Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами

Проблема химиотерапии злокачественных новообразований занимала значительное место в медико-биологических исследованиях на протяжении всего двадцатого века. Долгое время эффективность химиотерапии была невелика, однако с начала 70-х годов, с момента создания технологий получения рекомбинантных ДНК и моноклональных антител, когда появилась возможность совершить значительный прорыв в понимании природы возникновения злокачественных новообразований, химиотерапия рака приобрела второе дыхание. Появилась надежда на возможность целенаправленного воздействия на различные этапы внутриклеточной передачи сигналов, индуцирующие превращение здоровой клетки в злокачественную (Северин С.Е. и др., 1998). Значительный прогресс был достигнут также в изучении фундаментальных отличий рецепторных и маркерных портретов раковых клеток от нормальных, что, в сочетании с применением моноклональных антител и успехами в выделении и очистке ростовых факторов, позволило возродить идею П. Эрлиха о «магической пуле», т. е. нетоксичном для клеточного окружения соединении, специфически атакующем клетку-мишень. В это же время были достигнуты значительные успехи в получении противоопухолевых антибиотиков, обладающих высокой цитотоксичностью. Тридцатилетие с начала 70-х годов было ознаменовано многочисленными попытками создания высокоспецифичных конъюгатов различных противопухолевых препаратов с векторными молекулами, селективно и с высоким сродством связывающимися с уникальными маркерами, локализованными на поверхности раковых клеток. В качестве токсических агентов широко использовали вещества различных классов — антагонисты фолиевой кислоты (метотрексат), антибиотики антрациклинового ряда (доксорубицин, дауномицин, карминомицин, эпирубицин и их многочисленные производные), растительные алкалоиды (винкристин, винбластин и др), антибиотики ендиинового класса (калихемицин, эсперамицин), белковые токсины (дифтерийный токсин, экзотоксин, А из Pseudomonas, рицин), 6 различные фоточувствительные соединения на основе протопорфирина (фталоцианин, фотофрин, фотогем Р) и ряд других соединений. В качестве молекул-векторов первоначально наибольшее внимание привлекали моноклональные антитела против различных онкофетальных маркеров, и других антигенов, высокоэкспрессированых в опухолевых клетках, однако использование таких конъюгатов столкнулось с рядом фундаментальных ограничений. Эти ограничения связаны с низкой селективностью моноклональных антител в отношении опухолей, недостаточной эффективностью клеточной интернализации их конъюгатов с химиопрепаратами, а также с нестабильностью, приводящей к освобождению препарата до момента достижения контакта с опухолевой клеткой. В настоящее время для направленной доставки более перспективным представляется использование физиологических лигандов, рецепторы которых либо специфичны, либо высокоэкспрессированы на поверхности быстропролиферирующих клеток. Примерами таких лигандов могут служить трансферрин, альфа-фетопротеин, многие ростовые факторы. Последние особенно интересны в связи с высокой константой связывания с рецептором, высокой скоростью специфического эндоцитоза, а также доступностью, в большинстве случаев, в виде рекомбинантного человеческого белка.

Наша работа посвящена созданию и изучению биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста (ЭФР) с различными цитотоксическими агентами. К преимуществам ЭФР как молекулярного вектора следует отнести доступность белка в препаративных количествах, стабильность при комнатной температуре его и в органических растворителях, а также ряд физиологических свойств. ЭФР связывается со своим рецептором с высокой аффинностью (Кд=Ю" 10 М), причем ЭФР-рецепторный комплекс достаточно быстро интернализуется. Целый ряд злокачественных опухолей экспрессирует на поверхности клеток аномально высокое количество рецепторов ЭФР, что, несмотря на убиквитарность фактора роста, обеспечивает селективность доставки химиопрепаратов, связанных с ЭФР. В настоящее время созданы штаммы-продуценты рекомбинантного человеческого ЭФР, в связи с чем белок доступен в препаративных количествах. Механизм рецепторопосредованного эндоцитоза ЭФР также представляется удобным для целенаправленной интернализации цитотоксического агента. Кроме того, особенности процесса 7 внутриклеточной компартментализации комплекса ЭФР-рецептор-цитотоксический агент могут играть определенную роль в снижении резистентности к антрациклинам, что представляет значительный интерес для клинического использования. 8.

ВЫВОДЫ.

1. Получены конъюгаты ЭФР с ФЦ (А1), ФЦ (Со), ТФ (Со), Вб, Вк, Др, Км, проявляющие более высокую ЦТА, чем свободные вещества, в отношении опухолевых клеток линий А43 1 и В16.

2. Конъюгаты Др и Км с ЭФР проявляют более высокую ЦТА, чем свободные вещества, как в отношении чувствительных к антрациклинам клеток MCF-7Wt и SKOV3, так и резистентных MCF-7AdrR и SKVLB.

3. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми опухолями меланомы В16 показано, что терапевтическое применение конъюгатов ЭФР с ТФ (Со), Вб, Др и Км в исследуемых дозах приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни по сравнению с контролем. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывало влияния на эти параметры.

4. При поступлении в опухолевые клетки MCF-7 свободные и связанные с ЭФР Др и Км преимущественно накапливаются в ядрах как чувствительных, так и резистентных к антрациклинам клеток. При этом все исследуемые препараты накапливаются в ядрах чувствительных клеток с более высокой скоростью, чем в резистентных.

5. Накопление свободного Км как в резистентных, так и в чувствительных клетках MCF-7 и их ядрах происходило с более высокими скоростями и достигало более высоких уровней, чем накопление Др. Скорости накопления конъюгатов Км с ЭФР в ядрах клеток MCF-7Wt и MCF-7AdlR также превышали скорости накопления ЭФР-Др.

6. Накопление свободных антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных клеток MCF-7 происходит с более высокими скоростями, чем накопление их конъюгатов с ЭФР.

7. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7 в составе конъюгатов с ЭФР, в отличие от свободных Др и Км, их содержание в клетках, ядрах, а также их распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам.

8. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7Wt и MCF-7AdlR в составе конъюгатов с ЭФР уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

Таким образом, в заключение рассмотрения первой концепции действия антрациклиновых антибиотиков, можно сформулировать следующие выводы: 1. Интеркаляция Др в ДНК хотя и имеет место, но не играет ведущей роли в формировании нерепарируемых двухцепочечных разрывов- 2. Ведущую роль в образовании фрагментов ДНК играет активационный комплекс антрациклин-ДНК-топоизомераза II- 3. В результате действия этого комплекса происходит фрагментация ДНК по апоптотическому механизму.

Перед детальным рассмотрением второй концепции механизма действия антрациклинов необходимо рассмотреть тесно связанные с ней данные, описывающие метаболизм антрациклиновых антибиотиков, образование свободных радикалов и проявление цитотоксической активности.

По некоторым данным, свободные радикалы, генерируемые антрациклиновыми антибиотиками, играют важную роль в проявлении их токсичности и противоопухолевой активности [Эммануэль Н.М. и др., 1984; Lown J.V. et al., 1983]. Показано, что НАДФН-цитохром Р-450 катализирует образование семихиноновых радикалов антрациклинов. Семихиноновый радикал легко отдает электрон кислороду с образованием супероксида, и снова превращается в стабильную хиноновую форму. Если кислорода недостаточно, семихиноновый радикал не отдает электрон другим акцепторам и происходит неэнзиматическое расщепление гликозидной связи с образованием 7-дезоксиагликонов [Bachur N.R. et al., 1979]. Восстановлене антрациклинов могут осуществить и другие флавопротеиды [Fisher J. et al., 1983]. Взаимодействие семихиноновых радикалов антрациклиновых антибиотиков с внутриклеточным кислородом может приводить к образованию супероксидных и гидроксильных радикалов. Важную роль могут при этом играть ионы металлов, в частности, железа [Eliot H. et al., 1984; Zweier J.L., 1984]. Главную роль в процессах образования однотяжевых разрывов ДНК играют.

А + NADPH АН2 + NADP'.

АН2 + 02 АН*+ Н02.

СОД.

Н02 + НО*2 Н202 + 02 каталаза.

2 Н202 2 Н20 + 02.

КХ Fe (III) + 02 КХ ' Fe (III) + О.

КХ ' Fe (II) + Н202 KX’Fe (III) + ОН" + ОН.

ОН + ДНК образование разрывов.

Рис. 7. Схема образования свободных радикалов при восстановленииокислении антрациклиновых антибиотиков (А — антибиотик, АН семихиноновый радикал антибиотика, СОД — супероксиддисмутаза, КХ Fe (lII) и КХ' Fe (II) — комплексы ионов железа с АТФ или с белком). гидроксильные радикалы. В работе [Lown J.V. et al., 1983] предложена общая схема образования свободных радикалов при восстановлении-окислении противоопухолевых антибиотиков (рис. 7). В некоторых работах [Тараховский A.M. и др., 1983; Эммануэль Н. М. и др., 1984; Bachur N.R. et al., 1979; Lown J. V et al., 1983] предполагалось, что образование свободных радикалов может быть основой противоопухолевой активности и токсичности антрациклинов. В частности, кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков объясняли образованием гидроксильных радикалов или супероксида в сердечной мышце [Doroshow J.H., 1983; Nohl Н., Jordan W., 1983]. Образование свободных радикалов может стимулировать перекисное окисление липидов, что в свою очередь может вести к дезинтеграции эндоплазматического ретикулума и мембран митохондрий. Тем не менее, представляется более вероятным, что свободнорадикальный механизм все же играет вспомогательную роль в механизме проявления цитотоксичности антрациклинов. Показано, что образование разрывов ДНК и цитотоксическое действие антрациклинов в.

38 культуре опухолевых клеток не зависит от присутствия кислорода [Brox L. et al., 1982; Kennedy К. A. et al., 1983]. Ингибиторы образования свободных радикалов не подавляют образования однотяжевых разрывов ДНК в присутствии Др [Pommier Y. et al., 1983]. Разрывы ДНК, индуцируемые свободными радикалами, выявляются только в хорошо аэрируемых клетках в присутствии очень высоких (2,8×10″ 4 М) концентраций Др, то есть значительно выше тех, которые могут быть достигнуты в плазме при внутривенном введении антибиотика в клинике. Следовательно, по имеющимся в литературе данным, противоопухолевая активность и цитотоксичность антрациклинов не могут быть связаны со свободнорадикальными механизмами.

Взаимодействие антрациклинов с клеточной мембраной.

Рассмотрим вторую концепцию механизма цитотоксического действия антрациклиновых антибиотиков. Известно, что антрациклиновые антибиотики, а также другие интеркаляторы и такие противоопухолевые препараты, как актиномицин Д и соединения платины, взаимодействуют с плазматическими мембранами животных клеток [Sinha В.К., Chignell С.F., 1979]. Антрациклины, в частности, могут вызывать лизис эритроцитов и разрушение мембран теней эритроцитов [Myers С.Е. et al., 1982]. Показано, что комплекс Др-Ре3+ связывается с фосфолипидами мембраны [Demant E.J.F., 1984]. Высказывалось предположение, что первичным токсическим эффектом антрациклиновых антибиотиков является действие на мембрану. Так, например, [Tritton T.R., Yee G., 1982], сообщили, что Др может вызывать цитотоксический эффект, не проникая внутрь клетки. Они ковалентно иммобилизовали Др на агарозных гранулах. Иммобилизованный антибиотик подавлял рост клеток лейкоза LI210 так же эффективно, как и свободный, при этом в клетках Др не обнаруживался. Другие исследователи [Tokes Z.A. et al., 1982; Rogers K.E. et al., 1983] получили Др, ковалентно связанный с микросферами, образованными полиглутаральдегидом. В этом случае антибиотик также оказывал токсическое действие на опухолевые клетки, не проникая в них. Почти весь антибиотик оставался связанным с микросферами и не проникал в клетки, так что активность нельзя было объяснить его освобождением, следовательно, он действовал с поверхности клетки. При этом цитотоксичность не только сохранялась, но и в некоторых случаях значительно усиливалась. Кроме того,.

39 устойчивые к Др опухолевые клетки проявляли чувствительность к антибиотику, связанному с микросферами. В этом случае, вероятно, имеет место новый механизм цитотоксического действия, не свойственный в норме антрациклинам [Rogers К. Е, Tokes Z.A., 1984]. Действительно, неактивный аналог Др, 4-деметокси-7,9-диэпирубомицин, в концентрации не влиял на рост клеток лейкоза L1210, но это же производное, связанное с микросферами, подавляло рост того же штамма на 50%, в концентрации 2,1×10″ 7 М. Микросферы без антибиотика в эквивалентной концентрации не оказывали влияния на рост опухолевых клеток. Кроме того, смесь микросфер, не содержащих производного, со свободным деметоксидиэпирубомицином так же не подавляла рост клеток лейкоза L1210. Авторы работы пришли к выводу, что связанные с полимером антрациклины воздействуют на клеточную мембрану, причем не характерным для свободных антибиотиков способом.

Таким образом, можно сделать два основных вывода из проанализированных фактов, подтверждающих вторую концепцию действия Др: 1. Взаимодействуя с мембраной, антибиотик в состоянии оказывать значительное влияние на регуляцию процессов внутри клетки, вплоть до продукции цитотоксических эффектов- 2. Проникновение антибиотика внутрь клетки не является необходимым условием для проявления его цитотоксичности.

На основании представленных литературных данных можно заключить, что рассматриваемые концепции механизма действия Др являются взаимодополняющими, а не противоречащими друг другу.

1.2.2. Использование конъюгатов антрациклинов для направленной терапии опухолей.

Антибиотики антрациклинового ряда, в частности, Др и рубомицин, получившие широкое распространение в химиотерапии злокачественных опухолей, были использованы для создания конъюгатов с векторными белками для направленной доставки антрациклинов в ткани-мишени. Первые работы были основаны на использовании для конъюгирования водорастворимого карбодиимида ЕДС (1-этил З-(З-диметиламинопропил)-карбодиимид) [Hurwitz Е. et al., 1975; Arnon R., Sela M., 1982], однако полученные конъюгаты с моноклональными антителами были неактивны. Несколько лучшие результаты.

40 показали смешанные производные, в которых один белок служил носителем Др, а другой — вектором. При этом белок — носитель Др ковалентно связывался с моноклональным антителом, способным распознавать специфические антигены на поверхности клеток-мишеней. Полученные конъюгаты проявляли активность in vitro, лишь незначительно превышающую активность свободного препарата и характеризовались повышенной иммунной реактивностью [Hurwitz Е. et al., 1975].

Для увеличения цитотоксической активности конъюгатов предпринимались попытки повышения молярного отношения антибиотик/белок в конъюгате путем использования водорастворимых декстранов в качестве аккумуляторов антибиотика. Это позволило повысить молярное отношение с 5 до 50 раз. Однако, активность таких конъюгатов была снижена по сравнению с конъюгатами, в которых белок и Др были «сшиты» непосредственно [Arnon R., Sela М., 1982]. Хорошие результаты дало использование конъюгата связанного с Др аминодекстрана, и антител NP-4 против раково-эмбрионального антигена. Молярное отношение антибиотик/белок в конъюгате составляло 20. Антигенспецифическая активность антител, входящих в состав конъюгата, сохранялась in vitro и in vivo, однако интернализация была замедлена (порядка 5 ч) [Shih L.B. et al., 1991, 1994]. При этом предполагалось, что быстрое освобождение антибиотика из состава конъюгата внутри клетки после интернализации лиганд-рецепторных комплексов положительно скажется на его активности. С этой целью для сшивки декстрана с Др использовали различные кислотолабильные спейсеры, легко распадающиеся в лизосомах. В частности, широко и успешно использовался амид cis-аконитовой кислоты для связывания Др и даунорубицина с широким набором антител [Shen W.G., Ryser J.P., 1981; Gallego J. et al., 1984; Diener E. et al., 1986; Dillman R.O. et al., 1988]. Такие конъюгаты были стабильны при рН 7 и освобождали антрациклин при рН 5, соответствующем рН в лизосомах. Все конъюгаты проявляли антигенспецифическую активность in vitro. Кислотолабильные конъюгаты Др с гидразиновыми производными декстрана по С-13 кетогруппе и моноклональными антителами проявляли как антигенсвязывающую, так и цитотоксическую активность [Hurwitz Е. et al., 1980; Arnon R., Sela M., 1982]. Активность конъюгатов морфолинодоксорубицина, полученных при помощи гидразона и оксима с антителами против рецептора фибронектина, зависела от.

41 РОССИЙскорости гидролизаконъюгаты полученные при помощи оксима оказались стабильными при значениях pH, близких к кислотности лизосомальной среды, и не обладали цитотоксической активностью. Напротив, конъюгаты, полученные при помощи ацилили сульфанил гидразонов, были кислотолабильными и проявляли высокую цитотоксическую активность [Muller В.М. et al., 1990]. Представляется обоснованным широко отраженное в литературе мнение, что чем более кислотолабильна связь в конъюгате, и чем выше молярное отношение антибиотик/белок (в разумных пределах, так как слишком большое количество «пришитого» антибиотика затрудняет интернализацию), тем эффективнее цитотоксическое действие препарата. Однако, к сожалению, терапевтические дозы, приведенные в литературе, даже самых эффективных конъюгатов с антрациклинами всегда были близки к максимальной толерантной дозе (кумулятивная доза составляла 27,6 мг/кг по Др). Таким образом, терапевтический индекс оставался низким, поэтому преимущество использования описанных выше конъюгатов по сравнению со свободным Др следует признать незначительным.

Одним из важных факторов, которые необходимо учитывать при создании конъюгатов, является чувствительность тканей, несущих специфические рецепторы, к токсическому агенту. Например, использование конъюгатов Др с Mab BR96 против легочной карциномы L2987, которая вообще чувствительна к Др, и где антиген BR-96 высокоэкспрессирован, может быть весьма эффективным, тогда как применение против опухолей сердечного эндотелия является недопустимым из-за опасной специфической кардиомиопатии. Эффективность применения конъюгатов в значительной мере определяется размером опухолей. Так, при применении конъюгатов против небольших опухолей иногда достигается 10-кратный выигрыш в скорости накопления по сравнению со свободным препаратом, даже введенным в максимальной толерантной дозе [Trail P.A. et al., 1993]. Необходимо также добиваться устойчивости создаваемых конъюгатов к сывороточной среде для обеспечения возможности достижения антибиотиком ткани-мишени Др, связанный с моноклональным антителом дисульфидной связью, например, хотя и проявлял неплохую модельную цитотоксическую активность, оказался, тем не менее, не пригоден для клинического использования из-за плохой фармакокинетики. В противоположность этому, терапевтический индекс.

42 тиоэфирсвязанных конъюгатов Mab 1Ж64-Др и Mab BR-96-Др был высок, устойчивость в сыворотке позволяла эффективно достигать мишени, в связи с чем удалось достичь кумулятивной дозы 306 мг/кг Др/пациент [Trail P.A. et al., 1993].

1.2.3. Винкаалкалоиды.

Винбластин (Вб) (рис. 8) — алкалоид, содержащийся в растениях барвинок и катарантус розовый, относится к алкалоидам индольного ряда. Вб является цитостатическим веществом, обладающим противоопухолевой активностью. Механизм противоопухолевого действия объясняется способностью препарата блокировать митоз на стадии метафазы. Вб действует угнетающе на лейкопоэз и тромбоцитопоэз, существенно не влияя на эритропоэз. Применяется Вб при лимфогрануломатозе, гематосаркомах, миеломной болезни, хориокарциноме. Успех лечения во многом определяется правильным выбором схемы терапевтического применения препарата. Курс терапии начинают с дозы 0,025 мг/кг, затем дозу постепенно повышают до 0,150,3 мг/кг. Курсовая доза составляет 100−120 мг. При отсутствии эффекта применение препарата прекращают при общей дозе 50 мг. Если наблюдается терапевтический эффект, проводят, проводя длительную поддерживающую терапию, подбирая дозу, которая при регулярном применении не уменьшает уровень лейкоцитов в крови ниже Зх109/л. Препарат вводят 1 раз в 2−4 недели. винбластин: Rj = СН3 винкристин: Rj = СНО.

Рис. 8. Химическая структура винкаалкалоидов.

Вб широко используется в комплексной химиотерапии опухолей в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами.

Винкристин (Вк) (рис. 8) — алкалоид, также содержащийся в растении барвинок розовый, по своему химическому строению близок к Вб. Вк обладает цитостатической активностью, механизм которой аналогичен таковому у Вб. Препарат применяется главным образом в терапии острого лейкоза, нейробластомы, используют также в комплексной терапии лимфогранулематоза, меланомы, рака молочной железы и других опухолей. Начальная доза курса химиотерапии составляет 0,05 мг/кг, конечная — 0,15 мг/кг. При применении винкристина возможна лейкопения. Препарат можнт оказывать нейротоксическое влияние и вызывать парастезии, двигательные расстройства, очаговые поражения ЦНС. В процессе лечения необходимо тщательно наблюдать за состоянием больных, проводить анализ крови.

Наряду с Вб и Вк в настоящее время в клинике используют навельбин (винорельбин) (Нб) и виндезин (Вд).

Нб относится к классу полусинтетических винкаалкалоидов [Potier Р., 1989]. Как и другие представители этого класса Нб воздействует на клетку в фазе G2 и M [Binet S., 1989; Cros S. et al., 1989]. При I фазе клинических испытаний было установлено, что лимитирующей токсичностью при применении Нб была лейкопения III и IV степени [Mathe G. et al., 1985]. В итоге клинических исследований Нб, проведенных во Франции и Японии, была рекомендована разовая доза 30 мг/м2 1 раз в неделю [Weber В. et al., 1993; Besenval M. et al., 1989]. Нб применяют при раке легкого, молочной железы, яичников и лимфомах. При применении Нб отмечалась также нейротоксичность, которая была значительно ниже, чем у Вк и Вд. По сравнению с другими винкаалкалоидами, Нб вызывал больший процент частичных ремиссий. Сравнительное изучение Нб и Вд при немелкоклеточном раке легкого показало явное превосходство Нб [Depierre A. et al., 1989].

Наибольшее число рандомизированных исследований посвящено сравнению эффективности Нб в монорежиме и в комбинации с другими препаратами: цисплатином, карбоплатином, ифосфамидом, митомицином С, вепезидом и др. Работы, проведенные Depierre и др. [Depierre A. et al., 1993], показали большую эффективность комбинации Нб+цисплатин по сравнению с одним Нб (48% и 17% соответственно). Таким образом, результаты 2 больших.

44 рандомизированных исследований показали преимущество комбинированной химиотерапии Нб+цисплатин по сравнению с одним Нб или одним цисплатином.

Нб изучается также в комбинированной химиотерапии при раке молочной железы с Др, фарморубицном, митоксантроном, 5-фторурацилом. Была отмечена высокая активность Нб в комбинированной химиотерапии с антрациклинами, цисплатином, митоксантроном, таксанами [Blajman С. et al, 1993; Dabaja В.S. et al., 1995; Bruni S.S. et al., 1993; Kourousis C. et al., 1996]. В настоящее время также ведутся исследования роли Нб в адъювантной и неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы, а также в комбинации с гормональной терапией.

Вд — первый полусинтетический винкаалкалоид, который был предложен для клинического применения. Его химическое название — дезацетил винбластин-амид сульфат. Структурно он очень схож с естествеными алкалоидами — Вк и Вб и отличается от последних наличием виндолинового кольца [Dyke R.W. et al., 1979].

Механизм действия Вд еще до конца не ясен. Как и другие барвинковые алкалоиды — Вк и Вб, Вд вызывает остановку клеточного деления в метафазе митоза. Кроме того, исследования in vitro показали, что Вд предупреждает инвазию злокачественных клеток в нормальную ткань [Nelson R.L. et al., 1979]. Однако, сравнительное изучение этих трех алкалоидов выявило резкие различия их действия на молекулярном уровне. Показано, что Вд в 3 раза эффективнее, чем Вк, и почти в 10 раз эффективнее, чем Вбон останавливает митоз от 10 до 15% клеток в культуре ткани. В дозах, останавливающих митоз от 40 до 50% клеток, Вд и Вк были примерно одинаково эффективны, причем оба оказались в три раза активнее Вб. Кроме того, между этими тремя алкалоидами отмечены качественные различия. Под действием низкой дозы Вб в препарате исследуемых клеток преобладают клетки в постметафазе, в которых отчетливо видны клеточная пластинка и хромосомы. Для клеток, обработанных Вк, напротив, характерна «шаровидная» метафаза с компактными хромосомами внутри сморщенного веретена. В отличие от Вб, Вд вызывает появление очень небольшого количества клеток в постметафазе. Клетки, обработанные Вд, имеют набухшие веретена с разбросанными хромосомами, которые резко отличаются от плотно упакованных хромосом в клетках, обработанных Вк.

Rahmani В. et al., 1985; Bodey G.P. et al., 1980; Binet S., 1990; Bayssas M. et al., 1980].

Вд проявляет онколитическую активность у больных при рецидивах, возникших на фоне комбинированного лечения несколькими препаратами, включая Вк. Как у лабораторных животных, так и у человека, главная роль в экскреции Вд принадлежит желчевыводящей системе [Rahmani В. et al., 1985]. В предклинических испытаниях было показано, что Вд обладает противоопухолевой активностью, сходной с Вк, но большей, чем у Вб, при остеосаркому Риджуэя, лимфосаркоме Гарднера и карциноме 755 молочной железы. На линиях немелкоклеточного рака легкого и рака желудка было показано, что Вд проявлял одинаковую активность с Вб, но более высокую, чем Вк. Активность Вд при лейкемии Р388 была в 3 раза больше, чем у Вк и в 10 раз выше, чем у Вб [Barnett C.J. et al., 1978; Cros S. et al., 1989]. При I фазе клинических испытаний Вд было отмечено, что дозолимитирующей токсичностью является нейтропения. После более чем 30-летних клинических исследований остался нерешенным вопрос об оптимальном режиме комбинированной химиотерапии с включением Вд при немелкоклеточном раке легкого [Sorensen G.B. et al., 1987]. В настоящее время Вд применяется как в монорежиме, так и при комбинированной терапии рака молочной железы, опухолей головы и шеи, меланом, лейкозов и лимфогранулематозов [Cersosimo R.J. et al., 1983].

1.2.4. Конъюгаты с винкаалкалоидами.

Большинство конъюгатов с винкаалкалоидами было получено на основе антител к 40 кДа гликопротеину, экспрессированному на поверхности клеток многочисленных карцином, таких как карцинома легких, толстого кишечника, яичников, желудка и др. В литературе эти антитела обозначаются Mab KS ¼. При испытании полученных конъюгатов in vitro и в отношении человеческих опухолей, перевитых иммунодифецитным мышам была продемонстрирована их антигенспецифическая активность [Johnson I S. et al., 1987; Johnson D.A. et al., 1990; Gutowski 1991, Starling J.J. et al., 1992]. Конъюгаты с дезацетилвинбластином и с дезацетилвинбластингидразидом, проявляли также противоопухолевую активность на моделях с перевитыми человеческими опухолями, причем второй оказался более эффективным [Johnson I.S. et al.,.

1987]. Более низкая активность дезацетилвинбластинового конъюгата связана с его большей лабильностью, что с учетом медленной интернализации комплекса с целевым антигеном ведет к высвобождению алкалоида из препарата на поверхности клетки [Starling J.J. et al., 1988, 1992].

В работе [Johnson I.S. et al., 1987] определили терапевтический индекс, то есть отношение максимальной толерантной дозы к минимально эффективной, для конъюгата с гидразидом дезоксивинбластина. Он оказался примерно равен 2,5. Тем не менее, этот конъюгат нельзя признать оптимальным для клинического применения, так как в диапазоне эффективных доз (40−250мг/м2) наблюдается высокая общая токсичность препарата. К тому же отмечена стимуляция конъюгатом системы комплемента [Schneck D. et al., 1989] и зафиксирована повышенная иммуногенность этого конъюгата [Petersen В.H. et al., 1991]. Таким образом, представляется необходимым дальнейшие исследования винкаалкалоидов в качестве цитотоксических компонентов средств направленного действия для терапии злокачественных опухолей. Необходим также поиск векторных молекул, способных эффективно доставлять винкаалкалоиды в опухолевые клетки.

1.2.5. Фталоцианины как агенты для фотодинамической и темновой (каталитической) терапии.

В качестве соединений для синтеза конъюгата с ЭФР, перспективным является использование ряда фталоцианинов (ФЦ): фталоцианина AI как агента для фотодинамической терапии (ФДТ) — фталоцианина Со и терафтала как агентов для темновой (каталитической) терапии [Van Hillegersberg R. et al., 1994; Daniell M.D. et al., 1991]. В основе ФДТ лежит использование фотосенсибилизаторов — веществ порфиринового ряда или порфириноподобных соединений, которые активируются и приобретают цитотоксические свойства только при облучении их светом определенной длины волны [Moan J., 1990].

ФДТ является одним из быстро развивающихся направлений практической онкологии [Kessel D., 1992]. Несмотря на то, что концепция ФДТ существует уже давно и используется в лечении ряда заболеваний, например, псориаза [Grand A. et al., 1993], лишь недавно началась разработка таких фотосенсибилизаторов, которые могут быть пригодны для лечения.

47 злокачественных новообразований. В 1978 году в США были проведены первые широкие клинические испытания метода ФДТ, который оказался наиболее эффективным при лечении поверхностно расположенных опухолей кожи, мочевого пузыря, бронхов, женских половых органов, головы и шеи, пищевода и желудка [Van Hillegersberg R. et al., 1994]. В настоящее время в клиниках различных стран мира в качестве фотосенсибилизаторов используются гематопорфирины (фотофрин-1, фотосан). Первую фазу клинических испытаний в настоящее время проходят новые классы фотосенсибилизаторов, таких как фталоцианины и хлорины [Соколов В.В. и др., 1995; Якубовская Р. И. и др., 1997]. ФДТ может быть использована как самостоятельное направление, так и в комплексе с общепринятыми хирургическим лечением, радиои химиотерапией. Возможно, ФДТ станет значительным шагом в терапии опухолей разного происхождения, так как к фотодинамическому процессу чувствительны клетки любой ткани [Moan J., 1990]. Этот способ лечения, вероятно, поможет решению такой проблемы современной онкологии, как проблема множественной лекарственной резистентности [Сергеева Н.С. и др., 1996]. Преимуществом ФДТ является отсутствие таких осложнений химиои радиотерапии, как цитопения, интоксикация организма, тканевая атрофия. ФДТ практически атравматична, и единственное в чем нуждается больной из-за наличия небольших болевых ощущений в процессе лечения — это в мягкой постпроцедурной анальгезии. Через несколько дней после облучения опухоль подвергается некрозу, а через 2−3 недели происходит заживление раны путем реэпителизации [Peng Q. et al., 1991 d]. Побочным эффектом ФДТ является повреждение нормальных тканей организма при облучении опухоли и повреждение кожи и глаз естественным светом [Peng Q. et al., 199led]. Снизить риск фотосенсибилизации возможно применением тех препаратов, которые не накапливаются в коже и других нормальных тканях, быстро выводятся из организма, а также повышением избирательности их действия путем использования векторных молекул. Чтобы избежать поражения нормальных тканей при облучении для ФДТ используются лазерные источники, фокусирующиеся непосредственно на опухоль [Novodarova G.N. et al., 1996]. Другим недостатком фотосенсибилизаторов как терапевтических средств является невозможность их применения при локализации опухоли в участках, недоступных для подведения источника света. Использование темновой.

48 каталитической) терапии с применением производных фталоцианинового ряда — фталоцианина Со (ФЦ (Со)) и терафтала Со (ТФ (Со)) может значительно расширить возможности метода лечения опухолей более глубокой локализации [Соколов В.В. и др., 1995].

Химическая структура и основные свойства фталоцианипов.

На сегодняшний день существуют два поколения фотосенсибилизаторов. Фотосенсибилизаторы первого поколения (фотогемы) представляют собой производные гематопорфирина (ГП), а второго поколения (фотосенсы) -производные фталоцианина и хлорина. В настоящее время фотогемы и ряд фотосенсов проходят 2-ю и 1-ю фазы клинических испытаний соответственно [Соколов В.В. и др., 1995].

Наиболее широко использующимся представителем первого поколения фотосенсибилизаторов является фотофрин. Этот препарат стал первым разрешенным для клинических испытаний фотосенсибилизатором. Несколько тысяч пациентов прошли курс ГП — опосредованной терапии, которая была высоко эффективной для ранних и поверхностно расположенных форм рака [Spikes J.D. et al., 1986; Якубовская Р. И. и др., 1997]. Несмотря на успешное применение этих препаратов в клинике, продолжаются поиски новых фотосенсибилизирующих агентов. Причина поиска заключается, во-первых, в том, что используемое в настоящее время производное гематопорфирина является сложной смесью, в следствие чего метод до сих пор остается весьма эмпирическим. А во-вторых, поиски проводятся с целью повышения эффективности фотодеструкции опухоли, которая может быть достигнута при использовании фотосенсибилизаторов, имеющих полосы поглощения с высоким коэффициентом экстинкции в дальней красной и ближней инфракрасной областях (с увеличением длины волны увеличивается глубина проникновения света в ткани) [Ris H.В. et al., 1993].

Второе поколение фотосенсибилизаторов является более перспективным, так как его представители обладают более оптимальными свойствами для использования в терапии, чем препараты первого поколения, а именно, большей селективностью к опухолевым тканям, меньшей токсичностью и лучшими фотофизическими параметрами [Ris Н.В. et al., 1993]. Так, эти препараты имеют более сдвинутый в правую сторону максимум поглощения (для фталоцианинов.

670 нм, для хлоринов — 652 нм) по сравнению с максимумом поглощения ГП (630 нм), что позволяет свету проникать в ткань на большую глубину. Во-вторых, коэффициент молярной экстинкции фотосенсов (для ФЦ (А1) — 95 600 М~ ' см" 1 при 670 нм) превосходит коэффициент молярной экстинкции компонентов ГП (2−3000 М-1 см" 1 при 625 нм). Из группы активно изучаемых фотосенсов одним из наиболее перспективных является фталоцианин А1 (ФЦ (А1)) (рис. 9). Два других представителя фталоцианинового ряда — ФЦ (Со) и ТФ (Со) (рис. 9) могут использоваться для темновой терапии. К преимуществам ФЦ следует отнести то, что они легко синтезируются, резистентны к химическому и фотофизическому разрушению (ФЦ (А1)), низкотоксичны, легко проникают через мембрану клетки. Кроме того, ФЦ (А1) обладает оптимальными фотофизическими параметрами, а именно, продуцируют долгоживущее триплетное состояние и имеет пик поглощения в красной области спектра (670 нм) с высоким коэффициентом экстинкции [Peng Q. et al., 1991abd],.

Me = Al: алюминий (II) (дисульфохлорид) фталоцианин Me = Co: кобальт (II) (дисульфохлорид) фталоцианин ноос соон кобальт (Ii) (октакарбокои) фталоцианин (терафтал).

Рис. 9. Химическая структура фталоцианинов.

Механизм действия фотодинамической и темповой (каталитической) терапии.

Механизм действия фотосенсибилизаторов разных классов (гематопорфирины, фталоцианины, хлорины) сходен. В основе цитотоксического действия фотосенсибилизаторов лежит их преимущественное накопление в опухолевых тканях и последующая активация препаратов при облучении светом соответствующей длины волны в красной части спектра [Peng Q. et al., 1991Ь]. Цитотоксичность реализуется, главным образом, через фотоокислительные реакции двух типов [Valenzeno D., 1987; Salet С. et al., 1990]. Фотоокисление 1-го типа включает прямую реакцию возбужденного сенсибилизатора с субстратом, что приводит к образованию переходных радикалов, которые далее вступают в реакцию с кислородом. В реакции второго типа энергоперенос происходит из возбужденного триплетного состояния сенсибилизатора на молекулы кислорода с образованием синглетного кислорода [Valenzeno D., 1987], который далее вступает в реакцию с субстратами, поддающимися окислению. Кроме прямого фотохомического воздействия на опухолевые клетки, в процессе деструкции тканей при ФДТ играют роль другие механизмы: нарушение кровоснабжения опухолевой ткани за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов, гипертермический эффект, связанный с активным поглощением света опухолевыми клетками, цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов [Gomer C.J. et al., 1984].

Изучение внутриклеточной локализации ФЦ показало, что фотосенсибилизатор преимущественно связывается с мембранами (плазматической, митохондриальной, ядерной и мембраной шероховатого эндоплазматического ретикулума) [Valenzeno D., 1987], накапливается в лизосомах, митохондриях и, в некоторых случаях, в ядре [Salet С. et al., 1990, Rousseau J. et al., 1991; Miller К. et al., 1994]. Избыточное количество синглетного кислорода, образующееся в ходе фотодинамического процесса, приводит к формированию окисленных форм липидов, взаимодействует с индольными кольцами гистидина, триптофана, гуанина, с SH-группами белков. Таким образом, в результате фотодинамического процесса нарушается структура и функция жизненно важных биомолекул, мембран, внутриклеточных.

51 органелл, что приводит к гибели клеток [Peng Q. et al., 199labRousseau J. et al., 1991].

Генерация синглетного кислорода зависит от фотофизических свойств фотосенсибилизатора и условий оксигенации ткани. Для перехода кислорода из основного триплетного состояния в синглетное, необходима энергия, равная 94 кДж/моль [Valenzeno D., 1987]. В фотодинамическом процессе эта энергия доставляется фотосенсибилизатором, который под воздействием света определенной длины волны возбуждается до высокоэнергетического состояния. Процесс передачи энергии показан на рис. 10.

Рис. 10 (по [Moan J., 1990]). синглетное состояние фотосенсибилизатора, А hv триплетное состояние фотосенсибилизатора.

94 кДж.

Окисление липидов гуанина триптофана гистидина.

Таким образом, эффективными фотосенсибилизаторами являются лишь те, которые способны испускать энергию более 94 кДж/моль, и иметь максимум поглощения при длине волны менее 850 нм [Moan J., 1990]. Для нормального протекания фотодинамического процесса важны и ряд других фотофизических параметров. Один из них — время жизни триплетного состояния фотосенсибилизатора. Если оно короткое, то триплет не сможет эффективно передавать свою энергию кислороду. Другой важный параметр — глубина проникновения света вглубь ткани. Свет с длиной волны, соответствующей красной части видимого спектра (600−850 нм), проникает более глубоко (около 1 см), чем свет, соответствующий более коротковолновой части спектра (400 600 нм), который проходит лишь в поверхностный слой ткани. Следовательно,.

52 фотосенсибилизаторы, имеющие максимум поглощения в районе 600−850 нм являются наиболее оптимальными для ФДТ и позволят лечить опухоли, находящиеся на глубине около 1 см от облучаемой поверхности [Moan J., 1990].

В основе темновой (каталитической) терапии опухолей лежит использование таких производных ФЦ, как ФЦ (Со) и ТФ (Со). Механизм цитотоксического действия данных ФЦ заключается в их избирательном накоплении в опухолевой ткани и повреждении клеток в результате комбинированного взаимодействия этих препаратов с восстановителем, например, с аскорбиновой кислотой [Gomer C.J. et al., 1984; Novodarova G.N. et al., 1996]. Однако, детальный механизм цитотоксического действия ФЦ (Со) и ТФ (Со) до настоящего времени неясен.

Применение фталоцианина Al в качестве противоопухолевого препарата в клинике.

Фталоцианин А1 в настоящее время проходит 1-ю фазу клинических испытаний в МНИОИ им. П. А. Герцена, Москва, Россия [Якубовская Р.И. и др., 1997]. Согласно результатам ФДТ, полной регрессии (ПР) опухоли удалось добиться в 68,1% случаев, частичной регрессии — в 25,5%, ограниченной регрессии — в 5%, терапевтический эффект отсутствовал лишь в 1,4% случаев. Наиболее эффективным метод ФДТ оказывается у больных базальноклеточным раком кожи (ПР в 96,9% случаев) и в группе пациентов с ранними формами рака полостных органов (ПР опухоли у 100% больных при раннем раке полости рта, трахеи, бронхов и мочевого пузыряу 89%) — при раннем раке пищеводау 75% - при раннем раке желудка) [Якубовская Р.И. и др., 1997].

Для проведения ФДТ в зависимости от локализации и размеров опухоли применяются три способа подведения лазерного источника излучения к пораженному участку ткани: поверхностное облучение, внутритканевое облучение с внедрением источника в опухолевую ткань и смешанное облучение. Для подведения света к опухолям внутренних органов применяются источники, введенные через канал фиброэндоскопа. Расчет дозы лазерного облучения осуществляется с учетом размеров, локализации опухоли, расстояния между световодом и поверхностью ткани. Основными параметрами воздействия являются: плотность поглощенной световой энергии (в Дж/см2), доза фотосенсибилизатора в (мг/кг), мощность излучения на выходе световода (в.

53 мВт), расстояние от световода до опухоли и диаметр светового пятна (в см), время облучения (в мин) [Якубовская Р.И. и др., 1997]. Условия клинических испытаний ФЦ (А1) в сравнении с фотофрином приведены в таблице 3.