Компьютерный анализ и моделирование структурно-функциональной организации и эволюции генных сетей, контролирующих развитие крыла Drosophila melanogaster

Актуальность проблемы.

Одна из центральных задач биологии — изучение фундаментальных принципов морфогенеза животных, в частности молекулярногенетических и клеточных механизмов, контролирующих развитие. Drosophila melanogaster уже 80 лет является наиболее изученным объектом в генетическом и молекулярном плане среди Bilateria1 [Grumbling G. et al., 2006]. За время исследования D. melanogaster накоплен обширный экспериментальный материал, описывающий процессы, контролирующие развитие D. melanogaster на молекулярно-генетическом, клеточном и тканевом уровнях организации, включая информацию о генах, детерминирующих процессы морфогенеза, кодируемых ими белках, путях передачи сигналов и т. д. В настоящее время появилась возможность теоретического и компьютерного анализа процессов морфогенеза и построения математических моделей отдельных процессов морфогенеза D. melanogaster.

Важнейшее значение для понимания динамики процессов морфогенеза имеет исследование путей передачи сигналов в генных сетях — ансамблях координированно функционирующих генов, детерминирующих процессы развития. Пути передачи сигналов, функционирующие в процессах морфогенеза, обеспечивают восприятие градиентов концентраций морфогенов и их трансформацию в дифференцированные состояния клеток в составе тканей и органов. Согласно современным данным существует всего л лишь 7 основных путей передачи сигналов (Hh, Wnt, TGF-p, RTK, JAK/STAT, Notch, а также путь передачи сигналов ядерных рецепторов), однако именно они обеспечивают все разнообразие морфогенетических процессов [Pires-daSilva A., Sommer R.J., 2003]. Поэтому математическое моделирование систем, в основе которых находятся пути передачи сигналов, особенно важно для изучения динамики функционирования и закономерностей эволюции молекулярно-генетических механизмов,.

1 Группа типов многоклеточных животных (Metazoa) имеющих билатеральную симметрию.

2 Краткие названия генов и белков даны в диссертации в соответствии с номенклатурой FlyBase [Grumbling G. et al., 2006]. Полные названия генов и белков могут быть взяты из Приложения 0.1 к диссертации. контролирующих развитие животных. Следует подчеркнуть, что изучению динамики функционирования метаболических путей посвящено большое количество экспериментальных и теоретических работ [Caspi R. et al, 2006]. В то же время, теоретико-компьютерным исследованиям динамики функционирования путей передачи сигналов в процессах морфогенеза уделяется значительно меньшее внимание [Kanehisa М. et al., 2006]. В связи с этим остаются открытыми вопросы: о роли различных типов регуляторных контуров в процессах развитияособенностях динамики функционирования регуляторных контуровнеобходимых и достаточных условиях для функционирования регуляторных контуров.

Известно, что фенотип организма, формирование которого детерминируется генными сетями онтогенеза, ответственен за приспособленность организма к условиям среды. Следовательно, одной из важнейших задач эволюционной биологии является выяснение закономерностей эволюции, как генных сетей онтогенеза, так и отдельных генов, детерминирующих морфогенез [Raff R.A., 1996]. До настоящего времени решению этой задачи уделялось мало внимания. Опубликовано лишь ограниченное количество работ, посвященных эволюции отдельных генов морфогенеза [Kumar S. et al., 1996; Shimeld S.M., 1999; Katoh Y., Katoh M., 2005; Dorus S. et al., 2006]. В ряде работ [Davidson E.H. et al, 1995; Peterson K.J. et al, 2000; Salazar-Ciudad I. et al., 2003; Salazar-Ciudad I., Jernvall J., 2004] исследованы качественные особенности эволюции гипотетических генных ансамблей, контролирующих процессы морфогенеза. Однако исследование эволюции реальных генных сетей морфогенеза Bilateria до настоящего времени не проводилось. Исследование этого вопроса имеет важное значение для понимания эволюции морфогенеза и, в более общем плане, исследования закономерностей эволюции сложных систем.

Цели и задачи исследования.

Целью диссертационной работы было изучение структурно-функциональной организации и эволюции молекулярно-генетических систем, детерминирующих развитие крыла D. melanogaster, с использованием методов компьютерного анализа и математического моделирования. В этой связи в работе решались следующие задачи:

1. компьютерная реконструкция генных сетей развития крыла Д melanogaster на основе аннотации экспериментальных данных, представленных в научных публикациях;

2. анализ структурно-функциональной организации этих генных сетей и выявление функционирующих в их составе регуляторных контуров;

3. построение математической модели процесса распространения и восприятия морфогена, детерминирующего развитие крыла Д melanogaster,.

4. изучение с использованием этой математической модели влияния мутаций на динамику морфогенетических процессов;

5. компьютерный анализ режимов молекулярной эволюции генных сетей развития крыла D. melanogaster и выявление адаптивно эволюционирующих генов, функционирующих в составе этих генных сетей.

Научная новизна.

1. Экспериментальные данные из более 300 научных статей впервые систематизированы посредством реконструкции непротиворечивых генных сетей формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов крылового имагинального диска Д. melanogaster.

2. На основе теории графов впервые проведен анализ генных сетей развития крыла Д. melanogaster. Установлено, что различия в динамике функционирования сетей регуляторных событий формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов обусловлены различным составом элементарных регуляторных контуров, способами их объединения в регуляторные контуры-переключатели и взаимодействием с внешними стимулирующими воздействиями.

3. Впервые в контексте процесса формирования антерио-постериорной границы крылового имагинального диска Д melanogaster построена математическая модель функционирования молекулярного механизма, воспринимающего морфоген Hh, учитывающая пространственную распределенность. Модель позволила уточнить механизм ответа клеток на морфоген Hh, а также исследовать влияние мутаций на динамическую устойчивость некоторых процессов морфогенеза.

4. Впервые проведен комплексный анализ молекулярной эволюции генной сети формирования антерио-постериорной границы компартментов крылового имагинального диска D. melanogaster и установлено, что адаптивная эволюция транскрипционных факторов, морфогенов и их рецепторов, а также компонентов системы переноса сигнала внутрь ядра клетки, функционирующих в составе этой генной сети, как правило, коррелирует с образованием крупных таксонов Bilateria.

Научная и практическая ценность.

1. Реконструкция и анализ генных сетей формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов крылового имагинального диска D. melanogaster позволили уточнить и дополнить представления о молекулярно-генетических механизмах, контролирующих процессы развитияполученные результаты могут быть использованы при планировании экспериментов, а также в университетских учебных курсах по проблемам биологии развития.

2. Математическое моделирование молекулярного механизма, воспринимающего градиент концентрации морфогена Hh, позволило предсказать ранее не известные особенности взаимодействия морфогена Hh с его рецептором и особенности динамики процесса рецепции градиента концентрации морфогена Hh в крыловом имагинальном диске D. melanogaster: — полученные результаты могут быть использованы для планирования экспериментов.

3. Созданная в рамках диссертации компьютерная система конвейерного анализа режимов молекулярной эволюции генов может быть использована для анализа и интерпретации экспериментальных данных, получаемых в рамках проектов по расшифровке геномов прои эукариот.

4. Проведенный анализ позволил уточнить представления о закономерностях эволюции генных сетей морфогенезаполученные данные могут быть использованы в университетских учебных курсах по проблемам молекулярной эволюции и биологии развития.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на: III съезде биофизиков России Воронеж, 24−29 июня 2004 г.- международной конференции «The Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (BGRS'2004) Novosibirsk, Russia July 25−30, 2004; международной конференции «International Workshop of Biosphere Origin and Evolution» (ВОЕ 2005) Novosibirsk, Russia, June 26−29, 2005; BGRS summer school «The International School of Young Scientist «Evolution, Systems Biology and High Performance Computing Bioinformatics» Novosibirsk, Russia, September 11−16, 2005; международной конференции «The Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (BGRS'2006) Novosibirsk, Russia July 16−22, 2006; всероссийской конференции «Инфокоммуникационные и вычислительные технологии и системы» Россия, Улан-Удэ, 1−4 июля 2006 г.- международной конференции «Genomics, Proteomics Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine» Novosibirsk, Russia July 12−26,2006.

Научные публикации.

Статьи в рецензируемых в журналах:

В.В. Суслов, К. В. Гунбин, Н. А. Колчанов Генетические механизмы кодирования биологической сложности // Экологическая генетика 2004. Т.2. Выпуск 1.С. 13−26.

К.В. Гунбин, В. В. Суслов, Н. А. Колчанов, Н. А. Омельянчук Генетические механизмы морфологической эволюции, часть 1 // Сибирский экологический журнал 2004. Том И. N 5. С. 599−610.

К.В. Гунбин, В. В. Суслов, Н. А. Колчанов, Н. А. Омельянчук Генетические механизмы морфологической эволюции, часть 2 // Сибирский экологический журнал. 2004. том 11. N5. С. 611−621.

Н.А. Колчанов, В. В. Суслов, К. В. Гунбин Моделирование биологической эволюции: регуляторные генетические системы и кодирование биологической организации // Информационный Вестник ВОГИС, 2004, Том 8, № 2, С. 86−99.

A.В. Ратушный, В. А. Лихошвай, Е. А. Ананько, Н. В. Владимиров, К. В. Гунбин, С. А. Лашин, Е. А. Недосекина, С. В. Николаев, Л. В. Омельянчук, Ю. Г. Матушкин, Н. А. Колчанов Новосибирская школа системной компьютерной биологии: исторический экскурс и перспективы развития // Информационный Вестник ВОГИС, 2005, Том 9, № 2, С. 232−261.

К.В. Гунбин, В. В. Суслов, Н. А. Колчанов. Ароморфозы и адаптивная молекулярная эволюция // Информационный Вестник ВОГИС, 2007, Том 11, № 2 (в печати).

B.В. Когай, К. В. Гунбин, Л. В. Омельянчук, С. И. Фадеев, Н. А. Колчанов Численное исследование модели рецепции градиента концентрации морфогена Hedgehog. // Сибирский журнал индустриальной математики, 2006, Том. IX, № 3(27) С. 66−79.

Статьи в рецензируемых трудах конференций:

Gunbin К.V., Omelyanchuk L.V., Ananko Е.А. Two gene networks underlying the formation of the anterior-posterior and dorso-ventral wing imaginal disc compartment boundaries in Drosophila melanogaster / Proceedings of the fourth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2004 / Eds. N. Kolchanov et al. / Novosibirsk: IC&G Press. 2004. Vol. 2. P. 56−59.

Omelyanchuk L.V., Gunbin K.V. An elementary module recognizing morphogenetic gradients in tissues / Proceedings of the fourth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2004 / Eds. N. Kolchanov et al. / Novosibirsk: IC&G Press. 2004. Vol. 2. P. 117−120. Kogai V.V., Gunbin K.V., Omelyanchuk L.V., Fadeev S.I. A model for sensing the morphogen Hedgehog concentration gradient I: a numerical study / Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2006 / Eds. N. Kolchanov and R. Hofestadt / Novosibirsk: IC&G Press. 2006. Vol.2 P. 194−198.

Gunbin K.V., Kogai V.V., Fadeev S.I., Omelyanchuk L.V. A model for sensing the Pedgehog concentration gradient II: a check for adequacy / Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2006 / Eds. N. Kolchanov and R. Hofestadt / Novosibirsk: IC&G Press. 2006. Vol. 2. P. 199−203.

Gunbin K.V., Morozov A.V., Afonnikov D.A. A method for semiautomated analysis of gene evolution / Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2006 / Eds. N. Kolchanov and R. Hofestadt / Novosibirsk: IC&G Press. 2006. Vol. 3. P. 155−158. Gunbin K.V. Aromorphoses and adaptive molecular evolution: morphogens and signaling cascade genes / Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2006 / Eds. N. Kolchanov and R. Hofestadt / Novosibirsk: IC&G Press. 2006. Vol. 3. P. 159−162. Kabanova A., Novikova O., Gunbin K., Fet V., Blinov A. Evolutionary relationships and distribution of the different LTR retrotransposon families in plants / Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS'2006 / Eds. N. Kolchanov and R. Hofestadt/Novosibirsk: IC&G Press. 2006. Vol. 3. P. 163−166.

Тезисы в научных трудах конференций.

Гунбин К.В., Суслов В. В., Колчанов Н. А. Генетические механизмы кодирования биологической сложности. / III съезд биофизиков. Тезисы докладов. / Воронеж: Издательско-полиграфическая фирма «Воронеж». 2004. Том II, С.764−765.

Когай В.В., Гунбин К. В., Омельянчук JI.B., Фадеев С. И., Колчанов Н. А. Модель рецепции градиента концентрации морфогена Hedgehog. / Инфокоммуникационные и вычислительные технологии и системы. Материалы II всероссийской конференции с международным участием / Улан-Удэ: Издательство Бурятского госуниверситета. 2006. Том 1. С. 168 174.

Gunbin К.V., Omelyanchuk L.V., Kolchanov N.A. Aromorphoses and the adaptive molecular evolution: Hedgehog signaling cascade genes. / International Workshop «Biosphere Origin and Evolution». Abstracts. / Novosibirsk: Boreskov Institute of Catalysis Press. 2005. P. OP-5.

Gunbin K.V., Omelyanchuk L.V., Kolchanov N.A. Aromorphoses and the adaptive molecular evolution: Hedgehog and Wingless signaling cascade genes. / The 2005 BGRS International Summer School for young scientists «Evolution, Systems Biology and High Performance Computing Bioinformatics». / Novosibirsk: IC&G., http://www.bionet.nsc.ru/meeting/bgrsschool/site/participants.html. 2005.

Организация материала диссертации.

Текст диссертации разбит на главы. Первая глава является аналитическим обзором литературы по предмету исследования. Вторая глава посвящена построению и логическому анализу генных сетей развития крыла D. melanogaster. Третья глава — построению и анализу математической модели рецепции градиента концентрации морфогена Hh. Четвертая главаанализу режимов эволюции генов генной сети рецепции градиента концентрации морфогена Hh. Некоторые результаты работы вынесены в соответствующие приложения.

Благодарности.

Проведенные исследования были бы не возможны без поддержки коллег лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН. Выражаю особую признательность за неоценимую помощь, а также обсуждение использованных методик и полученных результатов, д.б.н. Омельянчуку Леониду Владимировичу, д.ф.-м.н. Фадееву Станиславу Ивановичу, к.б.н. Афонникову Дмитрию Аркадьевичу, к.б.н. Иванисенко Владимиру Александровичу, к.б.н. Матушкину Юрию Георгиевичу, к.б.н. Пономаренко Михаилу Павловичу, к.ф.-м.н. Когаю Владиславу Владимировичу, к.б.н. Лихошваю Виталию Александровичу, н.с. Николаеву Сергею Васильевичу, н.с. Суслову Валентину Владимировичу.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1) С использованием компьютерной технологии GeneNet реконструированы генные сети формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов крылового имагинального диска Drosophila melanogaster. Генные сети содержат информацию о 95 генах и 150 белках и белковых комплексах.

2) В результате анализа генных сетей формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов крылового имагинального диска D. melanogaster выявлено 13 элементарных регуляторных контуров, т. е. контуров, не содержащих в себе других контуров. В результате анализа взаимодействий элементарных регуляторных контуров обнаружено два регуляторных контура-переключателя и реконструированы сети регуляторных событий формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов крылового имагинального диска D. melanogaster.

3) Моделирование с помощью сетей Петри показало, что сети регуляторных событий формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ имагинальных дисков имеют качественные различия в динамике функционирования, обусловленные различным составом элементарных регуляторных контуров, способами их объединения в регуляторные контуры-переключатели и взаимодействием с внешними стимулирующими воздействиями.

4) Построена математическая модель молекулярно-генетической системы, ответственной за формирование антерио-постериорной границы крылового имагинального диска D. melanogaster, учитывающая пространственную распределенность процессов развития. Показано качественное соответствие динамики концентраций компонент системы с экспериментальными данными.

5) На основании изучения мутационного портрета модели показана параметрическая устойчивость процессов функционирования регуляторного контура формирования клеточного типа антериопостериорной границы крылового имагинального диска D. melanogaster к малым изменениям динамических параметров. Предложен комплексный подход к исследованию эволюции генных сетей, основанный на интеграции результатов анализа режимов эволюции генов, полученных различными методами, а также на использовании данных о структурно-функциональной организации генов и кодируемых ими белков. На основе предложенного подхода создана компьютерная система конвейерного анализа режимов эволюции генов.

С помощью созданной компьютерной системы проанализированы режимы эволюции компонентов Hh-каскада сигналов. Показано, что адаптивная эволюция транскрипционных факторов, морфогенов и их рецепторов, а также компонентов системы переноса сигнала внутрь ядра клетки, как правило, коррелирует с дивергенцией крупных таксонов (типов и надклассов) многоклеточных животных.

V ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Настоящая диссертационная работа посвящена исследованию структурно-функциональной организации и эволюции генных сетей, контролирующих развитие крыла Drosophila melanogaster. Эти исследования направлены на решение одной из актуальных задач молекулярной биологии развития и теории эволюции — изучения молекулярно-генетических основ динамики функционирования и закономерностей эволюции механизмов, контролирующих развитие животных.

В главе 2 диссертации с помощью теории графов проводится анализ информации, содержащейся в генных сетях формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ компартментов крыла D. melanogaster. Было показано, что элементарные регуляторные контуры (ЭРК), содержащие отрицательные и положительные обратные связи, играют важнейшую роль в процессах клеточной дифференцировки. Предположение о важнейшей роли в генных сетях дифференцировки контуров положительных обратных связей подтвердилось (см. гл. 1.2 и гл. II). С помощью сетей Петри был произведен анализ качественной динамики функционирования сетей регуляторных событий (СРС) и регуляторных контуров-переключателей (РКП) участвующих в формировании антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ имагинальных дисков D. melanogaster. Каждая из этих СРС содержит центральный модуль — РКП и ряд вспомогательных модулей — ЭРК. При появлении внешнего регуляторного стимула происходит переход РКП формирования антерио-постериорной границы в активированное состояние, проявляющееся в возрастании концентрации веществ, запускающих дифференцировку клеток. После прекращения стимулирующего воздействия рассматриваемый РКП возвращается в исходное состояние. В случае РПК формирования дорсо-вентральной границы при определенных условиях (высокое сродство активаторной формы центрального транскрипционного фактора Su (H) к промоторам эффекторных генов ct и vg) для перехода в активированное состояние требуется лишь запускающее воздействие регуляторного стимула, однако это состояние не является устойчивым. Таким образом, динамика функционирования СРС формирования антерио-постериорной и дорсо-вентральной границ имагинальных дисков имеет качественные различия, обусловленные различным составом ЭРК, способами их объединения в РКП и взаимодействием с внешними стимулирующими воздействиями. Эти свойства динамики функционирования изученных СРС помогает понять причины устойчивости клеточной дифференцировки, а также причины всевозможных изменений состояния клеточных дифференцировки, зачастую, приводящих к канцерогенезу. Важно, что молекулярно-генетические механизмы развития сходны у различных многоклеточных животных, поэтому обнаруженные структурно-функциональные особенности молекулярных механизмов морфогенеза могут быть общими для всех многоклеточных животных [Pires-daSilva A., Sommer R.J., 2003].

В главе 3 диссертации на основе анализа генной сети антерио-постериорной границы компартментов крыла D. melanogaster с помощью численного моделирования построена модель блока генной сети, осуществляющего рецепцию градиента концентрации морфогена Hedgehog (Hh). Моделируемый блок генной сети детерминирует формирование специфического клеточного типа антерио-постериорной границы крыла D. melanogaster. Важно, что при учете биологически адекватных значений кинетических параметров системы, была показана устойчивость моделируемой системы к малым изменениям кинетических параметров, но чувствительность к существенным изменениям кинетических параметров. Подобное свойство означает высокую чувствительность морфогенетического процесса к мутациям различных типов, что очень важно при исследованиях закономерностей эволюции морфогенеза [Raff R.A., 1996]. Известно, что клетки антерио-постериорной границы крыла D. melanogaster являются организатором морфогенеза крыла [Held L.I., 2002]. Интересно, что этот организатор морфогенеза необходим лишь некоторое время в процессе развития крыла [Held L.I., 2002]. Организаторы морфогенеза, имеющие сходную динамику функционирования, есть и у млекопитающих [Rossant J., Tarn P., 2002]. Следовательно, построенная модель может быть полезна при исследовании динамики функционирования и закономерностей эволюции молекулярно-генетических систем развития позвоночных и, в частности, млекопитающих. Построенная модель также предсказывает ранее неизвестные молекулярно-биологические особенности процесса взаимодействия морфогена Hh и его рецептора. Эти результаты могут быть особенно полезны для планирования экспериментов по дальнейшему исследованию Hh-каскада сигналов, являющегося одной из основ молекулярно-генетических механизмов морфогенеза животных [Pires-daSilva A., Sommer R.J., 2003; Huangfii D., Anderson K.V., 2006].

В главе 4 диссертации проведено исследование закономерностей эволюции генов Hh-каскада сигналов, а также генов связанных с ним. Для проведения исследования на основе анализа имеющихся в мире методов поиска адаптивных событий эволюции генов, был предложен комплексный подход исследования эволюции молекулярно-генетических систем (см. гл. 1.8 и гл. IV). Предложенный подход исследования эволюции молекулярно-генетических систем основан на интеграции данных о структурно-функциональной организации генных сетей, функциях доменов белков и взаимосогласованных результатах анализа режимов эволюции генов различными методами, что значительно увеличивает точность предсказания событий адаптивной эволюции. На базе предложенного подхода создана компьютерная система конвейерного анализа режимов эволюции генов и молекулярно-генетических систем. С использованием созданной компьютерной системы впервые было установлено, что адаптивная эволюция транскрипционных факторов, морфогенов и их рецепторов, а также компонентов системы переноса сигнала внутрь ядра клетки, являющихся важнейшими компонентами молекулярно-генетических механизмов морфогенеза, обычно коррелирует с образованием крупных таксонов Bilateria. Полученная в ходе исследования информация позволила уточнить ранее предложенную теорию эволюции молекулярно-генетических систем морфогенеза многоклеточных животных [Davidson Е.Н. et al., 1995; Knoll А.Н., Carroll S.B., 1999; Peterson K.J. et al., 2000]. С помощью сопоставления режимов эволюции генов Hh-каскада сигналов с критическими кинетическими параметрами модели Hh-каскада сигналов (см. гл. Ill, IV) прояснилась закономерность эволюции молекулярно-генетических систем морфогенеза, изменение которых может быть одним из главных причин ароморфозов в группе Bilateria. По мере наращивания морфологической сложности, вследствие увеличения количества стадий развития, темпы эволюционных преобразований генов молекулярных механизмов морфогенеза существенно замедлялись. Изменяться функционально без потери жизнеспособности организма могли лишь дуплицированные копии генов.