Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов

Диссертация: Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Автор выражает глубочайшую благодарность И. Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за обучение практическим навыкам, неоценимую помощь в обсуждении, постановке и проведении эксперимента и огромную моральную поддержку в ходе выполнения и оформления данной работы. Автор особенно благодарен Е. С. Оксенойт, осуществившей синтез исходных пептидов. Автор приносит искреннюю благодарность Г. И. Лавреновой, Г… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ
    • 1. 1. Общая характеристика субтилизинов
      • 1. 1. 1. Строение молекулы субтилизинов
      • 1. 1. 2. Активный центр и механизм катализа
      • 1. 1. 3. Зона связывания субстрата и специфичность
    • 1. 2. Модификация субтилизинов
      • 1. 2. 1. Модификация активного центра
        • 1. 2. 1. 1. Тиолсубтшизин и субтшигаза
        • 1. 2. 1. 2. Свленосубт ил из ии
        • 1. 2. 1. 3. Ангидросубтилизин
        • 1. 2. 1. 4. Модификация остатков А$р32, Н1з64, Абп
      • 1. 2. 2. Замены аминокислотных остатков вблизи активного центра и в зоне связывания субстратов
      • 1. 2. 3. Мутации в участках связывания ионов Са2+
      • 1. 2. 4. Модификации в областях, удаленных от активного центра

Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Биокаталитический способ образования пептидной связи в последнее время рассматривается как перспективный метод для масштабирования и упрощения синтеза коротких пептидов, в том числе биологически активных соединений и лекарственных препаратов. Использование ферментов позволяет проводить пептидный синтез в мягких условиях, без защиты боковых функциональных групп реагентов и опасности рацемизации, исключает применение экологически вредных конденсирующих агентов. Преимущества ферментативного подхода могут быть использованы в синтезе протяженных пептидов при конденсации отдельных сегментов. Разработка новых подходов для проведения ферментативной фрагментной конденсации пептидов, а также расширение круга ферментов, адаптированных к условиям проведения таких реакций, является весьма актуальной проблемой.

Целью данной работы являлось изучение ферментативного метода синтеза пептидов с использованием в качестве катализаторов модифицированных субтилизинов — тиолсубтилизина и Б Б 8 — субтилизина. Задачи исследования включали:

1) получение и разработку метода очистки тиолсубтилизина;

2) изучение функциональных свойств тиолсубтилизина в условиях синтеза различных пептидов;

3) исследование нового подхода к фрагментной конденсации пептидов под действием БВБ-субтилизина на основе сочетания преимуществ ферментативного синтеза пептидов с идеологией твердофазного химического синтеза.

выводы.

1.Установлено, что модифицированные субтилизины тиолсубтилизин и 8 Ш — субтилизин — могут служить эффективными биокатализаторами реакций фрагментной конденсации пептидов.

2. Разработан новый эффективный метод выделения тиолсубтилизина с применением аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе и с использованием в качестве хромогенного субстрата С1р-А1а-А1аЬеи-рИА. Показано, что каталитические константы гидролиза этого субстрата субтилизином и тиолсубтилизином отличаются на четыре порядка, что свидетельствует о низкой амидазной активности тиолсубтилизина.

3.С помощью тиолсубтилизина осуществлено получение серии пептидов и пептидамидов различного строения (от дидо гептапептидов). Показана возможность использования в качестве аминокомпонентов при катализе тиолсубтилизином пептидов со свободной карбоксильной группой.

4.Впервые показана принципиальная возможность проведения сегментной конденсации пептидов на твердом носителе — аминосилохроме с применением в качестве катализатора ЗОБ-субтилизина. Изучена зависимость выхода катализируемой БОЗ-субтилизином реакции на твердом носителе от таких факторов, как длина спейсера, нагрузка спейсера на носителе, концентрация фермента и время реакции.

5.В разработанных условиях впервые проведены успешные двухи трех-стадийные ферментативные конденсации пептидных фрагментов на твердом носителе, обеспечивающие получение с удовлетворительными выходами гексаи нонапептидов.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор чрезвычайно признателен безвременно ушедшему от нас руководителю работы В. М. Степанову за его постоянный интерес к проводимым исследованиям, внимательное, плодотворное и критическое обсуждение полученных результатов и планирования эксперимента.

Автор выражает глубочайшую благодарность И. Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за обучение практическим навыкам, неоценимую помощь в обсуждении, постановке и проведении эксперимента и огромную моральную поддержку в ходе выполнения и оформления данной работы. Автор особенно благодарен Е. С. Оксенойт, осуществившей синтез исходных пептидов. Автор приносит искреннюю благодарность Г. И. Лавреновой, Г. Н. Баландиной и Г. Н. Руденской за полезные дискуссии и ценные практические советы. Автор благодарен A.B. Бачевой и И. В. Гетун за помощь в проведении экспериментов и оформлении данной работы. Большую помощь при исследовании полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л. А. Баратова, М. Б. Вирясов и А. Л. Ксенофонтов.

1.3.

Заключение

.

Из литературных данных следует, что субтилизины — довольно доступные ферменты с достаточно широкой специфичностью. Они являются удобными объектами для различных модификаций химическими способами и с помощью методов белковой инженерии. Модификация субтилизинов позволяет исследовать структуру и функциональные особенности этих белков, создавать ферменты с новыми свойствами. Различные замены аминокислотных остатков в субтилизинах приводят к изменению таких свойств, как активность, специфичность, термостабильность, устойчивость в органических растворителях. Модифицированные ферменты находят широкое практическое применение. Несмотря на то, что ферментативный синтез пептидов интенсивно развивается в наши дни и имеет ряд преимуществ по сравнению с химическим, все же существуют некоторые причины, ограничивающие область использования этого метода. Например, при синтезе протяженных пептидов для улучшения растворимости исходных компонентов требуются высокие концентрации органических растворителей, а ферменты, как правило, неустойчивы в таких системах. При проведении ферментативного пептидного синтеза в водно-органической среде возникает проблема, связанная со вторичным гидролизом продуктов реакции. Довольно часто целенаправленное получение необходимого соединения требует определенной специфичности фермента в том или ином положении. Таким образом, создание модифицированных субтилизинов позволяет снять эти ограничения и открывает новые возможности для их использования в пептидном синтезе в качестве катализаторов.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Сериновые протеиназы, в частности субтилизин, доступны, стабильны, обладают достаточно широкой специфичностью и поэтому могут успешно использоваться при биокаталитическом способе образования пептидной связи. Синтез пептидной связи в присутствии сериновых протеиназ представляет собой многостадийный процесс, протекающий через стадию образования ацил-фермента, в котором субстрат ковалентно связан с ферментом через остаток серина активного центра протеиназы. В общих чертах процесс образования пептидной связи можно представить с помощью следующей схемы [121]: ясо-мня + Е-ОН.

ЯСО-Х + Е-ОН где Е-ОН — фермент.

Ацил-фермент, образующийся по одному из трех путей (1), (-2), (-3), подвергается нуклеофильной атаке водой (реакция 3) или аминокомпонентом КН2Я (реакция 2). В первом случае происходит гидролиз ацил-фермента и образование компонента со свободной карбоксильной группой ЯСО-ОН, во втором — аминолиз ацил-фермента и образование пептидной связи продукта ЯСО-ТЧНЯ'. Если ацилирующий компонент ЯСО-Х содержит свободную карбоксильную группу, то образование пептидной связи представляет собой термодинамически контролируемый процесс. Сдвиг равновесия в сторону синтеза достигается.

КН2Я (2).

— мн2я (-2).

— 1).

ЯСО-О-Е + Х-Н.

— Н20 (3) н20 (-3).

ЯСО-ОН + Е-ОН или выведением продукта из сферы реакции или присутствием избытка исходных реагентов. Если в реакции используется соединение с активированной карбоксильной группой, например, эфир 1Ч-защшценной аминокислоты или пептида, то процесс является кинетически контролируемым, и выход продукта в оптимальное время определяется количеством и нуклеофильностью аминокомпонента.

Недавно было показано, что субтилизины способны катализировать реакции синтеза необычных соединений. Так, Вонг с сотрудниками осуществили с помощью субтилизина ВР№ синтез пептидов, содержащих некодируемые аминокислоты [39]. В работе [122] описан катализируемый субтилизином 72 синтез пептидоспиртов и пептидоальдегидов. Таким образом, субтилизины являются крайне перспективными для синтеза различных биологически активных соединений и ингибиторов. Весьма интересным представляется применение сериновых протеиназ для блочной конденсации пептидов, в том числе с использованием твердого носителя для закрепления растущей пептидной цепи. Такой вариант позволил бы сочетать неоспоримые преимущества твердофазного метода синтеза и ферментативного способа конденсации. Однако серьезным осложнением, существенно снижающим эффективность синтеза и ограничивающим применение протеиназ в пептидном синтезе, является вторичный гидролиз продуктов реакции (путь (-2) в вышеописанной схеме). Одним из путей решения этой проблемы может быть использование для катализа образования пептидной связи модифицированных ферментов, либо обладающих пониженной амидазной активностью, либо способных функционировать в средах, где сведена к минимуму вероятность вторичного гидролиза продуктов реакции. Модификация биокатализаторов придает им новые свойства и тем самым способствует расширению возможностей ферментативного пептидного синтеза.

Целью настоящей работы являлся синтез пептидов посредством сегментной конденсации, катализируемой производными субтилизина 72 -тиолсубтилизином и ЗОБ-субтилизином. Работа состоит из двух частей:

1) получение и изучение свойств тиолсубтилизина как катализатора образования пептидной связи;

2) изучение возможности блочной конденсации пептидов на твердом носителе под действием SDS-субтилизина.

II. 1.1. Получение и свойства тиолсубтилизина.

Как указывалось в литературном обзоре, тиолсубтилизин представляет собой производное субтилизина, в активном центре которого остаток Ser-221 заменен на Cys. Этот фермент проявляет крайне низкую амидазную активность — при катализе тиолсубтилизином скорость аминолиза эфиров более чем в 1000 раз превышает скорость гидролиза пептидной связи [66]. Несмотря на то, что тиолсубтилизин уже давно описан в литературе, он до настоящего времени редко использовался в качестве катализатора синтеза пептидов ввиду трудоемкости выделения и малой изученности ферментативных свойств. Поэтому перед нами встала задача получить тиолсубтилизин и изучить его функциональные свойства в условиях синтеза различных пептидов.

Тиолсубтилизин был получен из субтилизина 72 методом химического модифицирования. Этот метод использовался в работах Полгара с сотрудниками [48] и Нита с сотрудниками [49] для модификации субтилизинов Карлсберг и Novo. Превращение проходило в три стадии: c6h5ch2so2f.

— Е-0S02CH2C6H5 (I).

Е-ОН.

— HF.

Е-0S02CH О.

Е-SCCH3 н2о.

Е-SH.

— СН, СО 5.

Ш) 2.

Субтилизин обрабатывали фенилметансульфонилфторидом. Полученный неактивный фенилметансульфонилфермент (I) реагировал с тиолацетатом калия, в результате чего образовывался ацетилтиолсубтилизин (II). Далее проходил спонтанный гидролиз ацетилтиолсубтилизина с последующим образованием тиолсубтилизина (III). Однако самопроизвольный гидролиз фенилметансульфонилсубтилизина приводил к частичной регенерации субтилизина, поэтому в реакционной смеси наряду с тиолсубтилизином присутствовал и субтилизин — фермент, который гораздо эффективнее гидролизует пептидные связи. Даже небольшая его примесь обесценивала препарат, что требовало дополнительной очистки тиолсубтилизина от немодифицированного фермента. В работе Полгара [53] описано хроматографическое разделение субтилизина и тиолсубтилизина на меркурфенилагарозе (см. лит. обзор). Однако данный способ очистки многостадиен и трудоемок, что приводит к потерям тиолсубтилизина и создает угрозу его инактивации.

Мы нашли более удобный метод разделения субтилизина и тиолсубтилизина — аффинную хроматографию на бацитрацин-сефарозе [123]. Бацитрацин — полипептид циклического строения — является ингибитором некоторых протеиназ. Входящие в его состав остатки гидрофобных аминокислот играют существенную роль в образовании комплексов с ферментами. Структура бацитрацина, А представлена на рис. 11. Бацитрацин-сефароза была впервые получена в нашей лаборатории и успешно использовалась для разделения протеиназ, в том числе и для очистки субтилизина [125, 126].

СНз /Б-СНг.

У СН СН I I-СН-СО-Ь-Ьеи С2Н5 Мн2 |.

Ь-Б^з —Б-Аяр —Ь-Авп Б-Ии.

Б-Р Ье.

Ы1е-*— Б-Огп-«— Ь-Ьув-«— Ь-11е.

Рис. 11. Структура главного компонента бацитрацина — бацитрацина, А [124].

Выделение тиолсубтилизина осуществляли в две стадии [123]. После проведения химической модификации реакционную смесь обессоливали на колонке с сефадексом G-25. Профиль элюции представлен на рис. 12. После гель-фильтрации на сефадексе G-25 было получено тиолпроизводное субтилизина, содержащее некоторое количество нативного фермента. Известно, что тиолсубтилизин практически не гидролизует азоказеин, тогда как немодифицированный субтилизин расщепляет данный субстрат [55]. Этот факт использовался нами для оценки чистоты тиолсубтилизина. Наличие активности по гидролизу азоказеина во фракциях, собранных после гель-фильтрации на сефадексе G-25 при выделении тиолсубтилизина, указывало на присутствие некоторого количества субтилизина в полученном тиол-ферменте (Рис. 12, Табл. 10). Очистку тиолсубтилизина от примеси немодифицированного субтилизина прводили на колонке с бацитрацин-сефарозой (Рис. 13). В условиях, когда субтилизин практически полностью связывался с бацитрацин-сефарозой, тиолсубтилизин проходил через колонку (фракция А). Сорбировавшийся субтилизин элюировали 25%-ным изопропиловым спиртом (фракция Б). Содержание активного субтилизина в этой фракции подтверждалось определением активности по Glp-Ala-Ala-Leu-pNA, я-нитрофенилацетату и гидролизу азоказеина. В то же время белок фракции, А — тиолсубтилизин — не обнаруживал активности по гидролизу азоказеина, но расщеплял Glp-Ala-Ala-Leu-pNA и п-нитрофенилацетат (Табл. 10). Таким образом, хроматография на бацитрацин-сефарозе позволила легко освободить тиолсубтилизин от примеси субтилизина.

Различие в связывании тиолсубтилизина и субтилизина с бацитрацин-сефарозой, возможно, объясняется тем, что замена остатка Ser на Cys в активном центре изменяет строение субстратсвязывающего участка фермента, что способствует ослаблению взаимодействий с бацитрацином.

А 280 Активпость,%.

Рис. 12. Гель-фильтрация реакционной смеси после химической модификации субтилизина. Колонка (объем 80 мл) с сефадексом С-25 уравновешена 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 1 мМ ЭДТА, 0,07 М КС1, 3 мМ ДТТ. 1 — поглощение при 280 нм, 2 — активность по гидролизу С1р-А1а-А1а-Ьеи-рКА, 3 — активность по гидролизу азоказеина.

А28у Активность,%.

Рис. 13. Разделение субтилизина и тиолсубтилизина на бацитрацин-сефарозе. Колонка (объем 4 мл) уравновешена 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 1 мМ ЭДТА, 0,07 М КС1, 3 мМ ДТТ. Элюцию проводили 1 М КС1 (стрелка I) и 25%-ным изопропиловым спиртом с 1 М КС1 в фосфатном буфере, рН 7,0 (стрелка II). А — фракция тиолсубтилизинаБ — фракция субтилизина. 1 — поглощение при 280 нм, 2 -активность по гидролизу 01р-А1а-А1а-Ьеи-рКА, 3 — активность по гидролизу азоказеина.

Показать весь текст

Список литературы

  1. В.М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. Спирина А. С. Москва. Высшая школа. 1996. С.220−233.
  2. Г. Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорган, химия. 1994. Т.20. No 5. С.475−484
  3. Siezen R.J., Vos W.M., Leunissen J.A.M., Dijkstra B.W. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteases. // Protein Eng. 1991. V.4. P.719−737.
  4. Siezen R.J., Leunissen J.A.M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Science. 1997. V.6. P.501−523.
  5. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. // Microbol. Molecul. Biol. Rev. 1998. V.62. P.597−635.
  6. В.В. Протеолитические ферменты. // Москва. Наука. 1971.
  7. Т.Н., Ревина Л. П., Грязнова Ю. Б., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С., Филиппова И. Ю., Степанов В. М., Иванова И. И. Сериновая протеиназа архебактерий Halobacterium mediterranei аналог субтилизина эубактерий. // Биохимия. 1992. Т.57. С. 1230−1241.
  8. В.Х., Белянова Л. П., Баратова Л. А., Степанов В. М. Субтилизин 72 сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т.44. No 5. С.886−891.
  9. Bode W., Papamokos Е., Musil J. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and eglin c, an elastase inhibitor from the leech Hirudo medicinalis. // Eur. J. Biochem. 1987. V.166. P.673−692.
  10. McPhalen C.A., James M.N.G. Structural comparison of tow serin proteinase-protein inhibitor complexes: eglin-c-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo. // Biochemistry. 1988. V.27. P.6582−6598.
  11. Gilliland G.L., Howard A.J., Winbornes E.L., Poulos T.L., Stewart D.B., Durham D.R. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of subtilisin GX from Bacillus sp. GX6644. // J. Biol. Chem. 1987. V.262. No 9. P.4280−4283.
  12. Betzel C., Klupsch S., Papendorf G., Hastrap S., Branner S., Wilson K. S. Crystal structure of the alkaline proteinase Savinase™ from Bacillus lentus at 1.4 A resolution. // J. Mol. Biol. 1992. V.223. P.427−445.
  13. Goddette D.W., Paech C., Yang S.S., Mielenz J.R., Bystroff C., Wilke M.E., Fletterick R.J. The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, subtilisin BL, at 1.4 A resolution. // J. Mol. Biol. 1992. V.228. P.580−595.
  14. Chu N.M., Chao Y., Bi R.C. The 2 A crystal structure of subtilisin E with PMSF inhibitor. // Protein Eng. 1995. V.8. No 3. P.211−215.
  15. Kuhn P., Knapp M., Soltis S.M., Ganshaw G., Thoene M., Bott R. The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. // Biochemistry. 1998. V.37. P. 13 446−13 452.
  16. Jain S.C., Shinde U., Li Yu., Inouye M., Berman H.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. //J. Mol. Biol. 1998. V.284. P.137−144.
  17. Betzel C., Pal G.P., Saenger W. Three-dimensional structure of proteinase K at 0.15 nm resolution. // Eur. J. Biochem. 1988. V.178. P.155−171.
  18. W.W. 15N NMR Spectroscopy of hydrogen-bonding interection in the active site of serine proteases: evidence for a moving histidine mechanism. // Biochemistry. 1986. V.25. P.7751−7759.
  19. Bryan P., Pantoliano M.W., Quill S.G., Hsiao H.-Yu, Poulos T. Site-directed mutagenesis and the role of the oxyanion hole in subtilisin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83. P.3743−3745.
  20. Carter P., Wells J.A. Dissecting the catalytic triad of a serine protease. // Nature. 1988. V.332. P.564−568.
  21. Jordan F., Polgar L., Tous G. Proton magnetic resonance studies of the states of ionization of histidines in native and modified subtilisins. // Biochemistry. 1985. V.24. P.7711−7717.
  22. Kossiakoff A.A., Spencer S.A. Direct determination of the protonation states of aspartic acid-102 and histidine-57 in the tetrahedral intermediate of the serine proteases: neutron structure of trypsin. // Biochemistry. 1981. V.20. P.6462−6474.
  23. Russell A.J., Thomas P.G., Fersht A.R. Electrostatic effects on modification of charged groups in the active site cleft of subtilisin by protein engineering. //J. Mol. Biol. 1987. V.193. P.803−813.
  24. Carter P., Wells J.A. Engineering substrate specificity by substrate assisted catalysis. // Science. 1987. V.237. P.394−399.
  25. Frey P.A., Whitt S.A., Tobin J.B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. // Science. 1994. V.264. P. 1927−1930.
  26. Halkides C.J., Wu Y.Q., Murray C.J. A low-barrier hydrogen bond in subtilisin: 1H and 15N NMR studies with peptidyl trifluoromethyl ketones. // Biochemistry. 1996. Y.35. P.15 941−15 948.
  27. Ash E.L., Sudmeier J.L., De Fabo E.C., Bachovchin W.W. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases? Theory versus experiment. // Science. 1997. V.278. P. l 128−1132.
  28. Uoet D., Uoet J.G. Biochemistry. // New York. J. Wiley & Sons, Inc. 1995.
  29. Dobson G., Wlodawer A. Catalitic triads and their relatives. // Trends Biochem. Sci. 1998. Y.23. P.347−352.
  30. Moult J. Electrondensity calculations as an extension of protein structure refinement. Streptomyces griseus protease A at 1.5 A resolution. // J. Mol. Biol. 1985. V.182. P.555−556.
  31. Shaw W.V. Protein engineering. // Biochem. J. 1987. V.246. P. l-17.
  32. Pugniere M., San Juan C., Previero A. Specific esterase activity of subtilisin toward esters of a-haloacids. // Tetrahedron Lett. 1990. V.31. No 34. P.4883−4886.
  33. Gron H., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching. // Biochemistry. 1992. V.31. P.6011−6018.
  34. Shechter J., Berger A. Size of the active site in proteinases. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V.27. No 2. P.157−162.
  35. Fastrez J., Fersht A.R. Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin. // Biochemistry. 1973. V.12. P.2025−2034.
  36. Moree W.J., Sears P., Kawashiro K., Witte K., Wong C.-H. Exploitation of subtilisin BPN' as catalyst for the synthesis of peptides containing noncoded amino acids, peptide mimetics and peptide conjugates. //J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.3942−3947.
  37. Zaks A., Klibanov A.M. Substrate specificity of enzymes in organic solvents vs water is reverssed. // J. Am. Chem. Soc. 1986. V.108. P.2767−2768.
  38. М.Ю., Морозова И. П., Воюшина Т. Л., Тимохина E.A., Степанов В. М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.230−239.
  39. Morichara K. Comparative specificity of microbial proteinases. // Adv. Enzymol. 1974. V.41. P. 179−243.
  40. Morichara K., Tsuzuki M., Oka T. Comparison of various types of subtilisins: size and properties of the active site. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V.42. No 6. P. 1000−1006.
  41. Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. // Annu. Rev. Bichem. 1977. V.46. P.331−358.
  42. Wells J.M., Ferrari E., Henner D.J., Estell D.A., Chen E.Y. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis. 11 Nucleic Acids Res. 1983. V.ll. P.7911−7925.
  43. Polgar L., Bender M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. //J. Am. Chem. Soc. 1966. V.88. P.3153−3154.
  44. Neet K., Koshland D. The convertion of serine at the active site of subtilisin to cystein: a «chemical mutation». // Proc. Nat. Acad. Sci. 1966. V.56. P.1606−1611.
  45. Photaki I., Bardacos V. Transformation of L-serine peptides to L-cysteine peptides. // J. Amer. Chem. Soc. 1965. V.87. P.3489−3492.
  46. Polgar L., Bender M.L. The reactivity of thiol-subtilisin, an enzyme containing a syntetic functional group. // Biochemistry. 1967. V.6. P.610−620.
  47. Polgar L., Bender M.L. Chromatography and activity of thiol-subtilisin. // Biochemistry. 1969. V.8. P.136−141.
  48. Polgar L. Modified preparation of thiolsubtilisin and their purification on agarose-mercurial column. // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1976. V.ll. P.81−86.
  49. Polgar L., Sajgo M. Peptic peptide of thiolsubtilisin. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 667. P. 351−354.
  50. Neet K.E., Nanci A., Koshland D.E. Properties of thiol-subtilisin. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 6392−6401.
  51. Philipp M., Tsai I.H., Bender M.L. Comparison of the kinetic specificity of subtilisin and thiolsubtilisin toward p-nitrophenyl esters. // Biochemistry. V.18. P.3769−3773.
  52. Tsai I.-H., Bender M.L. Conformation of the active site of thiolsubtilisin: reaction with specific chloromethyl ketones and arylacryloylimidazoles. // Biochemistry. 1979. V.18. P.3764−3768.
  53. Brocklehurst K., Malthouse J.P.G. Evidence that the lack of high catalytic activity of thiolsubtilisin towards specific substrates may be due to an inappropriately located proton-distribution system. // J. Biochem. 1981. V.193. P.819−823.
  54. Polgar L. Common feature of the four types of the protease mechanisms. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1990. V.371. P.327−331.
  55. Philipp M., Bender M.L. Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin // Mol. Cell. Biochem. 1983. V.51. P.5−32.
  56. Halasz P., Polgar L. Use of methyl iodide for probing the polarity of the immediate environment of -SH groups in thiolenzymes. Reaction of methyl iodide with thiolsubtilisin. // Eur. J. Biochem. 1976. V.71. P.563−569.
  57. Halasz P., Polgar L. Negatively charged reactants as probes in the study of the essential mercaptide-imidazolium ion-pair of thiolenzymes. // Eur. J. Biochem. 1977. V.79. P.491−494.
  58. Nakatsuka T., Sasaki T., Kaiser E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiolsubtilisin // J. Am. Chem. Soc. 1987. V.109. P.3808−3810.
  59. Chang T.K., Jackson D.Y., Burnier J.P., Wells J.A. Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. No 26. P. 12 544−12 548.
  60. Braisted A.C., Judice J.K., Wells J.A. Synthesis of proteins by subtiligase. // Methods Enzymol. 1997. Y.289. P.298−313.
  61. Welker E., Sheraga H.A. Use of benzyl mercaptan for direct preparation of long polypeptide benzylthio esters as substrates of subtiligase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V.254. No 1. P. 147−151.
  62. Jacson D.Y., Burnier J., Wells J.A. Enzymatic cyclization of linear peptide ester using subtiligase. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.117. P. 189−820.
  63. Wu Z.-P., Hilvert D. Conversion of a protease into an acyl transferase: selenolsubtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V.lll. No 12. P.4513−4514.
  64. Wu Z.-P., Hilvert D. Selenosubtilisin as a glutathione peroxidase mimic. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V.112. No 14. P.5647−5648.
  65. Bell I.M., Fisher M.L., Wu Z.-P., Hilvert D. Kinetic studies on the peroxidase activity of selenosubtilisin. // Biochemistry. 1993. V.32. P.3754−3762.
  66. Bell I.M., Hilvert D. Peroxide dependence of the semisynthetic enzyme selenosubtilisin. // Biochemistry. 1993. V.32. P. 13 969−13 973.
  67. Peterson E.B., Hilvert D. Nonessential active site residues modulate selenosubtilisin’s kinetic mechanism. // Biochemistry. 1995. V.34. No 20. P.6616−6620.
  68. House K.L., Dunlap R.B., Odom J.D., Wu Z.-P., Hilvert D. Structural characterization of selenosubtilisin by 77Se NMR spectroscopy. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V.114. No 22. P.8573−8579.
  69. K.L., Garber A.R., Dunlap R.B., Odom J.D., Hilvert D. 1H NMR spectroscopic studies of selenosubtilisin. // Biochemistry. 1993. V.32. No 13. P.3468−3473.
  70. Syed R., Wu Z.-P., Hogle J.M., Hilvert D. Crystal structure of selenosubtilisin at 2.0-A resolution. // Biochemistry. 1993. V.32. No 24. P.6157−6164.
  71. Tanizawa K., Sugimura A., Kanaoka Y. Anhydrosubtilisin-catalyzed peptide synthesis // FEBS. 1992. V.296. No 2. P. 163−165
  72. Weiner H., White W.N., Hoare D.G., Koshland D.E. The formation of ahydrochymotrypsin by removing the elements of water from the serine at the active site. // J. Am. Chem. Soc. 1966. V.88. No 16. P.3851−3859.
  73. Zhong Z., Bibbs J.A., Yuan W., Wong C.-H. Active-site directed modification of subtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.113. P.2259−2263.
  74. Takagi H., Morinaga Y., Ikemura H., Inouye M. Mutant subtilisin E with enhanced protease activity obtained by site-directed mutagenesis. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. No 36. P. 19 592−19 596.
  75. Takagi H., Morinaga Y., Ikemura H., Inouye M. The role of Pro-239 in the catalysis and heat stability of subtilisin E. // J. Biochem. 1989. V.105. P.953−956.
  76. Rheinnecker M., Baker G., Eder J., Fersht A.R. Engineering a novel specificity in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1993. V.32. No 5. P. l 199−1203.
  77. Rheinnecker M., Eder J., Pandey P. S., Fersht A.R. Variants of subtilisin BPN' with altered specificity profiles. // Biochemistry. 1994. V.33. P.221−225.
  78. Rollence M.L., Filpula D., Pantoliano M.W., Bryan Ph.N. Enguneering thermostability in subtilisin BPN' by in vitro mutagenesis. // CRC Critical Reviews in Biotechnology. 1988. V.8. P.217−224.
  79. Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Significance of hydrophobic S4-P4 interactions in subtilisin 309 from Bacillus lentus. // Biochemistry. 1993. V.32. P.2845−2852.
  80. Schiodt J., Sorensen S.B., Osten C., Breddam K. Changing the substrate preference of the hydrophobic S4 binding pocket of subtilisin 309 from Bacillus lentus. I I Prot. Pept. Lett. 1996. V.3. No 1. P.29−44.
  81. Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Mutational replacements in subtilisin 309. Vall04 has a modulating effect on the P4 substrate preference. // Eur. J. Biochem. 1992. V.209. P.869−874.
  82. Bonneau P.R., Grayacar T.P., Estell D.A., Bryan J.J. Alteration of the specificity of subtilisin BPN' by site-directed mutagenesis in its SI and SI' binding sites. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.113. P.1026−1030.
  83. Wangikar P.P., Grayacar T.P., Estell D.A., Clark D.S., Dordick J.S. Protein and solvent engineering of subtilisin BPN' in nearly anhydrous organic media. //J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. No 26. P. 12 231−12 237.
  84. Takagi H., Maeda Т., Ohtsu I., Tsai Y.C., Nakamori S. Restriction of substrate specificity of subtilisin E by introduction of a side chain into a concerved glycine residue. // FEBS Lett. 1996. V.395. P. 127−132.
  85. Takagi H., Maeda Т., Ohtsu I., Nakamori S. Construction of novel subtilisin E with high specifity, activity and pruductivity through multiple amino acid substitutions. // Protein Eng. 1997. V.10. P.985−989.
  86. Takagi H., Maeda Т., Ohtsu I., Nakamori S. Random mutagenesis into the conserved Gly 154 of subtilisin E: isolation and characterization of the revertant enzymes. // Protein Eng. 1998. V.ll. P.1205−1210.
  87. Mei H.-C., Liaw Y.-C., Li Y.-C., Wang D.-C., Takagi H., Tsai Y.-C. Engineering subtilisin YaB: restriction of substrate specificity by the substitution of Gly 124 and Gly 151 with Ala. // Protein Eng. 1998. V.ll. P.109−117.
  88. Estell D.A., Graycar T.P., Wells J.A. Engineering an enzyme by site-directed mutagenesis to be resistant to chemical oxidation. // J. Biol. Chem. 1985. V.260. No 11. P.6518−6521.
  89. Zhu L., Ji Y. Protein engineering on subtilisin E. // Chin J. Biotechnol. 1997. V.13. P.9−15.
  90. Plettner E., Khumtaveerporn K., Shang X., Jones J. B. A combinatorial approach to chemical modification of subtilisin Bacillus lentus. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. V.8. P.2291−2296.
  91. Dickman M., Lloyd R.C., Jones J.B. Chemically modified mutants of subtilisin Bacillus lentus catalyze transesterification reactions better than wild type. // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. Y.9. P.4099−4102.
  92. Ballinger M.D., Tom J., Wells J.A. Designing subtilisin BPN' to cleave substrates containing dibasic residues. // Biochemistry. 1995. V.34. P. 1 331 213 319.
  93. Ballinger M.D., Tom J., Wells J.A. Furilisin: a variant of subtilisin BPN' engineered for cleaving tribasic substrates. // Biochemistry. 1996. V.35. P.13 579−13 585.
  94. Strausberg S.L., Alexander P.A., Gallagher D.T., Gilliland G.L., Barnett B.L., Bryan P.N. Directed evolution of a subtilisin with calcium-independent stability. // Biotechnology. 1995. V.13. P.669−673.
  95. Tange T., Taguchi S., Kojima S., Miura K., Momose H. Improvement of a useful enzyme (subtilisin BPN') by an experimental evolution system. // Appl. Microb. Biotechnol. 1994. V.41. No 2. P.239−244.
  96. Fagain C.O. Understanding and increasing protein stability. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V.1252. No 1. P. l-14.
  97. Shaw A., Bott R. Engineering enzymes for stability. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. Y.6. No 4. P.546−550.
  98. Mitchinson C., Wells J.A. Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1989. Y.28. P.4807−4815.
  99. Kwon S.T., Matsuzawa H., Ohta T. Determination of the positions of the disulfide bonds in aqualysin I (a thermophilic alkaline serine protease) of Thermus aquaticus YT-1. // J. Biochem. 1988. V.104. P.557−559.
  100. Chen K., Arnold F.H. Tuning the activity of an enzyme fpr unusial enviroments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. No 12. P.5618−5622.
  101. You L., Arnold F.H. Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. // Protein Eng. 1996. V.9. P.77−83.
  102. Zhong Z., Liu J.L.-C., Dinterman L.M., Finkelman M.A.J., Mueller W.T. Engineering subtilisin for reaction in dimethylformamide. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.113. P.683−684.
  103. Wong C.-H., Schuster M., Wang P., Sears P. Enzymatic synthesis of N- and O-linked glycopeptides. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. P.5893−5901.
  104. Potetinova J.V., Voyushina T.L., Stepanov V.M. Enzymatic synthesis of peptidyl amino alhohols and peptidyl amino aldehydes serine proteinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. V.7. No 6. P.705−710.
  105. Fruton J. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982. V.53. P.239−306.
  106. C.B., Лысогорская E.H., Филиппова И. Ю., Анисимова В. В., Оксенойт Е. С., Степанов В. М. Тиолсубтилизин как инструмент пептидного синтеза. Получение и свойства. // Биохимия. 1997. Т.62. No 3. С.384−393.
  107. Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine p-nitroanilide — a chromogenic substrate for thiol proteinase assay. // Anal. Biochem. 1984. V.143. P.293−297.
  108. Stepanov V.M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68. No 6. P. 1335−1339.
  109. Т.Л., Люблинская Л. А., Степанов B.M. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорган, химия. 1985. Т.2. С.738−744.
  110. Т.Л., Терентьева Е. Ю., Позднев В. Ф., Гайда А. В., Гололобов М. Ю., Люблинская Л. А., Степанов В. М. Ферментативный синтез ацилпептидов, содержащих п -нитроанилиды основных аминокислот. // Биоорган, химия. 1991. Т.17. No 8. С.1066−1073.
  111. K6nnecke A., Dettlaff S., Jakubke H-D. Model studies on the utility of nucleophyles bound insoluble supports for enzymatic peptide synthesis. // Monatsh. Chem. 1982. V.113. P.331- 337.
  112. Slomczynska U., Albericio F., Cardenas F., Giralt E. Studies on the enzymatic coupling of peptide segments on the solid support. // Biomed. Biochim. Acta. 1991. V.50. P.67−73.
  113. Meyer J.D., Kendric B.S., Matsuura J.E., Ruth J.A., Bryan P.N., Manning M. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophibic ion pairing. // Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V.47. P.177−181.
  114. Wangikar P.P., Michels P.C., Clark D.S., Dordick J.S. Structure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.70−76.
  115. Renil М., Ferreras М., Delaisse J.M., Foged N.T., Meldal М. PEGA supports for combinatorial peptide synthesis and solid-phase enzymatic library assays. // J. Peptide Sci. 1998. Y.4. P. 195−210.
  116. Spetzler J.C., Westphal V., Winther J.R., Meldal M. Preparation of fluorescence quenched libraries containing interchain disulphide bonds for studies of protein disulphide isomerases. // J. Peptide Sci. 1998. V.4. P. 128 137.
  117. О.В., Воюшина Т.JI., Степанов В. М. О взаимодействии с носителями протеолитических ферментов, используемых для энзиматического синтеза пептидов в органических растворителях. // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т.30. С.786−793.
  118. Л.А., Юсупова М. П., Ваганова Т. И., Иванова Н. М., Степанов В. М. Твердофазный синтез биоспецифического сорбента для аминопептидаз. // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. No 11. С. 1490−1495.
  119. Kullmann W. Enzymatic peptide synthesis. // Boca Raton. Florida. CRC Press Inc. 1987.
  120. НЗ.Гололобов М. Ю., Морозова И. П., Степанов В. М. Выделение протеиназы Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.33−40.
  121. Stepanov Y.M., Rudenskaya G.N., Gaida A.V., Osterman A.L. Affinity chromatography of proteolytic enzymes on silica-based biospecific sorbents. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1981. V.5. P. 177−186.
  122. Л.А., Хайду И., Баландина Г. Н., Филиппова И. Ю., Маркарян А. Н., Лысогорская Е. Н., Оксенойт Е. С., Степанов В. М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. No 6. С.748−753.
  123. А.А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов. // Киев. Наукова Думка. 1992.
  124. А. А. Определение основных кинетических параметров ферментативных реакций. // В кн.: Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Под ред. Прокофьева М. А. Москва. Изд. Моск. университета. 1985. С.72−73.
  125. С.В., Лавренова Г. И., Степанов В. М. Внеклеточная металлопротеиназа Legionella pneumophila. // Биохимия. 1987. Т.52. No 8. С.1387−1396.
  126. А. Практическая химия белка. // Москва. Мир. 1989. С. 101.
  127. Ellman G. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. 1959.1. V.82. P.70−77.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!