Комплексный анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ) в качестве репортерного гена для молекулярной визуализации биологических процессов в злокачественных новообразованиях

Актуальность проблемы.

В настоящее время технология молекулярной визуализации («molecular imaging») является наиболее перспективной для изучения на молекулярном уровне патологических процессов, присходящих in vivo и приводящих к злокачественным новообразованиям. По мере развития этой технологии все большее значение приобретает её клиническое использование как для диагностики, так и для лечения больных с онкологическими заболеваниями. Лабораторное применение молекулярной визуализации для исследования патофизиологии опухолей является одним из основных источников информации о механизмах и путях регуляции практически всех значимых онкогенов и онкопротеинов [Tsien S. et al., 1995; Blasberg R. et al., 2002; Barnett E. et al., 2009]. Исследования факторов лекарственной устойчивости [Bigott Н. et al., 2005], неоангиогенеза [Rossin R. et al., 2007], роли цитокинов [Massague J., 2001], пролиферации [Solit D. et al., 2006] и метастазирования [Scholz М. et al., 2007] стали основными в последние годы.

Выделенный в отдельное направление около пятнадцати лет назад метод молекулярной визуализации основан на принципах фармакологии и на исследовании накопления и распределения в организме различных химических соединений [Phelps М. et al., 1979]. В настоящее время этот метод представляет собой сплав фармакологии и ядерной медицины, в котором велика доля методов клеточной и молекулярной биологии, а также химии и физики элементарных частиц [Hackman Т. et al., 2002]. Все большее значение начинают приобретать также математическое описание и оценка биологических процессов, что позволяет использовать различные способы анализа, основанные на реконструировании данных и их представления в легко читаемом формате [Zanzonico Р., 2006; Serganova I. et al., 2008].

Однако возникают существенные препятствия на пути использования этих методов в клинике, одно из них — иммунологическая реактивность человека к большинству репортерных белков. Поэтому особое значение (при лечении людей) имеют попытки использовать в методе визуализации белки человека.

В качестве одного из новых и перспективных белков для доклинической и клинической визуализации рассматривают транспортер норад-реналина человека (чНАТ). Этот белок прекращает передачу нервного импульса через норадреналиновые рецепторы путем быстрого захвата и переноса выделенного в межсинаптическое пространство норадреналина в пресинаптические терминалы. чНАТ осуществляет контроль опосредуемых норадреналином физиологических процессов и эффектов поведения.

В настоящее время клонированы гены белка HAT крысы, быка и человека. Экспрессия гена HAT у млекопитающих происходит почти исключительно в центральной и периферической симпатической нервной системе. Эта особенность явилась основой для предложений попытаться использовать ген чНАТ в качестве репортерного при различных злокачественных новообразованиях у экспериментальных животных и человека. Такой подход дает ряд преимуществ, главным из которых является то, что имеются тестированные и опробованные радиохимические маркеры, одобренные в ряде государств.

Основной этап исследований в данный момент — проведение доклинических исследований, направленных на изучение возможности использования белка чНАТ для его применения при визуализации клинически значимых патофизиологических параметров опухолевых клеточных популяций. Ключевое значение приобретает разработка новых радиоактивно меченых проб, которые были бы более безопасны и эффективны для применения как на лабораторных животных, так и, в дальнейшем, у больных в клинике.

Цель исследования.

Целью нашего исследования является анализ функции и свойств человеческого норадреналинового транспортера (чНАТ) для изучения перспектив его использования в качестве репортерного гена при визуализации биологических процессов, характерных для патофизиологии опухолевых клеток и тканей. Вначале эти исследования проводятся на экспериментальных животных, а затем — в доклиническом анализе и в клинической диагностике злокачественных новообразований у человека.

Конкретные задачи.

1. Создать стабильно экспрессирующие ген транспортера чНАТ клеточные линии и выяснить, накапливают ли трансдуцированные клетки радиоактивно меченые пробы в количествах, существенно больших и достаточных для визуализации метки in vivo по сравнению с клетками неонкогенного происхождения (отрицательный контроль).

2. Оценить, функционирует ли чНАТ в трансдуцированных опухолях, и провести сравнительные опыты по визуализации накопления.

123 124 меченых I и I проб белка при помощи однофотонного и позитронно-эмиссионного томографов.

3. Исследовать возможность использования оптических репортер-ных систем в качестве независимых контролей экспрессии конструкций, содержащих ген чНАТ, in vitro и in vivo.

4. Выяснить, имеется ли корреляция между увеличением интенсивности сигнала и уровнем пролиферации опухолевых клеток при использовании репортерной системы чНАТ.

5. Определить, можно ли визуализировать чНАТ-позитивные опухолевые клетки в процессе метастазирования.

Научная новизна.

При комплексном анализе человеческого норадреналинового транспортера (чНАТ) в злокачественных и нормальных клетках мыши, крысы, обезьяны и человека впервые получены следующие результаты.

Показано, что в клетках, трансдуцированных геном чНАТ, сохраняется его стабильная экспрессия в течение более двух лет.

Сконструированы синтезирующие белок чНАТ (позитивные) клеточные линии со склонностью к метастазированию.

Создан аналог норадреналина, меченый позитрон-испускающим изотопом йода — [1241]-тиеша-йодбензилгуанидин (МИБГ).

Проведено комплексное сравнение in vitro и in vivo используемой в клинике пробы, меченой позитрон-испускающим изотопом йода — [1241]-МИБГ.

Получены изображения чНАТ позитивных опухолей различной локализации с применением позитронно-эмиссионной томографии.

Разработана модель стимуляции метастатического распространения чНАТ-позитивных опухолей с последующей неинвазивной визуализацией метки in vivo.

Научно-практическая значимость.

Разработанные и оптимизированные чНАТ-содержащие репортер-ные системы позволяют проводить доклиническую и клиническую оценку ряда физиологических и патофизиологических процессов in vitro и in vivo с помощью новейших методов молекулярной визуализации, таких как ОФКТ и ПЭТ. Разработка нового радиоактивного препарата, с изотопом, разрешенным для клинического использования, способствовала активным усилиям по внедрению данной пробы в клиническую практику и для продолжения работы по изучению возможности создания более совершенных клинико-лабораторных радиоактивных препаратов на основе синтетического нордреналина. Очень важна также работа, направленная на изучение способов применения данного репортерного гена для решения различных лабораторных задач, таких как оценка миграции, селективности и пролиферации клеток-мишеней. Это придает данной работе статус универсального подхода к изучению любых других биологических процессов, выходящих за пределы раковых клеток, в частности, и онкологических заболеваний, в целом. Применение генов, белки которых облегчают оптическую визуализацию, предоставляет возможность независимой оценки экспрессии чНАТ и корреляции различных процессов в опухолях.

Внедрение в практику.

Содержащие ген чНАТ репортерные системы используют при различных моделях раковых заболеваний в отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и педиатрии Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического центра (МСКОЦ, Нью-Йорк, США). Радиоактивно меченая проба, [1241]-МИБГ, проходит в настоящее время процедуру официальной регистрации для внесения в список реагентов для клинического применения. Репортерную систему с геном чНАТ активно используют в доклинической практике для изучения возможности терапии лим-фомы, вызываемой вирусом Эпштейн-Барра, с помощью Т-лимфоцитов.

Место выполнения работы.

Работа выполнена на базе научно-клинических отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития (Москва, РФ) и на базе МСКОЦ (Нью-Йорк, США), в отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и радиохимии.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из Оглавления, Введения, Обзора литературы (96 источника), Методической части, пяти глав по результатам Собственных исследований и их обсуждения, Заключения, Выводов и Списка цитируемых публикаций. В тексте содержится 16 рисунков (диаграмм и фотографий), 1 таблица.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны и созданы генетические контрукции, кодирующие человеческий транспортер норадреналина (чНАТ), для использования его при динамической неинавазивной оценке различных патофизиологических процессов в опухолевых клетках с применением однофотон-ной и позитронно-эмиссионной томографии. Созданы ретровирусные носители для трансдукции клеток-мишеней.

2. Разработаны мультимодальные генетические конструкции, содержащие как ген чНАТ, так и ряд других генов для оптической визуализации (с помощью флуоресцентных маркеров, конфокальной микроскопии, проточной цитофлуорометрии и общей оценки флуоресцентного и биолюминесцентного сигналов in vitro и in vivo).

3. Сравнительный анализ распределения меченых радиоактивным йодом проб в клетках мыши (фибробласты), крысы (глиома), обезьяны (клетки опухоли почечной ткани) и человека (предшественники Т-лимфоцитов, нейробластома, фибробласты) показал, что накопление в нормальных клетках не отличается от отрицательных контролей, а соотношение накопления в чНАТ-позитивных и негативных клетках составляет от 45:1 до 150:1. Экспрессия гена чНАТ стабильна в течение двух лет наблюдений.

4. Показано преимущество впервые предложенной нами пози-трон-испускающеи пробы [1241]МИБГ перед клинически одобренной joi пробой [ ЦМИБГ, которое состоит в том, что возникает возможность использования позитронной томографии, а также в том, что период полураспада этого изотопа существенно больше. Возможность применить для визуализации меченой пробы позитронно-эмиссионный томограф позволяет определять клетки-мишени с высокой (до 1,8 мм) разрешающей способностью (по сравнению с 5−15 мм при однофотонной томографии), а использование долгоживущего изотопа позволяет проводить мониторинг в течение 96 ч и получать высокое соотношение специфического и неспецифического сигнала через 24 ч (30:1), 48 ч (90:1) и 72 ч (160:1).

5. чНАТ-негативные ткани не накапливают радиоактивно меченые пробы, а в тканях, естественно экспрессирующих ген чНАТ (сердце, надпочечники), радиактивность вначале накапливается до 4 ч после введения, а затем быстро и практически полностью к 12 ч выводится из организма.

6. При достаточно высоком уровне накопления радиоактивной пробы в чНАТ-позитивной модели in vivo возникает возможность проводить визуализацию не только значительной массы клеток, но и малых клеточных популяций.

7. Доказана возможность визуализации метастазов, состоящих из чНАТ-позитивных клеток.

Благодарности.

В заключение, я приношу глубокую благодарность моим руководителям за переданные знания и помощь. Я благодарен коллективу моей лаборатории, а особенно Инне Сергеевне Сергановой, за помощь в работе и опыт, которым они щедро делились со мной. Я благодарю моих оппонентов и рецензентов, а особенно Вернату Викторовну Гречко за советы и конструктивную критику моей работы.

Отдельно я благодарю мою семью за терпение и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В последнее десятилетие быстрое развитие получили молекуляр-но-генетические исследования в онкологии, направленные на изучение многочисленных, часто пересекающихся, путей регуляции при формировании злокачественных новообразований, особенно в таких разделах, как онкогенез и развитие опухолей.

Началась эра молекулярной медицины, и ее преимущества для пациентов будут очевидны в ближайшем будущем. В качестве примера можно привести высокую эффективность препарата Гливек (imatinib mesylate) в лечении ранее практически неизлечимых стромальных гастро-интерстициальных опухолей и хронического миелоидного лейкоза, механизм действия которого основан на избирательном взаимодействии с рецепторами мутированных или гиперэкспрессированных тирозинкиназ cKit u Bcr-Abl [Сельчук В.Ю., 2004].

Разработанные способы оценки механизмов клеточной активации, пролиферации, экспрессии генов пока не дают возможности проводить анализы, которые позволили бы получить в режиме реального времени информацию, имеющую принципиально важное значение для тактики лечения и прогноза онкологических больных. Развитие и клиническая адаптация использования репортерных генов является важным фактором развития таких многообещающих направлений современной медицины как генная терапия, адаптивная терапия, трансплантация стволовых клеток.

Генетическая визуализация живых организмов в качестве диагностической клинико-лабораторной процедуры также переживает значительный подъем и на данный момент может быть определена как макроскопическая визуализация процессов в клетке на молекулярном уровне в реальном времени.

Данная дисциплина уходит корнями, как в молекулярную биологию, так и в химию, в целом, и радиохимию, в частности.

Существуют три основные стратегии визуализации, основанные на «прямом» или «опосредованном» определении молекулярно-генетических процессов, а также, так называемая «суррогатная» визуализация биомаркеров, представляющая сочетание методов визуализации, созданных на основании использования радионуклидных, магнитно-резонансных и оптических систем.

На данный момент наиболее хорошо внедрены в клиническую практику методы «прямой» ядерной визуализации (nuclear imaging), основанные на использовании химических и радиохимических соединений: биоконъюгатов со специфическими свойствами образования комплексов с другими молекулами, содержащими парамагнитные частицы для ядерно-магнитной визуализации или радиоизотопов для позитронно-эмиссионной или однофотонной томографии.

Радиоактивно меченые пробы, основанные на «прямой» визуализации широко используют в отделениях радиологии. Современный уровень радиохимии позволяет разрабатывать химические пробы специфичные для отдельных групп белков, что дает возможность снизить уровень неспецифического накопления и получать четко различимый сигнал при низких дозах радиоактивности.

Однако не решенными остаются вопросы, связанные с применением различных белков в комплексе методов молекулярной визуализации, что представляет все больший интерес для фундаментальных и клинических исследований в гематологии, онкологии и иммунологии.

Тем не менее, подобная практика активно внедряется в настоящее время с целью скорейшего создания, тестирования и внедрения новых компонентов для визуализации, таких как активируемые ферментативные сигнальные системы, специфичные для определенных путей регуляции, а также веществ, имеющих узкоспецифическую реактивность к молекулам, таким как ДНК, мРНК и белки.

Однако, постоянным лимитирующим фактором для «прямой» визуализации является необходимость разработки проб, специфичных для каждой отдельной молекулы-мишени и для длительного тестирования, направленного на определение чувствительности, специфичности и безопасности данного соединения, перед разрешением к применению в клинической практике.

Принципиально важным вопросом в процессе клинической адаптации методов молекулярной визуализации является иммунореактив-ность применяемых репортерных белков. Наиболее распространенные пути решения данной проблемы — это разработка синтетических аналогов различных соединений и применение в качестве репортерных белков, имеющих человеческое происхождение.

Биомаркёрная, или «суррогатная», визуализация отражает внутренние молекулярно-генетические процессы и наиболее привлекательна для клинического внедрения в ближайшее время. Основанием для этого является наличие большого числа радиопрепаратов и существующих методов, которые можно применить для мониторинга на молекулярном уровне путей регуляции различных процессов, значимых для развития онкологических заболеваний. Пример подобного подхода — визуализация с помощью позитронно-эмиссионной томографии молекул глюкозы, меченых изотопом 18Б.

Следует отметить что «суррогатная» визуализация является менее специфичной и менее обеспеченной количеством различных проб, чем другие методы, но это в значительной степени компенсируется тем, что уже создано и тестировано большое число радиопроб, многие из которых в настоящее время внедрены в клиническую практику.

Данный вид визуализации лучше всего характеризуется результатами клинического применения позитронно-эмиссионной томографии молекул глюкозы, меченых изотопом 18Р для оценки развития и ответа на терапию различных опухолей. Разработка новых методов биомаркерной визуализации на основе уже одобренных для клинического применения радиопроб и контрастёров более оперативно решаемая задача, чем внедрение любых других методов визуализации, таких как визуализация репортерных генов или «прямая» визуализация.

Исследования в области визуализации репортерных генов на данный момент ограничены, практически, использованием лабораторных животных, поскольку необходимо создать и использовать клеточные культуры, экспрессирующие специфические генетические конструкцииальтернативой для этого является только создание специальных линий трансгенных животных, несущих необходимые векторы в своем геноме.

Идеальных генетических векторов для избирательной визуализации процессов в конкретных органах и тканях (в частности опухолевой) на данный момент не существует, но ведутся их активные поиски в области генетической терапии. Следует отметить, что каждый новый вектор требует тщательного и длительного тестирования для получения разрешения применять его в клинической практике. Тем не менее, визуализация репортерных генов, особенно экспрессированных в специально созданных клеточных линиях, имеет ряд преимуществ. На данный момент имеется три хорошо изученных репортерных гена — симпортер натрия и йода (чНИС), транспортер норадреналина (чНАТ) и соматоста-тиновый репортер 2 (Ъ88ТЕ12), для которых разработаны радиопробы, одобренные для клинического применения с использованием позитронно-эмиссионной и однофотонной томографии. Данные пары (ген + проба) являются отличными кандидатами для визуализации репортерных генов у больных. Важно отметить, что репортеные гены человеческого происхождения, как мы уже отмечали, вызывают значительно менее выраженный иммунный ответ, чем те репортерные гены, которые в данный момент используются для опытов у лабораторных животных (вирусные ферменты, люциферазы и флуоресцентные белки). Следует также отметить, что одна и та же пара ген-проба может быть использована для визуализации различных репортерных систем и, следовательно, для оценки различных биологических и молекулярно-генетических процессов.

В случае одобрения «репортерной пары» (ген — проба) основное внимание разрешающих организаций будет обращено на генетическую последовательность вектора, частью которого является репортерный ген, который и будет использован для трансдукции репортерных клеточных линий или тканей как ex vivo, так и ш vivo.

Основным лимитирующим фактором для перевода «репортерной» визуализации в клинику является необходимость проведения трансдукции (чаще всего, с помощью вирусных носителей — для достижения высокой эффективности) клеточных линий. Начало новому направлению современной функциональной диагностики положила разработка методик неинвазивной визуализации различных молекулярно-биологических процессов в режиме реального времени на основе репортерных систем, экспрессирующих тимидинкиназу вируса простого герпеса первого типа (ТКВПГ1, ТК) в качестве репортерного гена. Эти тест-системы позволили определить локализацию и количественно оценить степень и длительность экспрессии репортерного гена in vivo с помощью рутинного клинического радиологического оборудования, такого как гамма-камера или ПЭТ. Применение данной методики в целях мониторинга молеку-лярно-биологических процессов в Т-лимфоцитах позволяет определить локализацию и оценить их функциональное состояние (активацию, анергию, апоптоз) в организме животного или человека, что и явилось одной из ключевых задач данной диссертационной работы. Исследования вариантов применения репортерных генов, в целом, и ядерных ре-портерных генов для оценки специфической активации, миграции и пролиферации Т-лимфоцитов представляет огромный интерес для клинической практики. Отсутствие эффективных методик оценки функционального состояния Т-клеток in vivo в режиме реального времени требует разработки новых методов мониторинга их локализации и функции in vivo.

Основная задача нашей работы состояла в разработке и оптимизации тест-системы для неинвазивной визуализации различных клеточных линий in vivo с помощью транспортера норадреналина человека (чНАТ). Это, в принципе, могло бы помочь контролировать эффективность новых методов иммунотерапии в гематологии, онкологии и иммунологии, а также визуально отслеживать миграцию и пролиферацию различных клеточных образований.

В результате нашего исследования был сконструирован, получен и апробирован репортерный химерный ген hNET-IRES-GFP, который можно использовать для динамической прижизненной оценки различных молекулярно-биологических процессов с использованием флуоресцентной, конфокальной микроскопии и FACS in vitro и in situ, а также гамма-камеры и ПЭТдля неинвазивной визуализации этих процессов in vivo. Этот репортерный ген можно использовать также при разработке и оценке других репортерных систем с целью мониторинга различных молекулярно-биологических процессов in vitro и in vivo.

Далее нами показано, что функциональная активность системы hNET-IRES-GFP in vitro вполне пригодна для ПЭТ-визуализации и оценки жизнеспособности клеток, трандуцированных этим геном in vivo, с помощью чрезкожной (поверхностной) оптико-флуоресцентной визуализации (GFP-флуоресценции), индуцированной источником голубого света. Для исследования этой проблемы мы создали ряд клеточных линий, трансдуцированных химерным геном ЫчЕТ-ШЕБ-ОРР. Изучали линии как онкогенного, так и нормального происхождения — для оценки вероятных различий в экспрессии и функционировании системы. Многие линии были использованы впервые.

Основой проведенного исследования являлись последовательные сканирования экспериментальных животных на однофотонном и пози-тронно-эмиссионном томографах. Цель этих опытов — показать возможность в течение длительного времени оценивать уровень накопления радиоактивных маркеров в чНАТ-позитивных опухолях и обосновать подходы для использования технологии ПЭТ при визуализации данных проб. Впервые показано, что функция чНАТ может быть определена с высокой точностью и специфичностью в отдаленные сроки после однократной инъекции радиоактивной пробы.

Важным этапом нашей работы было изучение возможности использовать впервые синтезированный в МСКОЦ синтетический норад-реналин, меченый излучающим позитроны изотопом 1241 ([1241]МИБГ). На момент исследования в клинической практике применяли только синтетический норадреналин, меченный изотопом [1231], что не позволяло применять позитронно-эмиссионную томографию. [1241]МИБГ, в отличие от [1231]МИБГ, излучает позитроны с высокой энергией и его можно детектировать при помощи значительно более чувствительного метода — позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). После публикации наших исследований началась процедура сертификации синтетиче.

124 т ского норадреналина, меченого изотопом I, что позволит переити к применению его в клинике. Важно отметить еще одно важное, помимо.

124 т эмиссии протонов, преимущество, которое имеет изотоп I — время его периода полураспада больше, что позволяет проводить оценку его накопления в течение более длительных периодов времени, уже после выведения большей части неспецифической радиоактивности.

На заключительном этапе был разработан и экспериментально апробирован метод, позволяющий оценивать пролиферацию и метастази-рование различных клеточных линий, трансдуцированных химерным геном ЬЫЕТ-ЖЕЗ-ОРР, на основе визуализации радиоактивно меченой пробы — синтетического норадреналина. Показано, что возможна четкая визуализация небольших групп клеток (на примере метастатической модели карциномы легких). Это позволяет надеяться на применение чНАТ для оценки жизнеспособности, пролиферации и миграции небольших клеточных популяций как для диагностики онкологических заболеваний, так и для оценки эффективности клеточной терапии.

Учитывая то, что естественная экспрессия чНАТ происходит только в нервных клетках, а также то, что он имеет человеческое происхождение (а это определяет его специфичность и относительно низкую иммунореактивность), использование этого маркера в клинической практике как репортерного гена для ПЭТ-визуализации опухолей, развивающихся из предшественников нервной ткани (нейробластома, фео-хромоцитома), а также при проведении клеточной и генной терапии, представляется весьма перспективной и реально выполнимой задачей.

Как минимум, две разновидности репортерных конструкций будут востребованы в ближайшем будущем для «репортерной» визуализации. Одна из них — постоянно экспрессирующиеся векторы, которые могут быть использованы для идентификации места, длительности и срока доставки вектора и трансдукции тканей или для определения миграции, распределения мишеней репортерных клеток. Их можно использовать для определения длительности переживания (присутствия) терапевтических клеток при адаптивной терапии.

Вторая разновидность — системы с «включаемой» экспрессией, которые будут чувствительны к наличию и/или активации внутренних транскрипционных факторов, необходимых для регуляции различных процессов, а также для белковых взаимодействий, которые имеют значение в регуляции, функции и биологической активности репортерных клеток.

Вначале использование таких двойных репортерных систем в клинике, скорее всего, будет определяться участием в генетической и адаптивной терапии с применением собственных клеток больного (Т-клеток, клеток-предшественников и т. д.) в качестве репортерных. Для этого клетки будут выделены и трансдуцировны ex vivo специфической конструкцией, а затем введены обратно пациенту. С нашей точки зрения, адаптивная Т-клеточная терапия может значительно выиграть от возможности визуализации миграции, активации, пролиферации и сохранения эффекторных клеток. Все это процессы вполне могут быть визуализированы с помощью серии позитронно-эмиссионных сканирований пациентов [Ширяев C.B., 2004].

Возможность визуализировать транскрипционную и пост-транкрипционную регуляцию эндогенной экспрессии гена-мишени, так же как и внутриклеточного белкового взаимодействия, является весьма перспективной и в будущем предоставит новые возможности для лечения пациентов, включая визуализацию «фенотипа» опухолевых клеток на молекулярном уровне и его изменения во времени. Очень важна возможность мониторинга лекарственного эффекта узкоспецифичных препаратов на молекулярном уровне, за счет изучения различных путей регуляции культур опухолевых клеток, взятых от пациентов.

Развитие данного комплекса методов в клинике будет зависеть от того, как быстро будут созданы «диагностические» генетические конструкции, несущие репортерные гены для создания репортерных клеточных линий, но можно быть уверенным, что в ходе развития «прямой» и «непрямой» визуализации в ближайшее десятилетие эти проблемы будут успешно решены.