Разработка системы высокоплотностного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток

1.

Актуальность темы

.

Во всем мире биотехнология в настоящее время является приоритетной наукой. Развитие этой науки, стоящей на стыке микробиологии, биохимии, генетики и других отраслей знаний, способно обеспечить многие насущные потребности человека.

Это тысячелетие будет являться веком биотехнологических инноваций. Благополучие жизни на Земле, развитие и процветание экономики, как мировой, так и отдельных государств, будут во многом зависеть от отношения государственных структур к биотехнологии не как к лозунгу -" Биотехнология — приоритетное направление развития экономики", а как к важнейшей отрасли народного хозяйства, и подкрепляться не лозунгами, а конкретными делами.

Важнейшей задачей современного производства является повышение его экономической эффективности, биотехнологическая промышленность здесь не является исключением.

В принципе такую задачу нельзя решать одинаково на разных предприятиях, и если и существуют сходные подходы и решения, то это целая система мероприятий, направленных на оптимизацию различных стадий биотехнологического процесса.

Именно создание «систем» технологического контроля является главным направлением в развитии современных производств.

В связи с тем, что конкуренция на этом рынке растет с каждым днем, перед отечественным производителем возникла необходимость в повышении качества выпускаемого продукта и, одновременно, снижения его себестоимости за счет управления и, соответственно, оптимизации технологических процессов.

Оптимизация биотехнологических процессов возможна только при наличии хорошо оснащенной контрольно-измерительной системы ферментационного блока. Наряду с традиционно используемыми датчиками, такими как датчики рН и температуры, перед разработчиками встает вопрос о необходимости иметь в составе ферментационного комплекса анализатор микробных клеток, способный проводить измерения количества биомассы в режиме реального масштаба времени в широком концентрационном диапазоне, не зависящем от физико-химических свойств среды, так как этот параметр является важнейшим при культивировании клеток микроорганизмов.

Для реализации управляемого биосинтеза, в том числе и методом высокоплотностного культивирования требуется непрерывный контроль различных параметров, в том числе р02 и биомассы в ферментере. В настоящее время концентрацию биомассы, в основном, измеряют off-line, что, в свою очередь влияет на качество производственного процесса. (Mallette 1969; Harris and Kell 1985). Оперативный контроль биомассы позволит оптимизировать разработку способов достижения высокого выхода необходимого продукта.

Основным приемом, обеспечивающим такую оптимизацию в периодическом культивировании, является метод fed-batch cultivation (контроль субстратных добавок в периодическом процессе) (F. Yoshida et al. 1973).

Предполагается, что субстрат вносится в среду не только в начале, но и по некоторому (заранее определенному) алгоритму в ходе культивирования. Последующие четверть века развития этого метода дали множество примеров его эффективности. Метод находит все большее применение при оптимизации процессов биосинтеза ряда продуктов, прежде всего в режиме высокоплотностного культивировании.

До середины 70-х годов доминирующим являлось мнение о невозможности получения биомассы, больше чем 30−40 г/л. В биотехнологии было введено понятие высокоплотностного ингибирования роста. Еще в 1929 г. была постулирована идея о жизненном или биологическом пространстве (С. Дж. Перт. 1978 стр.24). Потребовалось много лет, чтобы понять, что малый выход биомассы, на самом деле, был связан с малыми знаниями в биотехнологии. Следует отметить заслугу С.Дж. Перта, который в 1975 году нашел убедительные слова для опровержения идеи запрета роста с увеличением плотности среды. Достаточно снять диффузионные ограничения на доставку питательных элементов, убрать токсические продукты через полупроницаемую мембрану (или не допустить их накопления) и можно достичь выхода биомассы около 10% сухого веса на объем (выше 100г/л).

Реализация режима fed-batch по определенному алгоритму позволило получить концентрацию клеток выше 100 г/л. Но достижение таких высоких значений биомассы не является экономической целью. Решающее значение высокоплотностное культивирование приобрело при культивировании рекомбинантных штаммов продуцентов интерферона, интерлейкина, факторов роста и т. д. При этом выход продукта на конечной стадии напрямую зависит от конечной концентрации биомассы.

Таким образом, разработка комплексной системы, способной контролировать процесс ферментации, а также его оптимизировать, является приоритетной. С помощью этой системы можно решать множество задач управляемого биосинтеза. Применение системы, способной контролировать и оптимизировать процесс ферментации, как в научной среде, так и на производстве позволит оптимизировать способы достижения высокого выхода необходимого продукта.

— 72. Цели и задачи работы.

Основной целью явилась разработка системы управления ростом дрожжей БассЬаготусез сегеу1з1ае в ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.

При этом были решены следующие задачи.

• Исследования многократного светорассеяния для разработки метода измерения концентрации микробных клеток.

• Разработка газоотделительного резервуара.

• Создание макетного образца анализатора концентрации микробных клеток.

• Создание ферментационной интегрированной системы.

• Адаптация системы для мониторинга дрожжей 8асс11аготусе8 сегеу1з1ае.

• Разработка системы управляемого роста дрожжей на пилотном ферментационном комплексе в режиме высокоплотностного культивирования.

• Изучение возможности внедрения системы в реальном производстве.

3. Научная новизна.

На основе проведенного анализа светорассеяния разработан метод многократного светорассеяния для расчета концентрации микробных клеток, а также разработан и применен алгоритм обработки индикатрис (угловых диаграмм рассеяния света) микробных клеток.

На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц ЛАСКА-1К разработан опытный образец лазерного анализатора, способный проводить измерения концентрации микробных клеток в реальном масштабе времени. Доказано, что выбранная конфигурация расположения датчиков в разных углах (датчики установлены под углами: 0°, 8°, 30°, 150°.) дает возможность перекрытия всей возможной области концентрации биомассы, а именно, в диапазоне от 0.01 до 100 г/л. При высоких значениях концентрации биомассы (от 2 до 100 г/л) фотодетектор, установленный под углом 150°, регистрирует величину интенсивности светорассеяния, которая монотонно возрастает с увеличением биомассы без предварительного разведения и вне зависимости от состава питательной среды.

Для интегрирования анализатора в ферментационный комплекс, был специально разработан и поставлен перед анализатором газоотделительный резервуар.

На созданном ферментационном комплексе проведены исследования закономерностей роста и развития дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Полученные результаты были использованы для разработки алгоритма процесса ферментации в режиме отъемно-доливного и высокоплотностного культивирования, основанного на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления кислорода (рСЬ) и поддержания оптимально больших значений удельной скорости роста в пределах 0,2 — 0,3 ч" 1 на основе показаний лазерного анализатора.

4.Практическая ценность.

Разработана система управляемого роста дрожжей в режиме высокоплотностного культивирования с достижением конечного выхода биомассы 80 г/л дрожжей за 16 ч культивирования (производственные показатели не превышают значения 40 г/л). В качестве обратной связи использовали показания кислородного датчика и показания биомассомера.

Проведенные исследования ферментаций дрожжей на пилотном комплексе, а также оценка производственных условий на Санкт-Петербургском Пищевом комбинате, показывают необходимость и возможность оптимизации процесса роста дрожжей при использовании разработанной системы.

Созданный ферментационный комплекс может быть использован для разработки более эффективных способов достижения высоких выходов биотехнологических продуктов и, соответственно, экономически более выгодных процессов культивирования микроорганизмов, а также для решения разнообразных задач управляемого биосинтеза.

5. Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы доложены на Конференции «Молодые ученые-85- летию академии», Санкт-Петербургская государственная Химико-Фармацевтическая академия, 2004 г. и на втором съезде биотехнологов России, Москва, 2004 г.

Основные результаты диссертационной работы представлены в 5 публикациях.

6. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах печатного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и графиками, 9 таблицами.

Список литературы

включает 153 источников, из них 134 на иностранных языках.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана система управляемого роста дрожжей БассЬаготусез сегеу151ае на пилотном ферментационном комплексе с интегрированной системой определения концентрации микробных клеток в режиме высокойлотностного культивирования.

2. Показана возможность применения метода многократного светорассеяния для определения концентрации клеток.

3. На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц разработан опытный образец лазерного анализатора, способного вести непрерывный контроль концентрации биомассы в диапазоне 0.01 — 100 г/л. с системой сбора данных и последующим выводом полученных результатов на компьютер (в состав входит специальная проточная ячейка, специальный электронно-вычислительный блок).

4. Разработан газоотделительный резервуар, позволяющий подавать освобожденную от газовой фазы суспензию клеток в измерительную ячейку анализатора.

5. Анализатор интегрирован в ферментационный комплекс, который обслуживается специальной программой, позволяющей непрерывно регистрировать и проводить расчет основных показателей биотехнологического процесса. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку, является замкнутой, что позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений.

6. Разработан алгоритм высокоплотностного культивирования, основанный на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления (рОг) и поддержании оптимально больших значений удельной скорости роста в пределах 0,2 -0,3 ч" 1, оперируя показаниями лазерного анализатора. Способ позволяет получить до 80 г/л биомассы за 16 ч культивирования. 7. Показана возможность применения отъемно-доливного способа культивирования дрожжей, выращенных при использовании разработанной системы управления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Миндукшев И. В., Аверьянов А. В., Филиппов А. Н., Левенков В. А., Галынкин В. А. Технологический мониторинг парциального давления кислорода при ферментации пекарских дрожжей. Тез. 1-ый Международный Конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития»., Москва, 1418 октября 2002 г. с 212.

2. Левенков В. А., Миндукшев И. В., Джагацпанян И. Э., Галынкин В. А., Никаноров П. С. Определения концентрации микробных клеток в on-line режиме с помощью лазерного анализатора микрочастиц ЛАСКА. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию Химико-Фармацевтической Академии, январь 2004 г.

3. Левенков В. А., Миндукшев И. В., Джагацпанян И. Э., Галынкин В. А., Никаноров П. С. Контроль концентрации микробных клеток в режиме реального времени с помощью лазерного анализатора «ЛАСКА». Материалы второго съезда общества биотехнологов России, Москва 13−15 октября 2004 г. с144.

4. Миндукшев И. В., Джагацпанян И. Э., Левенков В. А. Способ непрерывного определения концентраций микробных клеток и устройство для его осуществления. Патент RU № 2 004 122 611, МКИ: G01N 015/02.

5. Миндукшев И. В., Джагацпанян И. Э., Никаноров П. С., Левенков В. А., Галынкин В. А. ON-LINE анализатор мониторинга биомассы в ферментационных системах — «ЛАСКА-БИОТЕХ», предпосылки управляемого биосинтеза. Международная научно-практическая конференция, посвященная 85-летию Химико-Фармацевтической Академии, 2004 г. с 306−311.

включения лазера.

Панель управления.

Рис. I I. Внешний вид анализатора «ЛАСКА» (вид слева).

1. Лазерный диод (670 нм).

2. Кюветное отделение.

3. Кювета.

4. Линейка фотодиодов (малые углы рассеяния).

5. Фотодиоды (большие углы рассеяния).

6. Микропроцессорный контроллер

7. Панель управления.

Рис. 12. Структурная схема анализатора.

Источник света анализатора — лазерный диод работает в непрерывном режиме со стабилизацией интенсивности излучения. Излучение лазерного диода фокусируется на апертуру фотодиода пропускания, соответствующей линейки фотодиодов. Между фокусирующей линзой и измерительной кюветой располагается диафрагма, задающая площадь освещенной зоны в кювете с магнитной мешалкой. Привод мешалки обеспечивает вращение волчка в кювете. (Рис.12).

Индикатриса рассеяния лазерного пучка, прошедшего через измерительную кювету регистрируется линейкой фотодиодов. Линейка состоит из 32 фотодиодов.

Первый фотодиод в линейке является фотодетектором пропускания, остальные 31 фотодиодов являются фотодетекторами индикатрисы.

Фотодиоды пропускания в каждом анализаторе имеют угловую координату О градусов.

Угловые координаты фотодиодов рассеяния даны в паспорте и внесены в программное обеспечение к каждому анализатору.

После первичного аналогового преобразования блоком предусилигелей, электрические сигналы от фотодиодов поступают на плату АЦП и микроконтроллер и далее на выходной разъем и на блок индикации. Прибор подключается к компьютеру посредством, находящегося в комплекте поставки, кабеля. Прибор подключается к одному из разъемов последовательного интерфейса типа RS-232C (COMI, СОМ2, СОМЗ или СОМ4). Этот разъем обычно расположен на задней стенке компьютера.

Ниже представлен пример записи динамики изменения интенсивности светорассеяния в разных углах регистрации при добавлении сухого порошка в кювету с включенной мешалкой Рис. 13.

27 23,12й Л.

ЧР ПЛ^КА 32 (прибор НЕ, но свя.!м| (Окно крмвьм намерений № 4 1JJ.

НПО.

Координаты маркеров fWK4H | nu шпсА КДОЬМ.

Мцкер№ 1 x-7*ai 1JКривая! Y=84.19.

Y*6G.47.

J? SfMBIflJ.

Y 96 Y-tt.56 V.16.65.

IttHMat y-iaw 7.

Y-15.36 в] Koueas 6.

Y-9.627.

Э1КЦНЫЯЭ V-7.4S9.

УАЗМ HIKpHmtlI.

Y-S.2M 12) K|№w 12.

Y-3.129 13(Крмиа13.

3.522 ШКоння 14 YJ.Offi.

Ц1У—J ff Файл Bvn Pecv Иэг-ирения и *>¦: Текст Окна Пймсщ*.

— Iffl «1.

Рис. 13. Динамика изменения интенсивности светорассеяния в разных углах. и пример представления гранулометрического анализа образца, реализованного в программном модуле анализатора. Рис. 14.

I частиц по диаметрам.

Исходные константы и параметры исполин""" олгчжов ¦

11 .1 Ъ5 Л5, Б, 6 5,7.75,8,а 5.5.8.5.

Ко&ФЧМШЧНГ рйС*Г4 НтйАМЛ ДОЛврСШ К^ «10 / Кодпестгошг-ипопоиодАнамггрй гп&хр *.

0. г [1 о.

I Инамлтрис* |.

Результаты расчета.

Лйшгчаспш.

Щ 0.405 1.433.

7025 сил 001ВЗ 1.7Д.

65ЙЭ Н№ <19 776 1 765.

Свеян*** йиаметр иктт ым Б 633.

4 250- 0 г -5.5" — Озд .6 50С, О^ -7. ИВЙ^-вШ.

БКО- 174.0.

Отчят.

Рис. 14. Пример гранулометрического анализа.

Прибор комплектуется оптическим образцом работоспособности (ОПР). ОПР используется при калибровке прибора, процедура которой предполагает размещение ОПР в кюветном отделении вместо кюветы. ОПР представлен специальным светорассеивающим стеклом (изготовленной по технологии производителя), закрепленным на платформе. Платформа по основанию совпадает с основанием кюветы. Индикатриса рассеяния этого стекла приводится в паспорте прибора, где указывается серийный номер ОПР и данные индикатрисы в области углов конфигурации анализатора.

Рис. 15. Образец для проверки работоспособности прибора (ОПР).

Перед первым началом работы с анализатором, требуется провести калибровку анализатора.

Для калибровки используется оптический образец для проверки работоспособности прибора (ОПР). (РисЛ5).

После проведения калибровки, в канале 0 град, должны быть значения 100 (допустимо отклонение в 10%), В остальных каналах должны быть значения близкие к нулю. Микропроцессор сохраняет последние калибровочные данные и после выключения анализатора. В течение последующих 2−3 часов работы на анализаторе повторная калибровка не требуется.

Процедуру калибровки следует проводить в случае, если показания в канале 0 град, отклоняются более чем на 10% (т.е. <90 или >110), или показания в остальных каналах превышают более 3 единиц.

Глава 3. РАЗРАБОТКА ЛАЗЕРНОГО АНАЛИЗАТОРА МОНИТОРИНГА КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК И ЕГО ИНТЕГРАЦИЯ В КОМПЛЕКСНУЮ ФЕРМЕНТАЦИОННУЮ СИСТЕМУ «ЛАСКА-БИОТЕХ».

На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц ЛАСКА-1К разработан опытный образец лазерного анализатора способного вести непрерывный контроль концентрации биомассы с системой сбора данных и последующим выводом полученных результатов на компьютер. Для контроля процесса выращивания и биосинтеза клеток необходимо определение их количества, т. е. плотности биомассы. Традиционно используется весовой метод. Это метод периодического разрушающего контроля. Для автоматизированного управления ферментацией необходима непрерывная регистрация биомассы в реальном масштабе времени неразрушающим способом.

3.1 Разработка газоотделительного резервуара.

В составе анализатора применяется специально разработанная проточная измерительная ячейка (Рис.16). Проточная измерительная ячейка помещается в соответствующее кюветное отделение.

Вследствие того, что поступающая в проточную измерительную ячейку клеточная суспензия, отбираемая из биореактора, должна быть отделена от содержащихся в ней пузырей, газовой фазы, был разработан газоотделительный резервуар, который впоследствии был интегрирован в анализатор.

Рис. 17. Схема системы с газоотделительным резервуаром.

Сущность работы системы отделения газовой фазы поясняется на рис. 17. Клеточная суспензия отбирается из биореактора I и по трубке 2 поступает в газоотделительный конусообразный резервуар 3. В резервуаре установлены датчики уровня: датчик нижнего уровня 4а и датчик верхнего уровня 46. Сигналы с датчиков поступают на электронный контролер уровня.

5. Электронный контроллер автоматически устанавливает скорость прокачки насоса 6 так, чтобы уровень заполнения резервуара находился между нижним и верхним датчиками уровня. В газоотделительном резервуаре пузыри газа поднимаются вверх, отделяются от жидкости и далее отводятся с воздушным потоком, минуя проточную ячейку. Суспензионная жидкость, из которой удалены пузыри газовой фазы, поступает в проточную измерительную ячейку 7. После прохождения ячейки, поток суспензии соединяется с газовым потоком и возвращается в биореактор. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку является замкнутой. Это позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений, что особенно важно при проведении ферментаций.

Проведенные опыты по выращиванию дрожжей показали хорошие результаты, клеточная суспензия поступала в измерительную ячейку полностью освобожденной от газовой фазы.

3.2 Исследование системы расположения датчиков в приборе.

Анализатор «ЛАСКА» предназначен для непрерывного контроля концентрации биомассы в биореакторе. Этот параметр является ключевым в контроле, регулировании и оптимизации микробиологических процессов.

Принцип действия анализатора «ЛАСКА» основывается на непрерывном измерении светорассеяния в широком диапазоне углов. Метод светорассеяния уже применялся для регистрации плотности биомассы, но не носил универсального характера, так как регистрация интенсивности светорассеяния основывалась на использовании одного выбранного угла и поэтому имела ограниченный диапазон в концентрации биомассы. Проведенные нами исследования с пекарскими дрожжами БассИаготусез сегеу1з1ае показали, что в зависимости от угла регистрации интенсивность светорассеяния пропорциональна плотности биомассы в разном диапазоне значений. Для малых углов регистрации до 10 градусов (фотодатчик I и 2) наблюдается нелинейный характер зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации биомассы в диапазоне концентрации биомассы от 0.01 г/л до 0.2 г/л. При более высоких значениях плотности биомассы, возникает эффект многократного светорассеяния, и значения интенсивности светорассеяния в малых углах уменьшается. Наоборот, в дальних углах интенсивность светорассеяния значимо увеличивается при повышении плотности культуры. При выбранной конфигурации расположения датчиков в разных углах возможно перекрытие всей области возможной концентрации биомассы (датчики установлены под углами: 30°, 150°.) (Рис. 18). фотодетекторы 30 0 8° j.

15 0° к, * ч N Ч’М Ы 1 лазер Ч :/ ^? J 0° проточная измерительная ячейка.

Рис. 18. Расположение датчиков в приборе.

Метод непрерывного анализа концентрации микробных клеток в суспензиях, включающий подачу суспензии через проточную измерительную кювету, одновременное освещение измерительной кюветы лазерным лучом и непрерывное фотометрирование пространственного распределения интенсивности рассеянного света в дальнем поле. Отличается следующими особенностями:

• суспензия микробных клеток перед подачей в измерительную кювету в процессе калибровки и измерения предварительно пропускается через газоотделительный резервуар;

• калибровка осуществляется по данным фотометрирования измерительной кюветы с различным содержанием клеток данного вида и заключается в определении рабочих диапазонов измерительных каналов и аппромаксионному расчету уравнений зависимости показаний измерительных каналов от концентрации клеток;

• анализ концентрации микробных клеток осуществляется по данным фотометрирования измерительной кюветы с пробой и заключается в расчете концентрации клеток на основании калибровочных уравнений и рабочих диапазонов измерительных каналов.

3.3 Градуировка анализатора.

Для определения концентрации микробных клеток необходимо провести градуировку анализатора.

Предварительно производятся измерения с использованием суспензии микробных клеток определенного вида с известной концентрацией. После этого при работе с неизвестной пробой (содержащей клетки того же вида, по которому проводилась калибровка), можно рассчитать их концентрацию.

Реализация предлагаемого метода продемонстрирована при мониторинге дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В случае применения устройства для определения концентрации других видов микробных клеток, представленные калибровки некорректны, в силу того, что средний размер клеток будет иной. В этом случае для каждого вида клеток проводится своя калибровка, которая далее хранится в памяти электронно-вычислительной системы и, соответственно, выбирается при работе с этим видом клеток.

На рис. 19,20 представлены данные по экспериментальной проверке способа. В ферментере создавались модельные среды с известным содержанием дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Фотодетекторы были установлены под углами 0, 8, 30 и 150 градусов. В начале были измерены фоновые показания фотодетекторов на среде без клеток. Фоновые значения в дальнейшем вычитались из показаний фотодетекторов. Затем в ферментере создавались различные концентрации клеток и снимались показания.

Как показано на рис. 19,20 всю область значений биомассы можно условно разбить на 3 диапазона: 0 ^ 0.5 г/л, 0.5-^-2 г/л, 2 100 г/л.

При увеличении биомассы в первом диапазоне показания 0° уменьшаются, а 8, 30 и 150° увеличиваются.

При увеличении биомассы во втором диапазоне показания 0° близки к нулю, показания 8°уменьшаются, 30 и 150° увеличиваются.

При увеличении биомассы в третьем диапазоне показания 0° близки к нулю, показания 8° уменьшаются и достигают нуля, показания 30° уменьшаются, а 150° увеличиваются.

Таким образом, для каждого диапазона концентрации клеток существует фотодетектор, показания которого монотонно возрастают с увеличением биомассы. Следовательно, проведя предварительную калибровку измерительной системы на определенный вид клеток и сняв показания фотодетекторов на неизвестной пробе (но с клетками того же вида, по которому проводилась калибровка), можно рассчитать количество клеток. Для этого необходимо осуществить следующее:

Определение рабочих диапазонов измерительных каналов.

В измерительную кювету последовательно подают суспензии с известной концентрацией клеток в диапазоне от 0 до 100 г/л и регистрируют показания фотодетекторов где 3 — номер фотодетектора, I — показания^го фотодетектора. Из показаний вычитают фон (10|) — показания фотодетекторов на дисперсионной среде без клеток. Определяют максимумы показаний по каждому фотодетектору (^тах) и находят соответствующие им значения концентрации (С^тах). Определяют границы рабочих диапазонов АСе [0.9х Снтах — 0.9х С-тах .

Первое значение С устанавливают равным начальной концентрации клеток при калибровкеПоследнее значение С (шах]) устанавливают равным 0.9Стах. Таблица 3.

Угол шах ч АСфотодетектора регистрации, град.

1 8 0.5 0.01−0.45.

2 30 2 0.45−1.8.

3 150 >100 1.8−90.

Аппромаксионный расчет уравнений зависимости показаний измерительных каналов от концентрации клеток. Для всех найденных по п. 1., находят аппроксимирующее уравнение = ОД) для своего диапазона АСу (См. Таблицу 4).