суспензии переносили в другой флакон и добавляли по 5−7 мл среды для культивирования. Пересаживание клеток производили через 1−2 дня (время образования монослоя).

А549 представляют собой клетки, растущие в монослое при сорбции на пластике. Для переведения в суспензию клеток линии А549 при пересаживании их обрабатывали смесью 0.25% раствора трипсина и версена (ЭДТА, 0.2г/л), взятых в соотношении 1:1 в течение 10 минут, затем суспензию интенсивно перемешивали серологической пипеткой на 10 мл (Costar, США). Часть клеточной суспензии переносили в другой флакон и добавляли по 5−7 мл среды для культивирования. Пересаживание клеток производили через 1−2 дня (время образования монослоя).

MCF7 представляют собой клетки, растущие в монослое при сорбции на пластике. Для переведения в суспензию клеток линии MCF-7 при пересаживании их обрабатывали смесью 0.25% раствора трипсина и версена (ЭДТА, 0.2г/л), взятых в соотношении 1:3 в течение 10 минут, затем суспензию интенсивно перемешивали серологической пипеткой на 10 мл (Costar, США). Часть клеточной суспензии переносили в другой флакон и добавляли по 5−7 мл среды для культивирования. Пересаживание клеток производили через 2−3 дня (время образования монослоя).

Исследуемые вещества.

Общая характеристика исследуемых веществ.

Вещества пептидной природы, были получены в результате хроматографического разделения уксуснокислых экстрактов легких и сердца крыс, а также из лизата эритроцитов человека и супернатанта переживающей культуры эритроцитов и некоторые синтезированы. Выделение производилось в группе Регуляторных пептидов ИБХ РАН. Для выделения уксуснокислые экстракты легких и сердца, лизат и супернатант эритроцитов были подвергнуты эксклюзионной хроматографии на колонке длиной 85 см и диаметром 2.5 см с сефадексом G-25sf, уравновешенной в 0.1 М уксусной кислоте. Фракции, содержащие вещества с молекулярной массой менее 1 кДа, были подвергнуты разделению с помощью HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) на колонке с обращенной фазой Nukleosil 7С18. Разделение пептидных фракций на индивидуальные компоненты проводилось в градиенте ацетонитрила от 0 до 50% при скорости элюции 2 мл/мин. Полученные фракции замораживались в жидком азоте и лиофилизовались. Выделение пептидов из тканей проводилось Яцкиным Олегом Николаевичем в группе Регуляторных пептидов ИБХ РАН. Синтетические пептиды получены Андреем Юрьевичем Суровым, к.х.н., с.н.с. лаборатории химии пептидов и Зиганшиным Рустамом Хусмановичем, к.х.н., н.с. лаборатории химии пептидов ИБХРАН.

Концентрации исследуемых веществ.

Все пептиды исследовали в диапазоне концентраций: 10″ ^-10″ ^ M при последовательном разведении через порядок.

Приготовление раствора исследуемого вещества.

В качестве растворителя использовалась стандартно получаемая деионизованная вода Milli-Q.

Растворы исследуемых пептидов (фрагменты гемоглобина, Met-энкефалин и TNF (фактор некроза опухолей)).

Сухие навески пептидов растворяли в 100 мкл. в деионизованной воды Milli-Q.

Форма исследуемого препарата была приготовлена путем добавления аликвоты (10 мкл) растворенного в воде препарата к соответствующему объему (300 мкл) бессывороточной среды для культивирования клеток. Растворы, содержащие различные концентрации препаратов, приготавливались путем последовательного разведения в 10 раз бессывороточной средой.

Раствор эпирубицина и нейротоксина II (из яда кобры Naja naja oxiana).

Навеска лиофилизованных препаратов была растворена в деионизованной воде Milli-Q для получения стокового раствора с концентрацией 10″ 3 М. Перед началом каждого эксперимента определенный объем стокового раствора разбавлялся до получения требуемой концентрации используемой в опыте средой.

Определение цитолитической активности.

Определение цитолитической активности в отношении клеток линии К562.

Для определения цитолитической активности клетки помещали в лунки 96-луночного планшета (Flow Laborotories, Великобритания) в количестве 10 тыс. клеток на пробу. Клетки осаждали центрифугированием при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, CILLA) в течение 5 мин. Среду с сывороткой удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл бессывороточной среды, содержащей исследуемые вещества в требуемых концентрациях. В качестве контроля использовалась бессывороточная среда. Клетки инкубировали в течение требуемого времени при +37 С в С02-инкубаторе (Heraeus, Германия). Затем клетки центрифугировали, отбирали 60 мкл среды и добавляли 1−2 мкл 0.4% раствора трипанового синего. Содержимое лунок перемешивали автоматической пипеткой (Gilson, Франция). Через 1 мин. после добавления трипанового синего определяли цитолитическую активность в камере Горяева под микроскопом (Diavert, 12.5×10, Leitz, Германия) по включению трипанового синего в погибшие клетки. Для достоверного определения процента погибших клеток оценивали не менее 200 клеток.

Процент лизированных клеток определяли по формуле: Цитолитическая активность (%) = (А/В) х 100% А — число окрашенных клеток в образце В — общее количество клеток.

При определении абсолютного значения цитолитической активности из значения процента погибших клеток в образце вычитали процент погибших клеток в контрольном образце.

Определение цитолитической активности в культуре трансформированных клеток L929.

Для определения цитолитической активности полученную суспензию клеток переносили в 96-ти луночные планшеты (Flow Laboratories, Великобритания) в количестве 10 тыс. клеток в лунке. После инкубации в течение 2 часов в среде с 10% фетальной телячьей сывороткой среду из лунок удаляли и добавляли по 100 мкл среды, содержащей тестируемый образец, растворенный в соответствующей концентрации в среде RPMI-1640 без сыворотки. Лунки, соответствующие негативному контролю, содержали по 100 мкл среды без сыворотки. Клетки инкубировали в течение заданного времени в С02-инкубаторе при 37° С (Heraeus, Германия), после чего среду в контрольных и экспериментальных образцах удаляли, последовательно обрабатывали клетки 40 мкл 0.25% раствора трипсина и 40 мкл версена. После добавления 2 мкл раствора трипанового синего цитолитическую активность определяли как описано выше .

Определение изменения количества клеток.

Определение изменения количества клеток визуально под микроскопом.

Для определения количества клеток их суспензию помещали в лунки 96-луночного планшета (Flow Laboratories, Великобритания) в количестве 10 тыс. клеток в лунку и инкубировали в среде, содержащей 10% фетальной сыворотки в течение 24 часов для полного прикрепления клеток. Затем среду удаляли, и заменяли бессывороточной средой, содержащей исследуемые вещества. В качестве негативного контроля использовались клетки, инкубируемые в бессывороточной среде, без добавления пептидов. После инкубации в течение 24 часов клетки переводили в суспензию, как описано выше (см. 3.1, 3.2). Определяли количество живых (не окрашенных трипановым синим) клеток в 25 малых квадратах камеры Горяева.

Концентрацию клеток определяли по формуле: концентрация клеток/мл = количество клеток в 25 малых квадратах хЮ^.

Изменение количества клеток в экспериментальных образцах, относительно контрольных образцов, рассчитывали по формуле:

C-D/D)xl00%, где.

D-кощентрация клеток/мл в контрольном образце. С-концентрация клеток/мл в экспериментальном образце.

Определение количества клеток при окрашивании МТТ.

Для определения количества клеток их суспензию помещали в лунки 96-луночного планшета (Flow Laboratories, Великобритания) в количестве 10 тыс. клеток на пробу и инкубировали с исследуемым веществом требуемое количество времени, как описано выше для каждой линии клеток.

Определение количества клеток при окрашивании сульфородамином Б.

Клетки, растущие в монослое, рассаживали в лунки 12-луночного планшета в количестве 3−5 тыс./лунку и инкубировали в течение 24 часов для полного прикрепления клеток в среде содержащей 10% фетальной сыворотки. Затем к клеткам добавляли исследуемый пептид и вещество сравнения (эпирубицин) в концентрации 10″ 6 М. Смену среды и добавление свежей порции пептида проводили ежедневно. После б дней инкубации с веществами определяли количество клеток. После инкубации клеток с исследуемыми веществами, среду сливали и в каждую лунку добавляли по 1 мл метанола для фиксации клеток. Фиксировали в течение 12 часов, затем метанол сливали и планшеты просушивали. После чего клетки промывали: 1 раз дистиллированной водой и 4 раза 1% уксусной кислотой. После промывания в лунки добавлялось по 1 мл 0.4% раствора сульфородамина Б (Sigma, США) в 1% уксусной кислоте и клетки инкубировались 20 мин при комнатной температуре, а затем, после удаления красителя, снова промывались 5 раз 1% уксусной кислотой. Для растворения прореагировавшего красителя в каждую лунку добавлялось 2 мл 10 мМ триса (триоксиметиламинометан). Оптическая плотность раствора измерялась при 490 и 540 нм на спектрофотометре Multiscan (Titertek, Швейцария). Изменение количества клеток в экспериментальных образцах, относительно контрольных образцов, определяли по формуле:(рнDK /D к) х 100%, где.

Dk~ оптическая плотность в контрольном образце.

Deоптическая плотность в экспериментальном образце.

Клоногенный тест.

Клетки L929 рассаживали в лунки 96-луночного планшета (Flow Laboratories, Великобритания) в количестве 50 000 клеток в лунку и инкубировали в течение 18 часов в среде для культивирования клеток RPMI-1640 (Gibco BRL, США), содержащей 10% фетальной сыворотки. После этого клетки инкубировали с исследуемым пептидом или эпирубицином в концентрациях 10″ ° М в течение 24 часов. В качестве негативного контроля были использованы клетки, инкубировавшиеся в среде для культивирования клеток RPMI-1640 (Gibco BRL, США), содержащей 10% фетальной сыворотки. После инкубации клетки обрабатывали последовательно растворами трипсина и версена (50 мкл.) для отделения их от пластика и определили усредненное количество клеток в образцах соответствующих негативному контролю. Затем все образцы клеточной суспензии развели в 1000 раз средой для культивирования и аликвоты каждого образца поместили в лунки 12 луночного планшета (NUNC, Denmark), содержащего 3 мл среды для культивирования клеток RPMI-1640 (Gibco BRL, США), содержащей 10% фетальной сыворотки. Объемы аликвот клеточного материала (одинаковые во всех образцах) рассчитывались таким образом, чтобы в лунках, соответствующих негативному контролю присутствовало 100 клеток. Клетки инкубировали в течение 6 суток, после чего определяли количество колоний, содержащих более 8 клеток и количество клеток в колониях в образцах под микроскопом. После просчета числа колоний клеточный материал окрашивали сульфородамином Б, как описано выше.

Влияние анализируемых веществ на образование колоний рассчитывали по формуле (%):

NKO/NKK)xlOO%, где NKO — количество колоний в экспериментальном образце, NKK — количество колоний в негативном контроле.

Определение активности фрагментов гемоглобина в культурах нормальных клеток.

Выделение клеток селезенки и костного мозга мыши.

Для выделения мышиных силеноцитов, мышь забивали путем цервикальной дислокации. После дезинфицирующих процедур (протирание мыши этиловым спиртом), вскрывали брюшную полость и извлекали селезенку. Селезенку гомогенизировали в гомогенизаторе до получения однородной массы. Полученную клеточную суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали 10 минут при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США) для осаждения клеток. Затем супернатант сливали, а оставшиеся на дне центрифужной пробирки клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.

Для выделения костномозговых клеток из мыши, мышь забивали путем цервикальной дислокации. После дезинфицирующих процедур (протирание мыши этиловым спиртом), выделяли бедренные кости и вымывали их содержимое средой для культивирования клеток RPMI 1640, используя шприц на 10 мл. Полученную клеточную суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали 10 минут при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США) для осаждения клеток. Затем супернатант сливали, а оставшиеся на дне центрифужной пробирки клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток RPM3 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.

Определение активности фрагментов гемоглобина в переживающей культуре клеток костного мозга мыши.

Клетки помещали в лунки 96-луночного планшета (кроме крайних лунок) в количестве 500 тыс. кл./лунку. После центрифугирования при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США), среду отбирали автоматической пипеткой (Gilson, Франция) и к клеткам добавляли по 400 мкл 10% сывороточной среды, с растворенными в ней исследуемыми пептидами в требуемых концентрациях. В качестве негативного контроля клетки инкубировали с средой с 10% фетальной сыворотки, не содержащей препараты. В краевые лунки помещали среду для культивирования клеток, содержащую 10% FCS. Клетки инкубировали в С02-инкубаторе (Heraeus, Германия) в течение необходимого времени.

После инкубации клеток с исследуемым веществом, в каждую лунку добавляли по 20мкл МТТ (3 -(4,5 -Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 -diphenyl-2H-tetrazolium-bromid) (Merck,.

Германия), растворенного в PBS (2.5млг/мл). Планшет помещали в С02-инкубатор (Heraeus, Германия), на 2.5 часа.

После инкубации с МТТ планшеты с клетками центрифугировали при 500g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США) в течение 10 минут.

Затем супернатант слили и в каждую лунку добавили по 100 мкл 50%DMFA (диметилформамид) в 20% SDS. Планшеты инкубировали в течение часа на качалке при температуре 37 °C. Определение оптической плотности проводили при длине волны 540нм.

Изменение количества живых клеток определяли как описано выше.

Определение активности фрагментов гемоглобина в переживающей культуре клеток костного мозга мыши.

Клетки костного мозга инкубировались в среде с фетальной сывороткой в присутствии 10~7 M эпирубицина в течение 4 часов. Затем экспериментальные планшеты центрифугировали как описано выше и среду удаляли из лунок с клеточным материалом. К клеточным образцам, не обработанным эпирубицином и соответствующим негативному контролю, добавляли стандартную среду для культивирования клеток. В лунки, содержащие клетки, обработанные эпирубицином, добавляли среду для культивирования (позитивный контроль) или исследуемые вещества в концентрации 10″ 7−10″ пМ. Клетки инкубировались в течение 48 ч., после чего активность исследуемых веществ определялась с помощью окрашивания МТТ, как описано выше. Антипролиферативный эффект эпирубицина в данной тест системе составлял 35+5%. Гематопоэтическая активность пептидов определялась по формуле: гематопоэтическая активность (%)=((ОП (оптическая плотность) в экспериментальном образце)/(ОП позитивного контроля — ОП негативного контроля))х100%.

Определение активности фрагментов гемоглобина в переживающей культуре спленоцитов мыши.

Клетки помещали в лунки 96-луночного планшета (кроме крайних лунок) в количестве 500 тыс. кл./лунку. Затем к клеткам добавили 0.1% раствор фитогемаглютинина (ФГА), растворенного в среде для культивирования клеток с 10% фетальной сыворотки и инкубировали в СОг-инкубаторе (Heraeus, Германия) в течение 24 часов, для стимуляции пролиферации этих клеток.

Затем ФГА-стимулированные спленоциты мыши центрифугировали при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США), среду отбирали автоматической пипеткой (Gilson, Франция) и к клеткам добавляли по 400 мкл 10% сывороточной среды, с растворенными в ней исследуемыми пептидами в требуемых концентрациях. В качестве негативного контроля клетки инкубировали с средой с 10% фетальной сыворотки, не содержащей препараты. В краевые лунки помещали среду для культивирования клеток, содержащую 10% FCS. Клетки инкубировали в ССЬ-инкубаторе (Heraeus, Германия) в течение необходимого времени.

Определение количества клеток проводили путем окрашивания МТТ. Для этого в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора МТТ (2.5 мг/мл). После чего плашки помещали в С02-инкубатор (Heraeus, Германия) и инкубировали в течение 2.5 часов при +37^С. Затем плашки центрифугировали 10 минут при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США), супернатант сливали. Для растворения осевших на дно плашки кристаллов добавляли растворитель (50% DMFA в 20% SDS) по 100 мкл/лунку.

Оптическую плотность определяли при 540 нм, на мультискане (Titertek, Швейцария).

Определение фрагментации ДНК.

Для определения фрагментации ДНК клетки помещали в лунки 24-луночного планшета (Flow Laborotories, Великобритания) в количестве 1 млн. клеток на пробу. Для осаждения клетки инкубировали в С02-инкубаторе (Heraeus, Германия) в течение 2 часов, после чего среду с сывороткой отбирали автоматической пипеткой (Pipet-aid, Япония) с наконечником на 10 мл. (Costar, США), после чего клетки инкубировали в 400 мкл. бессывороточной среды, содержащей исследуемые вещества в требуемых концентрациях, в течение 18 часов при 37^С. В качестве контроля клетки инкубировали в аналогичных условиях в бессывороточной среде. После инкубации, из каждой лунки отбирали по 50 мкл бессывороточной среды с клетками для определения цитолитической активности, которое проводилось как описано выше (см. определение цитолитической активности 3). Оставшиеся клетки лизировали добавлением равного объема буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl рН 7.4, 0.8%) Тритон Х-100, 0.1 M ЭДТА в течение 15 мин при встряхивании. Высокомолекулярная ДНК и белки осаждались центрифугированием при 1000g (Model TJ-6 centrifuge, Becman, США) в течение 5 мин. Фрагменты ДНК, содержащиеся в супернатанте, осаждались изопропанолом (конечная концентрация 50%) в присутствии 0.5.

M NaCl (конечная концентрация 10%) в течение 3 часов при -20^С. Для удаления изопропанола и NaCl, полученную смесь центрифугировали при 13 000 g (mikro centrifuge type-320a, Mechanika precyzyjna, Польша) в течение 15 мин, осадок промывали 70% этанолом и высушивали. Для удаления, из полученного образца РНК, его обрабатывали панкреатической РНК-азой, А в ТАЕ-буфере для обработки РНК-азой (0.05М NaCl, ЮмМ Трис-ацетат, 5 мМ ЭДТА, рН 7.4) при концентрации 100 мкг/мл, в течение 40мин, при 37^С. Полученные образцы анализировались с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (0.5г агарозы растворенной в 50 мл ТАЕ-буфера (1мМ трис-ацетат, 0.04мМ ЭДТА, рН 8.3) при закипании, остывший до 60^С раствор заливали в форму для фореза). При постоянном напряжении 100 В. Электрофорез проводили в ТАЕ-буфере (1мМ трис-ацетат, 0.04мМ ЭДТА, рН 8.3) Гель окрашивали водным раствором бромистого этидия в течение 10 мин. После трехкратного промывания дистиллированной водой гель фотографировали при ультрафиолете (310 нм.).

Определение количества клеток и анализ ДНК с помощью проточного флуориметра.

Клетки L929 помещали во флаконы для культивировании клеток в количестве 300.000 клеток на флакон размером 25 см² и инкубировали в течение 18 часов в 5 мл среды RPMI-1640 содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. После инкубации производили замену среды на свежую, содержащую Ю-6 М исследуемого пептида или 10~б М эпирубицина (вещество сравнения). В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в отсутствии пептида и вещества сравнения. После инкубации клеток в течение 24 часов проводили следующую обработку клеток с целью определения их количества и анализа ДНК.

Определение количества клеток.

Среду из флаконов удаляли и клетки последовательно обрабатывали растворами трипсина и версена с целью получения однородной суспензии. Количество клеток определялось параллельно визуально в камере Горяева и проточном фоуцитометре EPICS «Elite» (Coulter Electronics Inc., USA). Полученные первичные данные обрабатывались с помощью лицензированных программ MultiCycle и MultiGraph. Изменение количества клеток по сравнению с контрольными образцами определялось по формуле, представленной выше. Воспроизводимость результатов подтверждалась в трех независимых экспериментах.

Определение содержания ДНК.

Среду из флаконов удаляли и клетки последовательно обрабатывали растворами трипсина и версена с целью получения однородной суспензии. После получения суспензии клеток, клетки переносили в пробирки на 15 мл и центрифугировали при 1500 g в течение 7 мин. Осадок, содержащий клеточный материал, два раза промывали 6 мл. PBS, затем ресуспендировали в 1 мл PBS. К полученной суспензии добавляли 2 мл охлажденного 96% этилового спирта, перемешивали и фиксировали в течение ночи при +4 С0. Перед проведением анализа клетки центрифугировали как описано выше и промывали 3 р. 2 мл PBS. После 3-х промывок клетки ресуспендировали как описано выше и к суспензии клеток добавляли 0.5 раствора, содержащего пропидиум иодид в концентрации 10 мкг/мл растворенного в смеси, содержащей 50%PBS/50% раствора РНКазы Н (1 мкг/мл). Образцы инкубировались в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего проводился анализ содержания ДНК и размеров клеток. Исследование проводилось с помощью проточного флоуцитометра EPICS «Elite» (Coulter Electronics Inc., USA). Полученные первичные данные обрабатывались с помощью лицензированных программ MultiCycle и MultiGraph. Воспроизводимость результатов подтверждалась в трех независимых экспериментах.

Статистическая обработка результатов.

Для определения достоверности и воспроизводимости результатов использовалась выборка первичных данных, полученная после проведения 5−6 независимых экспериментов. Каждый эксперимент включал не менее чем 4 негативных контроля (клетки, инкубируемые в отсутствии вещества), два позитивных контроля (вещество сравнения в концентрации, позволяющей получать достоверные и воспроизводимые результаты), 2−3 параллели экспериментальных образцов. На основании полученных результатов определялось среднее значение активности, стандартное отклонение и коэффициент вариации (CV), который рассчитывается как процентное отношение стандартного отклонения к среднему значению активности. Воспроизводимыми считались результаты с CV<30%. Достоверность результатов определялась по t-критерию непарного метода Стьюдента. Результаты с р<0.05 оценивались как достоверные. Для сравнительного анализа активности пептидов также использовался t-критерий Стьюдента, различие в активности пептидов считалось значимым при р<0.05.

1. Иванов В. Т., Белки и пептиды, Москва, 1995.

2. Pittman, I.A., Adv. Internal. Med., 1974, 19, 303.

3. Plotnikoff, N.P. et al, Life Sci., 1976, 17, 168.

4. Schally, A.V., Coy, D.H., Meyers, C.A., Hipotalamic regylatory hormones, Ann. Rev. Biochem., 1978, 47, 89.

5. Golstain, A. et al., PNAS, 1981, 78, 7219.

6. Kangawa, K. and Matsuo, H., Purification and complete amino acid sequence of a-human atrial natriuretue polipeptide, BBRC, 1984, 118, 131.

7. Carraway, R. and Leeman, S.E., The isolation of a new hipotensive peptide, neurotensin, from bovine hipotalami, JBC, 1973, 248, 6854.

8. Ivanov, V.T., Karelin, A.A., Mikhaleva, I.I., Vaskovsky, B.V., Sviryaev, V.I. and Nazimov, I.V., Isolation, structure and propoties of novel endogenous peptides, Soviet J. Bioorgan. Khim., 1992, 18, 677−702.

9. Glamsta, E.-L. et al., Isolation of a gemoglobin-derived opioid peptid from cerebrospinal fluid of patients cerebrovascular bleedings, BBRC, 1992, 184, 1060−1066.

10. Karelin, A.A. et al., Isolation of endogenous hemorphin related hemoglobin fragments from bovine brain, BBRC, 1994, 202, 410−415.

11. Албертс, Б., Брей, Д., Льюис, Дж., Роберте, К., Уотсон, Дж., Молекулярная биология клетки, «Мир», 1994, стр 394−437.

12. Baarsch, M.J., Wannemuehler, M.J., Molitor, T.W., Murtaugh, M.P., Detection of tumor necrosis factor from porcine alveolar macrophages using an L929 fibroblast bioassay, J. Immunol. Metods, 1991, 140, 15−22.

13. Young, I. D-E., Cohn, Z.A., Podack, E.R., The night component of compliment and the pore forming proyein (perforin 1) from cytoxis T-cells: Structurial, immunological and functoinal similarities, Sience, 1986,233,184−188.

14. Granger, G.A., Yamamoto, J., Differences in bioactivity of recombinant human TNF, LT and T-cell derived LT-3 on transformed cells in vitro and Meth A tumor growing in BALB/C mice, J. of Response Modifiers, 1988, 7, 488.

15. Sashchenko, L.P., Kabanova, O.D., Blishenko, E.Yu., et al, The role of apoptotic and necrotic processes in cytolysis mediated by LAK cells with different phenotypes, FEBS Lett., 1993, 335(2), 270.

16. Huschtscha, L.I., Jeither, T.M., Andersson, C.E., Bartier, W.A., Tattarsall H.N., Identification of apoptotic and necrotic human leukemic cells by flow cytometry, Exp. Cell Research, 1994, 212, 161−165.

17. Golstain, P., Ojcius, D.M., Young, J.D., Cell death mechanisms and the immune system, Immunol. Rev., 1991, 121, 29.

18. Kramer, P.H., Dhein, I., Walezak, H., Debatin, K.M., The role of APO-1 -mediated apoptosis in immune system, Immunological Reviews, 1994, 142, 176−179.

19. Ashwell, I.D., Berger, N.A., Cidlowski, I.A., Lane, D.P., Korsmeyer, S.I., Coming to terms with death: apoptosis in cancer and immune depatment, Immunology Today, 1994, 15/4, 147−151.

20. Arends, M.J., Wyllie, A.H., Apoptosis: mechanisms and role in pathology, Int. Rev. Exp. Phatol., 1991, 32, 223−254.

21. Loosdeecht, A. A., Cell cycle speccific effects of TNF-a in monocyte mediated leukemic cell death and the role of b2-integring, Cancer Res., 1993, 53, 4399−4407.

22. Shi, L., Kam, C-M., Powers, J.C., Aebersolt, R., Greenberg, A.H., Purification of three cytotoxic lymphocyte granule serine proteases that induce apoptosis through distinct substrate and target cell interactions, J. Exp. Med., 1992, 176, 1521−1529.

23. Weller, M., Constan, D.B., Malipiero, U. and Fontana, A., TGF-J32 induced apoptosis of murine T cell clones without down-regulating bcl-2 mRNA expression, Eur. J. Immunol., 1994, 24, 1293−1300.

24. Schulte-Hermann, R., Grasl-Kraupp, B., Bursh, W., Tumor development and apoptosis, Int. Arch. Allergy Immunol., 1994, 105, 363.

25. Cancer Res., 1999, 59, 2174−2181.

26. Blishchenko, E.Yu. and Karelin, A.A., Tubocurarin induces the wide spectrum of cytolytic effects in tumor cells, Immunol. Lett., 1994, 42, 13−17.

27. Laster, S.M., Wood, J.G., Gooding, L.R., Tumor necrosis factor can induce both apoptotic and necrotic forms of death, J. Immunol, 1988, 141, 2629−2634.

28. Pardee A.B. a restriction point for control of normal animal cell proliferation. PNAS, 1974, 71, 1286−1290.

29. Deuel, T.F., Polypeptide growth factors: roles in normal and abnormal growth, Annu. Rev. Cell Biol., 1987,3,443−492.

30. Goustin, A.S., Leof, E.B., Shpley, G.D., Moses, H.L., Growth factors and cancer, Cancer Res., 1986, 46/3, 1015−1029.

31. Goldring MB, Goldring SR, Cytokines and cell growth control, Crit Rev Eukaiyot Gene Expr 1991;l (4):301−26.

32. Evered D., Nugent J., Whelan J., eds., Growth factors in biology and medicine., Ciba Foundation Symposium 116., London, Pitman, 1985.

33. Holley R.W., Kierman J.A. «Contact inhibition» of cell division in 3T3 cells. PNAS, 1968, 60, 300−30 434. ] Folkman J., Moscona R. Role of cell shape in growth control. Nature, 1978, 273, 345−349.

34. М. А. Пальцев, А. А. Иванов, Межклеточные взаимодейсвия, 1995, Москва «Медицина» .

35. П. В. Сергеев, Н. Л. Шимановский, Рецепторы, 1987, Москва «Медицина» .

36. Bishop J.M., Viral Oncogenes, Cell, 1985, 42, 23−38.

37. Yu.C.L., Tsai M.H., Stacey D.W., Cellular ras activity and phospholipid metabolism, Cell, 1988, 52, 63−71.

38. Linden R, Rehen SK, Chiarini LB, Apoptosis in developing retinal tissue, Prog Retin Eye Res 1999 Mar- 18(2): 133−65.

39. Shay-Whey M. Koh, Julius Leuton, Terry.W. Moody, Bombesin activates MAP kinase in non-small cell lung cancer cells, Peptides, 1999, 20, 121−126.

40. Amati B, Littlewood TD, Evan GI, Land H, The c-Myc protein induces cell cycle progression and apoptosis through dimerization with Max, EMBO J 1993 Dec 15−12(13):5083−7.

41. Korsmeyer SJ., Cancer Res (Supp), 1999, 59, 1693s-1700s.

42. Hong M, Lai MD, Lin YS, Lai MZ, Antagonism of p53-dependent apoptosis by mitogen signals, Cancer Res 1999 Jun 15−59(12):2847−52.

43. Vaux D.L., Aguila H.L., Weissman I.L., Bcl-2 prevents death of factor deprived cells but fails to prevent apoptosis in targets of cell mediating killing, Int. Immunol., 1992, 4, 821 824.

44. Shaw P., Bovey R., Tardy S., Sahli R" Sordat B., Costa J., Induction of apoptosis by wildtype p53 in human colon tumor-derived cell line, PNAS, 1992, 89, 4495−4499.

45. Vaux DL, Weissman 1L, Neither macromolecular synthesis nor myc is required for cell death via the mechanism that can be controlled by Bcl-2, Mol Cell Biol 1993 Nov-13(ll):7000−5.

46. Novelli F., Pierro F.D., Forni G., Environmental signals influencing expression of the IFN-g receptor on human T cell control whether IFN-g promotes proliferation or apoptosios, J. of Immunology, 1994, v. 152, p.496−504.

47. Hernarder-Caselles T. and Stutman 0., Immune functions of tumor necrosis factor, J. of Immunology, 1993, v. 151/8, p. 3999−4012.

48. Holt S.I., Grimble R.F. and York D.A., Tumor necrosis factor-a and limphotoxin have opposite effect on sympathetic efferent nerves to brown adipose tissue by direct action in the central nervous sistem, Brain Res., 1989, v. 497, p. 183−186.

49. Oh Y.I., Francis I.W., Markelonis G.I., Oh T.H., Interleukin-l-p and tumor necrosis factor-a increase peripheral type benzodiazepine binding sites in cultured poligonal astrocytes, J. Neurochemistry, 1992, v. 58, p. 2131−2138.

50. Akil, H. et al., Endogenous opioids: Biology and function, Ann. Rev. Neurosci., 1984, 7, 223−255.

51. Nakanishi, S. et al., Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotrophin-P-lipotropin precursor, Nature, 1979, 278, 423−427.

52. Noda, M., Fututani, Y., Takahashy, H, Touosato, M., Hirose, T., Inayama, S., Nakanishi, S. and Numa, S., Cloning and sequence analysis of cDNA for bovine adrenal preproenkephalin, Nature, 1982, 295, 202−206.

53. Comb, M., Seeburg, P.K., Adelman, J., Eiden, L. and Herbert, E., Primary structure of the human Metand Leu-enkephalin precursor and its mRNA, Nature, 1982, 295, 663−666.

54. Kakidani, H., Fututani, Y., Takehashi, H, Noda, M., Moromoto, Y., Hirose, T., Asai, M., Inayama, S. and Numa, S., Cloning and siquence analysis of cDNA for porcine beta-endorphin, dynarphin precursor, Nature, 1982, 298, 245−249.

55. Chang, K.J. et al., Multiple opiate receptors, Trend Neurosci., 1980, 3, 160−162.

56. Chang, K.J. et al., Heterogenity and properties of opiate receptors, Fed. Pros., 1981, 40, 2729−2734.

57. Zukin, R.S. et al., Multiple opiate receptors: emerging conceppty, Life Sci., 29, 2681−2690.

58. Olson, G.A., Olson, R.D. and Kastin, A.J., Endogenous opiates, Peptades, 1993, 14, 13 391 378.

59. Zagon, I.S., Endogenous opioid systems and neural cancer: transmission and scanning electron microscopic studies of murine neuroblastoma in tissue culture, Brain Res. Bull, 1988, V. 21:5, pp. 777−84.

60. Zagon, I.S., McLaughlin, P.J., Endogenous opioid systems regulate growth of neural tumor cells in culture, Brain res., 1989, V. 490:1, pp. 14−25.

61. Lee, Y.S., Wurster, R.D., Differential effects of methionine enkephalin on the growth of brain tumor cells., J Neurooncol, 1994, 19:1, 11−5.

62. Maneckjee, R. and Minna, J.D., Opioid and nicotine receptors affect growth regulation of human lung cancer cell lines, PNAS, 1990, 87, 3294−3298.

63. Sergeeva, M.G., Grishina, Z.V., Varfolomeyev, S.D., Morphine effect on proliferation of normal and tumor cells of immune origin, Immunol. Lett., 1993, V. 36:2, pp. 215−8.

64. Ishikawa, M., Tanno, K., Kamo, A., Takayanagi, Y., Sasaki, K" Enchancement of tumor growth by morphine and its possible mechanism in mice, Biol Pharm Bull, 1993, 16:8, 7626.

65. Hatzoglou, A., Bakogeorgou, E., Castanas, E., The antiproliferative effect of opioid receptor agonists on the T74D human breast cancer cell line, is partially mediated through opioid receptors, Eur J Pharmacol, 1996, 296:2, 199−207.

66. Hatzoglou, A., Bakogeorgou, E., Castanas, E., The antiproliferative effect of opioid receptor agonists on the T74D human breast cancer cell line, is partially mediated through opioid receptors, Eur J Pharmacol, 1996, 296:2, 199−207.

67. Jiang, Y., Weinberg, J., Wilkinson, D.A., Emerman, J.T., Effects of steroid gormones and opioid peptides on the growth of androgen-responsive Shionogi carcinoma (SCI 15) cells in primary culture., Cancer Res., 1993, 53:18, 4224−9.

68. Hatzoglou, A., Bakogeorgou, E., Hatzoglou, C., Martin, P.M., Castanas, E., Antiproliferative and receptor binding properties of alphaand beta-casomorphins in the T47D human breast cancer cell line, Eur. J. Pharmacol., 1996, V. 310:2−3, pp. 217−23.

69. Zagon, I.S., Hytrek, S.D., McLaughlin, P.J., Opioid growth factor tonically inhibits human colon cancer cell proliferation in tissue culture, Am J Physiol, 1996, 271:3 Pt 2, R511−8.

70. Brent, P.J., Pang, G.T., Sigma binding site ligands inhibit cell prolipheration in mammary and colon carcinoma cell lines and melanoma cells in culture, Eur J Pharmacol, 1995, 278:2, 151−60.

71. Zagon, I.S., Goodman, S.R. and McLaughlin, P.J., Demonstration and characterisation of zeta (Q, a growth-related opioid receptor, in a neuroblastoma cell line, Brain Res., 1990, 511, 181−186.

72. Carr, D.J.J., Klimpel, G.R., Enhancement of the generation of cytotoxic T cells by endogenous opiates, J.Neuroimmunol., 1986, 12, 75−87.

73. Faith, R.E., Plotnicoff, N.P., Neuroimmunomodulation with enkephalins: enhancement of human natural killer (NK) cell activity in vitro, Clin. Immunol. Immunopath., 1984, 31, 412 418.

74. Matthews, P.M., Banchurst, A.D., J. Immunol., 1983, 130, 1658.

75. Gabrilovac, J., Antica, M., Osmak, M., In vivo bidirectional regulation of mouse natural killer (NK) cell cytotoxic activities by Leu-enkephalin: reversibility by naloxone, Life Sci., 1992, 50, 29−37.

76. Saland, L.C., Samora, A., Acute injections of opiate peptides into the rat cerebral ventricle: a macrophage-like cellular response, Brain Res.Bull., 1983, 10, 523.

77. Anastasi, A., Erspamer, V., and Bucci, M. Isolation and structure of bombesin and alytesin, two analogous active peptides from the skin of the European amphibians Bombina and Alytes. Experientia (Basel), 27: 166−167, 1971.

78. McDonald, T.J., Ghatei, M.A., Bloom, S. R Dose-response comparison of canine plasma gastroentero-pancreatic hormone responses to bombesin and the porcine gastrin-releasing peptide (GRP). Regul. Pept., 5: 125−137, 1983.

79. Rozengurt, E., Legg, A. and Pettican, P" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1284−1286, 1979.

80. Cuttitta, F., Carney, D.N., Mulshine, J., Moody, T.W., Fedorko, J., Fischler, A. and Minna, J.D. Bombesin-like peptides can function as autocrine growth factors in human small-cell lung cancer. Nature, v 316: 823−826, 1985.

81. Carney, D.N., Cuttitta, F., Moody, T.W., and Minna, J.D. Selective stimulation on small cell lung cancer clonal growth by bombesin and gastrin-releasing peptide. Cancer Res. 47: 821 825, 1987.

82. Mahmoud, S., Staley, J., Taylor, J. et al., Psil3,14]bombesin analogues inhibit growth of small cell lung cancer in vitro and in vivo, Cancer Res., 1991, 51:7, 1798−802.

83. Moody, T.W., Staley, J., Zia, F., Coy, D.H., Jensen, R.T., Neuromedin B binds with high affinity, elevates cytosolic calcium and stimulates the growth of small-cell lung cancer cell lines, J Pharmacol Exp Ther, 1992, 263:1, 311 -7.

84. Nelson, J., Donnelly, M., Walker, B., Gray, J., Shaw, C., and Murphy, R.F., Bombesin stimulates proliferation of human breast cancer cells in culture. Br.J.Cancer 63: 933 936,1991.

85. Yano, T., Pinski, Jj., Groot, K., Schally, A.V., Stimulation by bombesin and inhibition by bombesin/gastrin-releasing peptide antagonist RC-3095 of human breast cancer cell lines, Cancer Res., 1992, 52:16, 4545−7.

86. Narayan, S., Guo, Y.S., Townsend, C.M., and Singh, P. Specific binding and growth effects of bombesin-related peptides on mouse colon cancer cells in vitro. Cancer Res., 50: 67 726 778, 1990.

87. Wang, Q.J., Knezetic, J.A., Schally, A.V., Pour, P.M., Adrian, T.E., Bombesin may stimulate proliferation on human pancreatic cancer cells through an autocrine pathway, Int J Cancer, 1996, 68:4, 528−34.

88. Hajri, A., Balboni, G., Koenig, M., Garaud, J.C. et al., Gastrin-releasing peptide: in vivo and in vitro growth effect on an acinar pancreatic carcinoma, Cancer Res., 1992, 52:13, 372 632.

89. Farre, A., Inhizuka, J., Gomez, G., Evers, M.B., Saydjari, R" Koo, J.Y., Townsend, C.M., and Thompson, J.C. Bombesin inhibits growth of pancreatic ductal adenocarcinoma (H2T) in nude mice. Pancreas 9: 652−656, 1994.

90. Pinski, J., Schelly, A.V., Halmos, G., and Szepeshazi, K. Effect of somatostatin analog RC-160 and bombesin/gastrin releasing peptide antagonist RC-3095 on growth of PC-3 human prostate-cancer xenografts in nude mice. Int.J. Cancer., 1993, 55: 963−967.

91. Bologna, M., Festuccia, C., Muzi, P., Biordi, L., Ciomei, M., Bombesin stimulates growth of human prostatic cancer cells in vitro, Cancer, 1989, 63:9, 1714−20.

92. Brown, M., Allen, R., Villarreal,!, Rivier,!, and Vale, W. Bombesin-like activity: radioimmunologic assessment in biological tissues, Life Sci. 23, 2721−2728, 1978.

93. Feldman, R.I., Fried, S" Mann, E" Wu, J.M., and Liang, M. Gastrin-releasing peptide receptor signaling resulting in growth inhibition. Mol. Pharmacology, 49: 505−514, 1996.

94. Pinski,!, Schelly, A.V., Halmos, G., Szepeshazi, K., Groot, K., Somatostatin analogues and bombesin/gastrin-releasing peptide antagonist RC-3095 inhibit the growth of human glioblastomas in vitro and in vivo, Cancer Res., 1994, 54:22, 5895−901.

95. QinY., Ertl, T., Cai, R.Z., Halmos, G" and Schelly, A.V., Inhibbitory effect of bombesin receptor antagonist RC-3095 on the growth of human pancreatic cancer cells in vivo and in vitro. Cancer Res. 54: 1035−1041, 1994.

96. QinY, Ertl, T., Cai, R.Z., HaImos, G., Groot, K., Schelly, A.V., Antagonists of bombesin/gastrin-releasing peptide inhibit growth of SW-1990 human pancreatic adenocarcinoma and production of cyclic AMP, Int J Cancer, 1995, 63:2, 257−62.

97. Yano, T., Pinski, Jj., Groot, K., Schally, A.V., Stimulation by bombesin and inhibition by bombesin/gastrin-releasing peptide antagonist RC-3095 of human breast cancer cell lines, Cancer Res., 1992, 52:16, 4545−7.

98. Orosz, A., Schrett, J., Nagy, J., Bartha, L. et al., New short-chain analogs of a substance P antagonist inhibit proliferation of human small-cell lung-cancer cells in vitro and in vivo, Int J Cancer, 1995, 60:1,82−7.

99. Moody, T.W., Venugopal, R., Zia, F" Patierno, S., Leban, J.J., McDermed, J., BW2258: a GRP receptor antagonist which inhibits small cell lung cancer growth, Life Sci., 1995, 56:7, 521−9.

100. Schally A. V., Oncological Applications of Somatostatin Analogues, Cancer Res., 48, 69 776 985, 1988.

101. Reubi, J-C. and Laissue, J.A., Multiple actions of somatostatin in neoplastic disease, Trend in Pharmacol. Sci., 1995, V. 16/1, pp. 110−115.

102. Setyono-Han, B., Helkelman, M.S., Foekens, J.A. and Klijn, JG.M., Direct inchibitory effects of somatostatin (analogues) on the growth of human breast cancer cells, Cancer Res., 1987, V. 47, pp. 1566−1570.

103. Takeda, Y., Escribano, M.J., Effects of insulin and somatostatin on the growth and the colony formation of two human pancreatic cancer cell lines, J Cancer Res Clin Oncol, 1991, 117:5,416−20.

104. Santini, V., Lamberts, S.W., Krenning, E.P., Backx, B. et al., Somatostatin and its octapeptide analog SMS-201−995 as inchibitors of proliferation of human acute lymphoblastic and acute myeloid leukemia, Leuk. Res., 1995, V. 19:10, pp. 707−712.

105. Brevini, T.A., Bianchi, R., Motta, M., Direct inhibitory effect of somatostatin on the growth of the human prostatic cancer cell line LNCaP: possible mechanism of action, J Clin Endocrinol Metab, 1993, 77:3, 626−31.

106. Liebow, C., Reilly, C., Serrano, M. and Schally, A.V., Somatostatin analogues inhibit growth of pancreatic cancer by stimulating tyrosine phosphatase, PNAS, 1989, V. 86, pp. 2003;2007.

107. Radulovic, S., Comaru-Schally, A.M., Milovanovic, S., Schally, A.V., Somatostatin analogue RC-160 and LH-RH antagonists SB-75 inhibit growth of MIA PaCa-2 human pancreatic cancer xenografts in nude mice, Pancreas, 1993, 8:1, 88−97.

108. Taylor, J.E., Bogden, A.E., Moreau, I.P., and Coy, D.H. In vitro and in vivo inhibition of human small cell lung carcinoma (NCI-H69) growth by a somatostatin analog. Biochem.Biophis.Res.Commun., 153: 81−86, 1988.

109. Privost, G., Foehrli, E., Thomas, F. et al., Growth of human breast cancer cell lines is inhibited by somatostatin analog BIM23 014, Endocrinology, 1991, 129:1, 323−9.

110. Strikant, C.B., Cell cycle dependent induction of apoptosis by somatostatin analog SMS-201−995 in AtT-20 mouse pituitary cells, BBRC, 1995, V. 209, pp. 400−406.

111. Santini, V., Lamberts, S.W., Krenning, E.P., Backx, B. et al., Somatostatin and its octapeptide analog SMS-201−995 as inchibitors of proliferation of human acute lymphoblastic and acute myeloid leukemia, Leuk. Res., 1995, V. 19:10, pp. 707−712.

112. Ellison, E.C., 0'Dorisio, T.M., and Benson, G.D. Modulation of functional gastrointestinal endocrine tumors by endogenous and exogenous somatostatin. Am.J.Med., 151: 668−675, 1986.

113. Kvols, L.D., Moertel, C.G., 0'Connell, M. J" Shutt, A. J" Rudin, J" and Hahn, R.G. Treatment of the malignant carcinoid syndrome. N.Engl.J.Med., 315: 663−666, 1986.

114. Said, S.I. and Mutt, V., Polipeptide with broad biological activity: isolation from smal intestine, Sience, 1970, 169, 1217−1218.

115. O’Dorisio, M.S., Fleshman, D.J., Qualman, S.J. and O’Dorisio, T.M., Vasoactive intestinal peptide: autocrine growth factor in neuroblastoma, Reg. Pept., 1992, 37, 213−226.

116. Pence, J.C. and Shorter, N.A., In vitro differentiation of human neuroblastoma cells caused by vasoactive intestinal peptide, Cancer Res., 1990, 50, 5177−5183.

117. Lilling, G., Wollman, Y" Goldstein, N.M., Rubinraut, S" Fridkin, M" Brenneman, D.E., Gozes, I., Inhibition of human neuroblastoma growth by a specifie VIP antagonist, J Mol Neurosci., 1994, 5:4, 231−9.

118. Gozes, I. and Brenneman, D.E., VIP: molecular biology and neurobiological function, Mol. Neurobiol., 1989, 3, 201−23.

119. Scholar, E.M., Paul, S., Stimulation of tumor cell growth by vasoactive intestinal peptide, cancer, 1991, 67:6, 1561−4.

120. Moody, T.W., Zia, F., Draoui, M., Brenneman, D.E. et al., A vasoactive intestinal peptide antagonist inhibits non-small cell lung cancer growth, PNAS, 1993, 90:10, 4345−9.

121. Maruno, K., Said, S.I., Small-cell lung carcinoma: inhibition of proliferation by vasoactive intestinal peptide and helodermin and enhancement of inhibition by anti-bombesin antibody, Life Sci., 1993, 52:24, PL267−71.

122. Kim, S.W., Beauchamp, R.D., Townsend, J.M., Thompson, J.C., Vasoactive intestinal polypeptide inchibits c-myc expression and growth of human gastric carcinoma cells, Surgery, 1991, 110:2, 270−5- discussion 276.

123. Jiang, S., Kopras, E., McMichael, M., Bell, H. and Ulrich, C.D., Vasoactive intestinal peptide (VIP) stimulates in vitro growth of VTP-1 receptor-bearing human pancreatic adenocarcinoma-derived cells, Cancer Res., 1997, 57, 1475−1480.

124. Chen, Y., Chen, Q., Lu, G., Fan, Z., Zhong, S., The autocrine regulatory effect of vasoactive intestinal peptide on the growth of human pancreatic carcinoma cells, Chin Med Sci J., 1994, 9:4,215−9.

125. Huang, X., Zhang, Y., Bu, Y., Su, Y., Vasoactive intestinal peptide stimulates the growth of rat hepatoma cells in vitro, Chin Med Sci J., 1993, 8:3, 147−50.

126. Hoosein, N.M., Black, B.E., Brattain, D.E. and Brattain, M.G., Promotion of differenyiation in human colon carcinoma cells by vasoactive intestinal polypeptide, Reg. Pept., 1989, 24, 15−26.

127. Garnet, L., Murat, J.C., Remaury, A., Remesy, C., Valet, P., Paris, H., Denis-Pouxviel, C., Vasoactive intestinal peptide and forskolin regulate prolifertion of the HT29 human colon adenocarcinoma cell line, J. Cell Physiol., 1992, 150:3, 501−9.

128. Reubi, J.C., In vitro identification of vasoactive intestinal peptide receptors in human tumors: implications for tumor imaging, J Nucl. Med., 1995, 36, 1846−1853.

129. Verspaget, H.W., Peca, A.S., et al., Modulatory effect of VIP and related peptides from the gastrointestinal tract on cell mediated cytotoxicity against tumour cells in vitro, Immunol. Invest, 1991, 20:3, 257−67.

130. Goossens, J.F., Manechez, D., Pommery, N., Formstecher, P., Henichart, J.P., VIP potentiates retinoic-acid effect on tissue transglutaminase activity in human neuroblastoma, the SK-N-SH cells, Neuropeptides, 1993, 24: 99−103.

131. Jiang, S., Kopras, E., McMichael, M., Bell, H. and Ulrich, C.D., Vasoactive intestinal peptide (VTP) stimulates in vitro growth of VTP-1 receptor-bearing human pancreatic adenocarcinoma-derived cells, Cancer Res., 1997, 57, 1475−1480.

132. Chen, Y., Chen, Q., Lu, G., Fan, Z., Zhong, S., The autocrine regulatory effect of vasoactive intestinal peptide on the growth of human pancreatic carcinoma cells, Chin Med SciJ., 1994,9:4,215−9.

133. Huang, X., Zhang, Y., Bu, Y., Su, Y., Vasoactive intestinal peptide stimulates the growth of rat hepatoma cells in vitro, Chin Med Sci J., 1993, 8:3, 147−50.

134. Gitter, B.D., Regoli, D., Howbert, J.J., Glasebrook, A.L., Waters, D.C., Interleukin-6 secretion from human astrocytoma cells indused by substance P, J of Neuroimmunol., 1994, 51, 101−108.

135. Ishioka, C., Yoshida, A., Kimata, H, Mikawa, H., Vasoactive intestinal peptide stimulates immunoglobulin production and growth of human B cells, Clin Exp Immunol., 1992, 87:3, 504−8.

136. Camby, I., Salmon, I., Danguy, A., Danguy, A., Pasteels, J.L., et al., Influence of gastrin on astrocytic tumor cell proliferation, J. Natl. Cancer Inst., 1996, V. 88−9, pp. 594−600.

137. Sethi, T., Herget, T" Wu, S.V., Walsh, J.H. and Rozengurt, E., CCKa and CCKr2+receptors are expressed in small cell lung cancer lines and mediate Ca mobilization and clonal growth, Cancer Res., 1993, 53, 5208−5213.

138. Smith, J.P., Kramer, S.T., Solomon, T.B., CCK stimulates growth of six human pancreatic cancer cell lines in serum-free medium, Regul. Pept., 1991, 32:3, 341−9.

139. Smith, J.P., Fantaskey, A.P., Liu, G., Zagon, I.S., Identification of gastrin as a growth peptide in human pancreatic cancer, Am J Physiol., 1995, 268:1 Pt2, R135−41.

140. Funakoshi, A., Kono, A., Growth inhibition of human pancreatic cancer cells by cholecystokinin receptor antagonist in tissue culture and in nude mice, Gastroenterol Jpn, 1992, 27:1,78−82.

141. Blackmore, M., Hirst, B.H., Autocrine stimulation of growth of AR4−2J rat pancreatic tumour cells by gastrin, Br J Cancer, 1992, 66:1, 32−8.

142. Swift, I.R., Smith, J.P., Cholecystokinin analog, JMV-180, stimulates growth of human pancreatic cancer, Dig Dis Sci, 1994, 39:5, 1007−13.

143. Watson, S.A., Steele, R.J., Gastrin antagonists in the treatment of gastric cancer, Anticancer Drugs, 1993, 4:6, 599−604.

144. Inhizuka, J., Martinez, J., Townsend, CM. Jr., Thompson, J.C., The effect of gastrin on growth of human stomach cancer cells, Ann Surg, 1992, 215:5, 528−34.

145. Imdahl, A., Fggstein, S., Crone, C., Fathmann, E.H., Growth of colorectal carcinoma cells: regulation in vitro by gastrin, pentagastrin and the gastrin-receptor antagonist proglumide, J Cancer Res Clin Oncol., 1989, 115:4, 388−92.

146. Mauss, S., Niederau, C., Hengels, K.J., Effect of gastrin, proglumide, loxiglumide and L-365,260 on growth of human colon carcinoma cells, Anticancer Res., 1994, 14:1A, 215−20.

147. Nugre, F., Fagot-Reurat, P., Bouisson, M., Rehfeld, J.F., Vaysse, N., Pradayrol, L., Autocrine stimulation of AR4−2J rat pancreatic tumor cell growth by glycine-extended gastrin, Int. J. Cancer, 1996, V.66:5, pp. 653−658.

148. Xu, Y., Kaji, H., Okimura, Y., Matsui, T., Abe, H, Chihara, K" Paracrine stimulation of cell growth by cholecystokinin/gastrin through cholecistokinin-B receptor on GH3 cells in vitro, Neuroendocrinology, 1996, 64:4, 280−5.

149. Camby, I., Salmon, I., Oiry, J-C. et al. The influence of gastrin and/or cholecystokinin antagonists on the proliferation of three human astrocytic tumor cell lines, Neuropeptides, 1996; 30(5): 433−437.

150. Blackmore, M., Dohherty, E., Manning, J.E., Hirst, B.H., Autocrine growth stimulation of human renal Wilms' tumour G401 cells by a gastrin-like peptide, Int J Cancer, 1994, 57:3, 385−91.

151. Davis, T.P., Crowell, S., Mclnturff, B., Louis, R. and Gillespie, T., Neurotensin may function as a regulatory peptide in small cell lung cancer, Peptides, 1991, V. 12:1, pp. 17−23.

152. Seufferlein, T., Rozengurt, E., Galanin, neurotensin, and phorbol esters rapidly stimulate activation of mitogen-activated protein kinase in small cell lung cancer cells, Cancer Res., 1996, 56:24, 5758−64.

153. Tallet, A., Chilvers, E.R., MacKinnon, A.C., Haslett, C., Sethi, T., Neuropeptides stimulate tyrosine phosphorylation and tyrosine kinase activity in small cell lung cancer cell lines, Peptide, 1996, 17:4, 665−73.

154. Sehgal, I., Powers, S. et al., Neurotensin is an autocrine trophic factor stimulated by androgen withrawal in human proctate cancer, PNAS, 1994, 91, 4673−4677.

155. Evers, B.M., Ishizuka, J., Chung, D.H., Townsend, C M., Thompson, J.C., Neurotensin expression and release in human cancers, Ann. Surg., 1992, 216:4, 423−30.

156. Camby, I., Salmon, I., Bourdel, E., Nagy, N., Danguy, A., Brotchi, J., Pasteels, J-L., Martinez, J., Kiss, R., Neurotensin-mediated effect on astrocytic tumor cell proliferation, Neuropeptides, 1996, 30:2, 133−139.

157. Ishizuka, J., Townsend, C.M., Thompson, J.C., Neurotensin regulates growth of human pancreatic cancer, Ann. Surg., 1993, 217:5, 439−45.

158. Sumi, S., Evers, B.M., Townsend, C.M. et al., Comparative effects of neurotensin and neuromedin N on growth of human pancreatic cancer, MIA PaCa-2, Surg. Oncol., 1993, 2:5, 267−72.

159. Moody, T.W., Staley, J., Zia, F., Coy, D.H., Jensen, R.T., Neuromedin B binds with high affinity, elevates cytosolic calcium and stimulates the growth of small-cell lung cancer cell lines, J Pharmacol Exp Ther, 1992, 263:1, 311−7.

160. Payan, D.G., Brewster, D.R., Goetzl, E.J., Specific stimulation of human T lymphocytes by substance P, J.Immunol., 1983, 131, 1613−1615.

161. Bar-Shavit, Z., Goldman, R., Blumberg, S., Enhancement of phagocytosis a newly found activity of substance P residing in its N-terminal tetrapeptide sequence, BBRC, 1980, 94, 1445−1451.

162. Johnson, A.R., Erdos, E.G., Release of histamine from mast cells by vasoactive peptides, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1973, 142, 1252−1256.

163. Shanahan, F., Denbueg, J.A., Bienenstock, J., Befus, D., Mast cell heterogeneity: effects of neuroenteric peptides on histamine release, J.Immunol., 1985, 135, 1331−1337.

164. Flageole H, Senterman M, Trudel JL, Substance P increases in vitro lymphokine-activated-killer (LAK) cell cytotoxicity against fresh colorectal cancer cells, J Surg Res 1992 Nov-53(5):445−449.

165. Reeve, J.G. and Bleehen, N.M., D-Argl, D-Phe5,D-Trp7,9,Leull] substance P indused apoptosis in lung cancer cell lines in vitro, BBRC, 1994, 199/3, 1313−1319.

166. Iwasaki, Y., Iwasaki, J. and Freake, H.C., Growth inhibition of human breast cancer cells induced by calcitonin, BBRS, 1983, 110/1, 235−242.

167. Ritchie, C.K., Thomas, K.G., Andrews, L.R., Tindall, D.I., Fitzpatrick, L.A., Effects of the calciotrophic peptides calcitonin and parathyroid hormone on prostate cancer growth and chemotaxis, Prostate, 1997, 30:3, 183−7.

168. Nakamura, A., Yamatani, T., Arima, N., Yamashita, Y., Fujita, T. and Chiba, T., calcitonin inhibits the growth of human gastric carcinoma cell line KATO III, Regul. Pept., 1992, 37, 183−194.

169. Segal-Abramson, T., Kitroser, H., Levy, J., Schally, A.V., Sharoni, Y., Direct effects of luteinizing hormone-releasing hormone agonists and antagonists on MCF-7 mammary cancer cells, PNAS, 1992, 89:6, 2336−9.

170. Sharoni, Y., Bosin, E., Minster, A., Levy, J. and Schally, A.V., inhibition of growth of human mammary tumor cells by potent antagonists of luteinizing hormone-releasing hormone, PNAS, 1989, 86, 1648−1651.

171. Yano, T., Pinski, J., Radulovic, S., Shally, A.V., Inhibition of human epitelial ovarian cancer cell growth in vitro by agonistic and antagonistic analogues of luteinizing hormone-releasing hormone, PNAS, 1994, 91:5, 1701−5.

172. Pinshi, J., Reile, H., Halmos, G., Groot, K., Schally, A.V., Inhibitory effects of analogs of luteinizing hormone-releasing hormone on the growth of the androgen-independent Dunning R-3327-AT-1 rat prostate cancer, Int J Cancer, 1994, 59:1, 51−5.

173. Imai A, Takagi A, Horibe S, Takagi H, Tamaya T, Fas and Fas ligand system may mediate antiproliferative activity of gonadotropin-releasing hormone receptor in endometrial cancer cells, Int J Oncol 1998 Jul-13(l):97−100.

174. Yin H, Cheng KW, Hwa HL, Peng C, Auersperg N, Leung PC, Expression of the messenger RNA for gonadotropin-releasing hormone and its receptor in human cancer cell lines, Life Sci 1998;62(22):2015;23.

175. Naor Z, Shacham S, Harris D, Seger R, Reiss N, Signal transduction of the gonadotropin releasing hormone (GnRH) receptor: cross-talk of calcium, protein kinase C (PKC), and arachidonic acid. Cell Mol Neurobiol 1995 Oct-15(5):527−44.

176. Mezo I., Vincze B., Pato J., Palyi I., Toth G., Gulyas E., Kalnay A., Teplan I., Lovas S. and Murphy R.F., Studies on antitumor activity of GnRH analog conjugates, Peptides 1998, Ed. By Bajusz S. and Hudecz F, pp 436−437.

177. Chooi, K-F., Carter, D.A., Biswas, S., Lightman, S.L., Ho, M-Y. and Murphy, D., Ectopic vasopressin expression in MMTV-Wnt-1 transgenic mice modifies mammaiy tumor differentiation and pathology, Cancer Res., 1994, 54, 6434−6440.

178. Layton, J.E., Scanlon, D.B., Soveny, C., Morstyn, G., Effects of bombesin antagonists on the growth of small cell lung cancer cells in vitro, Cancer Res., 1988,48 :17, 4783−9.

179. Taylor, A.H., Ang, V.T.Y., Jenkins, J.S. et al., Interaction of vasopressin and oxytocin with human breast carcinoma cells, Cancer Res., 1990, 50, 7882−7886.

180. Rozengurt, E., Legg, A. and Pettican, P., Vasopressin stimulation of mouse 3T3 cell growth, 1979, 76/3, 1284−1287.

181. Croxatto, H.R. and Croxatto, R. «Pepsitensin a hypertensin-like substance produced by peptic digestion of proteins», (1942), Science, 95, 101−103.

182. Henschen, A., Lottspeich, F., Brantl, V. and Teschhemacher, H. «Novel opioid peptides derived from casein (p-casomorphins)», (1979), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360, 1217−1224.

183. Brantl, V., Gramsch, Ch., Lottspeich, F., Mertz, R., Jaeger, K.-H. and Herz, A., Novel opioid peptides derived from hemoglobin: hemorphins, Eur.J.Pharmacol., 1986, 125, 309 310.

184. Piot JM, Zhao Q, Guillochon D, Ricart G, Thomas D, Isolation and characterization of two opioid peptides from a bovine hemoglobin peptic hydrolysate, Biochem Biophys Res Commun 1992 Nov 30−189(1):101−10.

185. Piot JM, Zhao Q, Guillochon D, Ricart G, Thomas D, Isolation and characterization of a bradykinin-potentiating peptide from a bovine peptic hemoglobin hydrolysate, FEBS Lett 1992 Mar 24−299(l):75−9.

186. Garreau I, Zhao Q, Pejoan C, Cupo A, Piot JM, W-hemorphin-7 and LW-hemorphin-7 released during in vitro peptic hemoglobin hydrolysis are morphinomimetic peptides, Neuropeptides 1995 Apr-28(4):243−50.

187. Brantl V, Novel opioid peptides derived from human beta-casein: human beta-casomorphins, Eur J Pharmacol 1984 Oct 30−106(l):213−4.

188. Brantl V, Teschemacher H, Blasig J, Henschen A, Lottspeich F, Opioid activities of beta-casomorphins, Life Sci 1981 Apr 27−28(17): 1903;9.

189. Nicot C, Vacher M, Denoroy L, Kahn PC, Waks M, Limited proteolysis of myelin basic protein in a system mimetic of the myelin interlamellar aqueous space, J Neurochem 1993 Apr-60(4): 1283−91.

190. Baxevanis CN, Reclos GJ, Servis C, Anastasopoulos E, Arsenis P, Katsiyiannis A, Matikas N, Lambris JD, Papamichail M, Peptides of myelin basic protein stimulate T lymphocytes from patients with multiple sclerosis, J Neuroimmunol 1989 Mar-22(l):23−30.

191. Fukudome S, Yoshikawa M, Opioid peptides derived from wheat gluten: their isolation and characterization, FEBS Lett 1992 Jan 13−296(1): 107−11.

192. Fukudome S, Yoshikawa M, Gluten exorphin C. A novel opioid peptide derived from wheat gluten, FEBS Lett 1993 Jan 18−316(1): 17−9.

193. Ufkes JG, Visser BJ, Heuver G, Van der Meer C, Structure-activity relationships of bradykinin potentiating peptides, Eur J Pharmacol 1978 Jul 15−50(2):119−22.

194. Heaney-Kieras J, King TP, Limited pepsin digestion of human plasma albumin, J Biol Chem 1977 Jun 25−252(12):4326−9.

195. Tani F., Iio K., Chiba H., Yoshikawa M., Isolation and characterization of opioid antagonist peptodes derived from human lactoferrin, Agric.Biol.Chem., 1990, 54, 1803−1810.

196. Bellamy W., Takase M., Yamauchi K., Wakabayashi H., Kawase K., Tomita M., Identification of the bacterial domain of lactoferrin, BBA 1992,1121, 130−136.

197. Shimazaki K., Nam M.-S., Harakawa Sh., Tanaka T., Omata Y., Saito A. et all, Structural and immunochemical studies of bovine antimicrobial peptide «lactoferrin», In Peptide Chemistry, 1996/Ed.C.kidata.Osaka: Protein Research foundation, 1997, 197−200.

198. Odell E.W., Sarra R., Foxworthy M" Chappie D.S., Evance R.W., Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin, FEBS Lett., 1996, 382, 175 178.

199. Ufkes JGR, Aarsen PN, Van Der Meer C., The mechanism of action of two bradikinin-potentiating peptides on isolated smooth muscle, Eur.J.Pharmacol., 1977, 44, 89−97.

200. Assreuy J, Almeida AA, Guimaraes J A, Pharmacological properties of a new kinin-potentiating peptide generated from human serum proteins, Eur J Pharmacol 1989 Sep 13−168(2):231−7.

201. Shen FS, Lindberg I, Purification and assay of opioid activity of low molecular weight enkephalin-immunoreactive peptides generated by peptic digestion of rat plasma proteins, Neuropeptides 1989 Jan- 13(1): 17−22.

202. Carraway RE, Mitra SP, Muraki K, Isolation and structures of xenopsin-related peptides from rat stomach, liver and brain, Regul Pept 1990 Jul 30−29(2−3):229−39.

203. Carraway RE, Cochrane DE, Ruane SE, Isolation, structures, and biologic activity of neurotensin-related peptides generated in extracts of avian tissue, J Biol Chem 1987 Nov 25−262(33): 15 886−9.

204. Carraway RE, Mitra SP, Cochrane DE, Structure of a biologically active neurotensin-related peptide obtained from pepsin-treated albumin (s), J Biol Chem 1987 May 5−262(13):5968−73.

205. Chang RC, Huang WY, Redding TW, Arimura A, Coy DH, Schally AV, Isolation and structure of several peptides from porcine hypothalami, Biochim Biophys Acta 1980 Oct 21−625(2):266−73.

206. Cochrane, D.E., Carraway, R.E., Feildberg, R.S., Boucher, W. and Gelfand, J.M. «Stimulated rat mast cells generate histamine-releasing peptide from albumin», (1993), Peptides, 14, 117−123.

207. Yamamoto, N. «Antihypertensive peptides derived from food proteins», (1997), Biopymers. Pept. Sci., 43, 139−146.

208. Preciado-Patt, L. and Fridkin, M. (1996), In: Peptides: Chemistry, Structure and Biology (Kaumaya P.T.P and Hodges R. S, eds.), p. 786−787, Mayflower Scientific Ltd.

209. Dagouassat, N., Garreau, I., Sannier, F., Zhao, Q. and Piot, J.M. «Generation of W-hemorphin-7 from globin by peritoneal macrophages», (1996), FEBSLett., 382, 37−42.

210. Gately S., Twardowski P., Stask S., et all., Human prostate carcinoma cells express enzymatic activity that converts human plasminogen to the angiogenesis ingibitor, angiostatin, Cancer Res, 1996, v.56, p.4887−4890.

211. Davis, T. P, Crowell, S, Mclnturff, B, Louis, R. and Gillespie, T. «Neurotensin may function as a regulatory peptide in small cell lung cancer», (1991), Peptides, 12, 17−23.

212. Carraway, R.E., Cochrane, D.E., Boucher, W. and Mitra, S.P. «Stimulated rat mast cells generate histamine-releasing peptide from albumin», (1989), J. Immunol., 143, 1680−1684.

213. Pivnik AV, Rasstrigin NA, Philippova MM, Karelin AA, Ivanov VT, Alteration of intraerythrocyte proteolytic degradation of hemoglobin during Hodgkin’s disease, Leuk Lymphoma 1996 Jul-22(3−4):345−9.

214. Karelin AA, Philippova MM, Ivanov VT, Proteolytic degradation of hemoglobin in erythrocytes leads to biologically active peptides, Peptides 1995; 16(4):693−7.

215. Slemmon JR, Hughes CM, Campbell GA, Flood DG, Increased levels of hemoglobin-derived and other peptides in Alzheimer’s disease cerebellum, J Neurosci 1994 Apr-14(4):2225−35.

216. Slemmon JR, Flood DG, Profiling of endogenous brain peptides and small proteins: methodology, computer-assisted analysis, and application to aging and lesion models, Neurobiol Aging 1992 Nov-Dec-13(6):649−60.

217. Зиганшин P.X., Свиряев В. И., васьковский Б.В. и др., Биологически активные пептиды, выделенные из мозга зимнеспящих сусликовб Юиоорган. Химия., 1994, 20 (8−9), 899−918.

218. Ivanov VT et all., Peptides from hibernating ground squirrels and their physiological activity, Peptides, 1990, Proceedings of the Twenty-Ferst European Peptide Symposium (edss. E. Giralt and D. Andreu), ESCOM, Leiden, 1991, 751−752.

219. Karelin AA, Blishchenko E.Yu., Ivanov VT, A novel system of peptidergic regulation, FEBS Lett., 1998, 428, p.7−12.

220. Ivanov, V. Т., Karelin, A. A., Mikhaleva, I. I., Vas’kovsky, B.V., Sviryaev, V. I. and Nasimov, I. V., «Isolation, structure and properties of new endogeneous peptides», (1993), Soviet Journal ofBioorganic Chemistry, 18, 677−806.

221. Slemmon, J.R., Hughes, C.M., Cambell, G.A. and Flood D.G. «Increased levels of hemoglobin-derived and other peptides in Alzheimer’s disease cerebellum», (1994), J.Neurosci., 14, 2225−2235.

222. Slemmon, J.R., Wengenack, T.M. and Flood D.G. «Profiling of endogenous peptides as a tool for studying development and neurological disease», (1997), Biopolymers. Peptides Sci., 43, 157−170.

223. Lantz, I., Glamsta, E.-L., Talback, L. and Nyberg, F. «Hemorphins derived from hemoglobin have an inhibitory action on angiotensin converting enzyme activity», (1991), FEBSLett., 287, 39−41.

224. Yamamoto, N. «Antihypertensive peptides derived from food proteins», (1997), Biopymers. Pept. Sci., 43, 139−146.

225. Weyers, R., Hagel, P., Das, B.C. and Van Der Meer, C. «Tryptic peptides from rabbit and bovine albumine enhancing the effect of bradikinin», (1972), Biochim. Biophys. Acta, 279, 331−335.

226. Yokoyama, K., Chiba, H. and Yoshikawa, M. «Peptides inhibitors for angiotensin I-converting enzyme from thermolysin digest of dried bonito», (1992), Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1541−1545.

227. Ufkes, J.G.R., Aarsen, P.N. and Van Der Meer, C. «The mechanism of action of two bradikinin-potentiating peptides on isolated smooth muscle», (1977), Eur. J. Pharmacol., 44, 89−97.

228. Ufkes, J.G.R., Visser, B.J., Heuver, G. and Van der Meer, C. «Structure-activity relationships ofbradikinin potentiating peptides», (1978), Eur. J. Pharmacol, 50, 119−122.

229. Yoshikawa M., Suganuma H., Takahashi M., Fukudome S.-I., Chiba H //3-casomorphins and related peptides / Ed Brantl V. Berlin: VCH, 1992, p 38−42.

230. Ohmori, T., Nakagami, T., Tanaka, H. and Maruyama, S. «Isolation of prolylendopeptidase-inhibiting peptides from bovine brain», (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 202, 809−815.

231. Petrov, R.V., Mikhailova, A.A. and Fonina, L.A. «Bone marrow immunoregulatory peptides (Myelopeptides): isolation, structure and functional activity», (1997), Biopymers. Pept. Sci., 43, 139−146.

232. Garreau I., Pejoan C., Bressollier P., Verneuil B., Cucumel K., Cupo A., // Petides, 1994, v.15 p.1195.

233. Parker, F., Migliore-Samour, D., Floc’h, F. et al., Immunostimulating hexapeptide from human casein: amino acid sequence, synthesis and biological properties, Eur. J. Biochem. (1984) V.145, pp.677−682.

234. Berthou, J., Migliore-Samour, D., Lifchitz, A., Delettre, J., Floc’h, F., and Jolies, P., Immunostimulating properties and tree-dimensional structure of two tripeptides from human and cow caseins, FEBS Lett., 1987, V.218/1, pp.55−58.

235. Kayser, H., Meisel, H., Stimulation of human peripheral blood lymphocytes by bioactive peptides derived from bovine milk proteins, FEBS Lett., 1996, V.383, pp. 18−20.

236. Stabinsky, Y., Gottlieb, P., Zakuth, V., Spirer, Z. and Fridkin M., Specific binding sites for the phagocitosis stimulating peptide tuftsin on human polymorphonuclear leucocites and monocytes, BBRC, 1978, V. 83/2, pp. 599−606.

237. Carraway, R.E., Cochrane, D.E., Boucher, W. and Mitra, S.P., Structures of histamine-releasing peptides formed by the action of acid proteases on mammalian albumin (s), J. Immunol., 1989, V. 143, pp. 1680−1684.

238. Carraway, R.E., Cochrane, D.E., Boucher, W. and Mitra, S.P., Xenopsin-related peptide generated in avian gastric extracts, Regul. Pept., 1988, V. 22, pp. 303−314.

239. Abiko, T., Kumikawa, M. and Sekino, H., Inhibition effect of rosette formation between human lymphocytes and sheep eryutrocytes by specific heptapeptide isolated from uremic fluid and its analogs, BBRC, 1979, V. 86/4, pp. 945−952.

240. Mikhailova, A., Fonina, L., Kirilina, E., Shanurin, S., et al., Immunoregulatory properties of hexapeptide isolated from porcine bone marrow cell culture, Regulatory Pept., 1994, 53, 203−209.

241. Стрелков, В.А., Михайлова, A.A., Фонина, JI.A., Гурьянов, С.А., Петров, Р.В., Миелопептид (бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1995, 5, 530−532.

242. Meisel, H. «Regulatory properties of regulatory peptides derived from milk proteins», (1997) Biopolymers. Peptide Science, 43, 119−128.

243. Antila, P., Paakkari, I., Jarvinen, A., Mattila, M.J., Laukkanen, M., Pihlanto-Leppala, A., Mantsala, P. and Hellman, J. «Opioid peptides derived from in vitro proteolysis of whey proteins», (1991), Int. Dairy J., 1, 215−229.

244. Bronnikov, G., Dolgacheva, L., Zhang, Sh.-J., Galitovskaya, E., Kramorova, L. and Zinchenko, V. «The effect of neuropeptides kyotorphin and neokyotorphin on proliferation of cultured brown predipocytes», (1997), FEBS Lett., 407, 73−77.

245. Bronnikov, G., Dolgacheva, L., Zhang, S-J., Galitovskaya, E., Kramarova, L., Zinchenko, V., The effect of neuropeptides kyotorphin and neokyotorphin on proliferation of cultured brown preadipocytes, FEBS Lett., 1997, V. 407, pp. 73−77.

246. Loo, D. T., Copani, A. and Cotman, C.W." Apoptosis is induced by P-amyloid protein fragment incultured nervous system neurons", (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7951−7955.

247. Jackson, J.D., Yan, Y., Ewel, C. and Talmadge, J.E. «Activity of acetyl-N-Ser-Asp-Lys-Pro (AcSDKP) on hematopoietic progenitor cells in short-term and long-term murine bone marrow cultures», (1996), Exper. Hematology, 24, 475−481.

248. Hatzoglou A, Bakogeorgou E, Hatzoglou C, Martin PM, Castanas E, Antiproliferative and receptor binding properties of alphaand beta-casomorphins in the T47D human breast cancer cell line, Eur J Pharmacol 1996 Aug 29−310(2−3):217−23.

249. Kim, W. H, Schnaper, W, Nomizu, M, Yamada, Y. and Kleinman, H. K, Apoptosis in human fibrosarcoma cells is indused by a multimeric syntetic Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)-containing polipeptide from laminin, Cancer Res, 1994, 54, 5005−5010.

250. Dhanabal M" Ramchandran R, Volk R, Stillman I.E., Lombardo M, Iruela-Arispe M. L, Simons M, Sukhatme V. P, Endostatin: yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma, Cancer Res, 1999, 59(1), 189−197.

251. Henschen A. et all. Novel opioid peptides derived from casein (P-casomorphins), Physiol. Chem, 1979,360, 1217−1224.

252. Brantl V. and Teschhemacher H, A material with opioid activity in bovin milk and milk products, Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol, 1979, 306, 303−304.

253. Paakkari I, Jarvinen A, Mattila MJ" Pihlanto-Leppala A, //p-casomorphins and related peptides./ Ed Brantl V. Berlin: VCH, 1992, 34−37.

254. Tani F, Shiota A, Chiba H, Yoshikawa M, //p-casomorphins and related peptides./ Ed Brantl V. Berlin: VCH, 1992, 49−54.

255. Garreau I, Pejoan C, Bressollier P, Verneuil B, Cucumel K, Cupo A, Purification and characterization of enkephalin-related peptides released by in vitro peptic digestion of bovine plasma proteins, Peptides 1994;15(7):1195−204.

256. Fukudome S, Yoshikawa M, //P-casomorphins and related peptides./ Ed Brantl V. Berlin: VCH, 1992, 18−25.

257. Bakalkin G Ya, Demuth H-U. and Nyberg F, Relatioship between primary structure and activity in exorphins and endogenous opioid peptides, FEBS Lett, 1992, 310, 13−16.

258. Yoshikawa M, Takahashi M, Moriguchi Sh, Nakagii R, Ikeno M, Suganuma H, Sasaki R, //Peptides. Chemistry, Structure and Biology/ Eds Kaumaya P.T.P, Hodges RS, Mayflower Scientific Ltd, 1996, in press.

259. Kato M, Fujiwara Y, Okamoto A, Yoshikawa M, Chiba H, Udaka S, Efficient production of casoxin D, a bradykinin agonist peptide derived from human casein, by Bacillus brevis, Biosci Biotechnol Biochem 1995 Nov-59(l l):2056;9.

260. Ivanov V.T., Karelin A.A., Philippova M.M., Nazimov I.V., Pletnev V.Z., Hemoglobin as a sourse of endogenous bioactive peptides: the concept of tissue-specific peptide pool, Peptide science, 1997, V. 43, N 2, pp. 171−188.

261. Ivanov V.T., Karelin A.A., Philippova M.M., Blishchenko E.Yu. and Nazimov I.V., Proteolytic degradation of gemoglobin in vivo. Role in formation of tissue specific peptide pools., Pure and Appl. Chem., 1998, Vol. 70, No. 1, pp. 67−74.

262. Ivanov V.T., Yatskin O.N., Kalinina O.A., Philippova M.M., Karelin A.A. and Blishchenko E.Yu., Tissue-specific peptide pools: generation and function, Pure &Appl. Chem., 2000, Vol.00, № 1, p. 01−09.

263. Zadina JE., Paul D., Gergen KA" Ge L-J., Hackler L., Kastin AJ., Binding of Tyr-W-MIF-1 (Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2) and related peptides to щ and (j, 2 opiate receptors, Neurosci. Lett., 1996, 215, 65−69.

264. Zhu Y.X., His KL., Chen ZG" Zhang HL., Wu SX., Zhang SY., Fang PF., Guo SY., Kao YS., Tsou K., Neo-kyotorphin, an analgetic peptide isolated from human lung carcinoma, FEBS Lett., 208, 253−257.

265. Galoyan AA., Gurvitis В Ya., Shuvalova LA., Davis MT., Shively JE., Lee TD., A hypotalamic activator of calmodulin-dependent enzymes is thymosin (34(1−39), Neurochem. Res., 1992, 17, 773−777.

266. Galoyan AA., The primary structure and biological activity hemoglobin-related hypotalamic peptides. Bbiopolymers.Pept.Sci., 1997, 43, 135−137.

267. Erchegyi J., Kastin AJ., Zadina JE., Qiu X-D., isolation of a heptapeptide Val-Val-Tyr-Pro-Thr-Gln (valorphin) with some opioid activity, Int.J.Pept.Protein res., 1992, 39, 477−484.

268. Филиппова M.M., Карелин A.A., Иванов В. Т., Биологически активные протеолитические фрагменты функциональных белков, полученных in vitro, Биоорганическая химия, 1997, том 23, № 5, с. 388−409.

269. Kuznik R.I., Morozov V.G. And Khavinson V.Kh., Cytomedines and their role in regulation of physiological functions., Uspekhi sovremennoi biologii., 1995, 115³⁵³−367 (rus.).

270. Erchegyi J., Kastin AJ., Zadina JE., Qiu X-D., isolation of a heptapeptide Val-Val-Tyr-Pro-Thr-Gln (valorphin) with some opioid activity, Int.J.Pept.Protein res., 1992, 39, 477−484.

271. O.N.Yatskin, M.M.Philippova, E.Yu.Blishchenko, A.A.Karelin, V.T.Ivanov, LWand W-hemorphins: comparative levels in rat tissues, FEBSLett 1998; 428: 286−2901. РОССИЙСКАЯ j1. ГТ? С У П. А? с TFSE. M ?