Таксономическое изучение дрожжей Williopsis, Zygowilliopsis и Saccharomyces, выделенных из природных источников на Дальнем Востоке

Дрожжевые организмы широко распространены в природе. Большая часть видов или групп видов имеют высокоспециализированные места обитания. Знание природного местообитания и особенностей экологической ниши способствует более полному пониманию биологии вида, его роли в экосистемах и может быть также использовано в биодиагностических целях и для направленного поиска нужных организмов в природе. В природных экосистемах дрожжи тесно ассоциированы с живыми растениями или их мертвыми остатками, позвоночными и беспозвоночными животными. Везде, где есть высшие растения, мхи или лишайники, есть и сопутствующие им дрожжевые грибы, которые используют эти растения как местообитание и источник пищи.

Природа Дальнего Востока большей частью сохранилась в нетронутом человеческой деятельностью виде. Обладая своеобразной, богатой и эндемичной флорой и фауной, эта территория представляет большой интерес для изучения биоразнообразия дрожжей. В отличие от других регионов мира, территория Дальнего Востока является малоизученной. В России большая часть исследований по таксономическому составу дрожжевых организмов в наземных экосистемах проводилась в европейской части. Однако даже немногочисленные работы свидетельствуют об уникальности видового состава дрожжей Дальнего Востока (Кудрявцев, 1936; Наумов, 1988, 1990а, бГолубев, 19 926- Бабьева, Решетова, 1996 Ыаитоуе1а1., 1993, 1995Ь).

Эколого-таксономическое изучение дрожжевой микрофлоры Дальнего Востока позволило выявить особенности географического распространения и таксономический состав базидиомицетовых дрожжей. Многие виды были ранее обнаружены в Японии и неизвестны из других регионов мира (Голубев, 19 926- Бабьева, Решетова, 1996). Особо следует отметить работы по обнаружению и выделению природных популяций дрожжей, обитающих в сокотечениях широколиственных деревьев. Исследования, проводимые на протяжении ряда лет, позволили изолировать и изучить большое количество штаммов дрожжей БассИаготусез из различных географически удаленных друг от друга регионов, включая и Дальневосточную Азию (Каитоу е1 а!., 1993, 1996, 1997, 1998; Наумов,.

1999). Интенсивное изучение дрожжей Saccharomyces позволило наряду с дикими видами S. cerevisiae и S. paradoxus обнаружить и описать новые виды этого рода в данном регионе (Naumov et al., 2000bНаумов и др., 2003).

Дрожжи, образующие сатурновидные споры, имеются в составе разных родов: Williopsis, Saccharomycopsis, Pichia и Satamispora (Kurtzman, Fell, 1998). Видовой состав этих родов часто пересматривается в результате появления новых критериев, позволяющих оценивать филогенетическое родство. Род Williopsis Zender включает пять видов: W. californica, W. mucosa, W. pratensis, W. salicorniae и W. saturnus с пятью разновидностями (var. saturnus, var. mrakii, var. sargentensis, var. suaveolens, var. subsufficiens). В то же время сравнение последовательностей генов 18S и 26S рРНК выявило значительную дивергенцию дрожжей W. californica, W. mucosa, W. pratensis, W. salicorniae и W. saturnus (Liu, Kurtzman, 1991; Yamada et al., 1994, 1995; James et al., 1998). На основании значительных отличий последовательностей рДНК и морфолого-физиологических особенностей был создан новый род Komagataea с видом К. pratensis и восстановлен род Zygowilliopsis Kudriavzev с видом Z. californica. Необходимость восстановления последнего рода была ранее обоснована гибридологическим анализом (Наумов, 1980). Согласно гибридологическому анализу, видовой статус имеют дрожжи W. saturnus, W. beijerinckii, W. mrakii, W. sargentensis, W. suaveolens и W. subsufficiens (Наумов и др., 1981; Вустин и др., 1982; Вустин, Наумов, 1984; Наумов, 1987).

В современной систематике дрожжей широко используются различные молекулярно-биологические методы, позволяющие одновременно изучать большое количество штаммов. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В зависимости от целей исследования можно использовать различные праймеры, позволяющие проводить идентификацию как различных видов, так и отдельных штаммов. В таксономии дрожжей часто применяется сравнительный анализ последовательностей рибосомальных генов, который в отличие от ДНК-ДНК реассоциации, позволяет оценивать родство дрожжей как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях (Kurtzman, Robnett, 1997, 1998; Fell et al., 2000).

Следует отметить, что анализ последовательностей рибосомальных генов раньше применялся на ограниченном количестве штаммов УУШюрз1 $ и 2у? амИИор818, в основном на типовых культурах.

Цель настоящей работы — молекулярно-генетическое исследование дрожжей родов ЗассИаготусея, 1? ИИор$ 1з и Ху^о^ИИор818, выделенных на Дальнем Востоке.

Обзор литературы посвящен современным молекулярно-биологическим подходам и методам, используемым в настоящее время в таксономии дрожжевых грибов, систематическому положению изучаемых родов дрожжей, а также экологии и географии дрожжей-аскомицетов Дальневосточной Азии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. СИСТЕМАТИКА ИЗУЧАЕМЫХ РОДОВ ДРОЖЖЕЙ.

Первая классификация, которая объединила дрожжи, формирующие споры в восемь родов семейства Saccharomycetaceae, была предложена Hansen (1904). С тех пор систематика дрожжей претерпевала многочисленные изменения.

В последующие годы было опубликовано несколько классификаций спорообразующих и аспорогенных дрожжей (Ciferri, Redalli, 1929; Stelling-Dekker, 1931; Lodder, 1934; Diddens, Lodder, 1942; Gaumann, 1964), каждая из которых на определенном этапе внесла вклад в развитие таксономии дрожжей. Среди наиболее известных классификаций следует упомянуть системы Lodder, Kreger-van Rij (1952) и Кудрявцева (1954). Первая базировалась на морфологических и физиологических свойствах дрожжей, вторая, кроме морфологических и физиологических признаков, также учитывала экологические особенности видов: приуроченность к определенным условиям обитания и соответствующие биохимические характеристики. В определителе дрожжи разделены на два типа или филума — Ascomycota и Basidiomycota в царстве Mycota (Kurtzman, Fell, 1998; Kurtzman, 2000a). Ниже приведено положение дрожжей-аскомицетов в общей системе грибов (царство, тип, класс, порядок, семейство, род).

Mycota.

Ascomycota.

Archiascomycetes.

Schizosaccharomycetales Schizosaccharomycetaceae Schizosaccharomyces Taphrinales Taphrinaceae Taphrina Lalaria Protomycetales Protomycetaceae Protomyces Saitoella Pneumocystidales Pneumocystidaceae Pneumocystis.

Euascomycetes.

Endomyces Oosporidium Hemiascomycetes Saccharomycetales Ascoideaceae Ascoidea Cephal oascaceae Cephaloascus Dipodascaceae Dipodascus Galactomyces Sporopachyderm ia Stephanoascus Wickerhamiella Yarrowia Zygoascus.

Endomycetaceae Saccharomycodaceae.

Endomyces Hanseniaspora.

Helicogonium Nadsonia.

Myriogonium Saccharomy codes.

Phialoascus Wickerhamia.

Trichomonas cus Saccharomycopsidaceae.

Eremotheciaceae Ambrosiozyma.

Eremothecium Saccharomycopsis.

Coccidiascus Candidaceae.

Lipomycetaceae Aciculoconidium.

Babjevia Arxula.

Dipodascopsis Blastobotrys.

Lipomyces Botryozyma.

Zygozyma Brettanomyces.

Metschnikowiaceae Candida.

Clavispora Geotrichum.

Metschnikowia Kloeckera.

Saccharomycetaceae Myxozyma.

Arxiozyma Schizoblastosporion.

Citeromyces Sympodiomyces.

Cyniclomyces Trigonopsis.

Debaryomyces.

Dekkera.

Issatchenkia.

Kl uyveromyces.

Lodderomyces.

Pachysolen.

Pichia.

Saccharomyces.

Saturnispora.

Torulaspora.

Williopsis.

Zygosaccharomyces.

Среди аскомицетовых дрожжей выделяют три класса. К классу Hemyascomycetes отнесены почкующиеся дрожжи и дрожжеподобные таксоны, такие как Ascoidea и Cephaloascus, в классе Euascomycetes представлены мицелиальные виды, часть из которых диморфные, аски почти всех видов формируются внутри или на поверхности плодового тела, класс Archiascomycetes включает такие таксоны как Schizosaccharomyces, Taphrina, Lalaria, Protomyces, Saitoella и Pneumocystis.

1.1. Saccharomyces.

Род Saccharomyces Meyen ex Reess был описан в 1838 году с единственным видом пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Первоначально это название использовалось по отношению ко всем дрожжам, выделенным из спиртных напитков. Спустя 32 года Reess (1870) дал более точное определение рода Saccharomyces и включил его в Ascomycetes. В качестве диагностических характеристик указывались такие, как способность формировать примитивный псевдомицелий, многостороннее почкование и наличие от 1 до 4 аскоспор в образующихся сумках. В дальнейшем в роде Saccharomyces было описано более ста новых видов. В ранг новых видов возводили штаммы различных производств, при этом дрожжи-сорняки имели свои видовые названия. Первый определитель дрожжей включал 44 вида рода Saccharomyces (Guiliiermond, 1914). В дальнейшем род Saccharomyces подвергался многочисленным таксономическим ревизиям. В монографии Stelling-Dekker (1931) данный род включает уже только 23 вида, которые разделены на два подрода Saccharomyces и Zygosaccharomyces. Большинство из этих видов были признаны в первом издании определителя дрожжей, составленного голландской коллекцией Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) (Lodder, Kreger-van Rij, 1952). Во втором издании определителя дрожжей (van der Walt, 1970) количество видов увеличилось до 41. Van der Walt разделил род Saccharomyces на четыре группы видов по ферментационным, ассимиляционным, морфологическим и физиологическим свойствам. Одна из групп, Saccharomyces sensu stricto, была представлена диплонтами с активным брожением. Остальные три группы включали виды, не близкородственные S. cerevisiae.

Изучение генетических и молекулярно-биохимических свойств дрожжей привело к новому пересмотру систематики рода Saccharomyces. Была показана мутационная изменчивость биохимических признаков и необъективность видовой дифференциации, основанной на их использовании. В результате в следующем определителе дрожжей (Yarrow, 1984) все виды Saccharomyces sensu stricto были отнесены к синонимам S. cerevisiae. Однако позднее, с помощью гибридологического анализа и ДНК-ДНК реассоциации было установлено, что некоторые синонимы S. cerevisiae представляют собой самостоятельные виды.

Гибридологический анализ основан на изучении (1) жизнеспособности полового потомства — аскоспор гибридов с тест-штаммами различных биологических видов и (2) возможности обмена генами — рекомбинации контрольных ауксотрофных маркеров (Наумов, 19 796- Наумов и др., 1983; Naumov, 1987, 1996). Для гибридологического анализа используются только родительские штаммы с высокой выживаемостью аскоспор. Фертильность гибридов и нормальное расщепление контрольных маркеров свидетельствуют о принадлежности штаммов к одному биологическому виду, а стерильность гибридов или очень низкая жизнеспособность аскоспор указывают на разные виды. Данные генетического анализа таких родов как Saccharomyces, Metschnikowia и Kluyveromyces позволили сформулировать генетическую концепцию рода у дрожжей как группы скрещивающихся видов, гибриды которых размножаются вегетативно (Наумов, 1978).

Еще в 1939 году (Winge, Laustsen, 1939) было предложено использовать способность к скрещиванию и выживаемость продуктов мейоза (аскоспор гибридов) для разграничения видов Saccharomyces. Однако в скрещиваниях были использованы исходные природные или производственные штаммы, а не специально полученные от них инбредные линии, характеризующиеся высокой выживаемостью спор (Наумов и др., 1983). Известно, что природные и производственные штаммы часто обладают пониженной выживаемостью аскоспор (Johnston, 1965; Наумов, 1969; Anderson, Martini, 1975; Spencer, Spencer, 1977), которая определяется многими генетическими факторами, в частности нечетной полиплоидией, анеуплоидией, наличием в гетерозиготном состоянии рецессивных деталей и полулеталей, делеций, инверсий. В этих случаях родительские споры генетически разнокачественны и их суммарная выборка не может характеризовать споры, взятые в скрещивание. Для получения высокофертильных родительских культур у гомоталличных дрожжей достаточно провести последовательные клонирования от одной споры, у гетероталличных необходимы внутритетрадные скрещивания. С помощью таких операций элиминируются факторы летальности и повышается выживаемость аскоспор (Инге-Вечтомов, 1963; Наумов, 1969). По фертильности гибриды сравнивают с инбредными родительскими линиями.

Использование генетических методов в классификации дрожжей комплекса Saccharomyces sensu stricto позволило выявить синонимы биологического вида S. cerevisiae (Наумов и др., 1983). В 1967 году на материале ряда штаммов были описаны дрожжи S. cerevisiae var. terrestris, обитающие в почве и лесной подстилке (Jensen, 1967). Эти дрожжи отличались от штаммов S. cerevisiae местообитанием в природе и при скрещивании с ними давали стерильные гибриды (Наумов, 19 796). В соответствии с биологической концепцией вида (Майр, 1971) было высказано предположение о том, что почвенные сахаромицеты и дрожжи S. cerevisiae, выделяемые из забродивших субстратов, представляют собой различные биологические виды: для них характерна как экологическая, так и генетическая репродуктивная изоляция. Было предложено возобновить почвенный таксон как самостоятельный вид S. terrestris (Jensen) G. Naumov (Наумов, 1979a). Позднее, на основании гибридологического анализа музейных культур и природных изолятов было установлено, что такие таксономические виды как S. paradoxus Batschinckaja (Бачинская, 1914), S. cerevisiae var. tetrasporus (Bejerinck ex Dekker) Phaff et al. (1956) и S. terrestris (Jensen) G. Naumov (Наумов, 1979a) принадлежат к одному биологическому виду S. paradoxus (Наумов, 1986).

Экспериментальные данные свидетельствуют о принадлежности дрожжей рода Saccharomyces, выделяемых из природы (сокотечений дуба, насекомых, почвы), в основном к самостоятельному биологическому виду S. paradoxus Batschinckaja. Позднее были обнаружены редкие природные популяции дрожжей биологического вида S. cerevisiae в Сибири, Японии и США (Наумов, Никоненко, 1988а, бНаумов, Наумова, 1991; Naumov et al., 1993, 1998).

Дикие дрожжи S. paradoxus из сокотечений широколиственных деревьев и почв являются не единственным таксоном, родственным культурным дрожжам S. cerevisiae Hansen. В свое время были обнаружены штаммы NRRL Y-969 и IAM 4009 (Bicknell, Douglas, 1970; Ouchi et al., 1970), имеющие 40−70% гомологии геномов с дрожжами S. cerevisiae, определяемой по ДНК-ДНК реассоциации. Позднее обнаружены еще два штамма CBS 380, 395, отличающихся по ДНК-ДНК реассоциации от S. cerevisiae: 30% гомология ДНК (Rosini et al., 1982).

Применение метода ДНК-ДНК реассоциации (Vaughan-Martini, Kurtzman, 1985) и гибридологического анализа (Naumov, 1987; Наумов, Никоненко, 1987; Наумов, 1988) позволило идентифицировать еще один биологический вид S. bayamis.

При изучении изолятов дрожжей из экспедиционных сборов (проведенных в 1936 году) Института микробиологии АН СССР, был выявлен штамм Saccharomyces ВКМ Y-1146, который не относился к биологическим видам S. cerevisiae и S. paradoxus. Штамм был выделен с ягод культурного винограда A.A. Имшенецким и описан В. И. Кудрявцевым (1954). На основании гибридологического анализа эти дрожжи были отнесены к биологическому виду S. bayanus Saccardo 1895 (Наумов, Никоненко, 1987).

Таким образом, применение генетического анализа у дрожжей Saccharomyces sensu stricto позволило идентифицировать три биологических вида: S. cerevisiae, S. paradoxus, S. bayanus (Naumov, 1987). На основании гибридологического анализа, молекулярного кариотипирования и секвенирования гена 18S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) были описаны еще три вида двойника S. cariocanus, S kudriavzevii и S. mikatae (Naumov et al., 2000b).

Данные генетического анализа хорошо согласуются с результатами ДНК-ДНК реассоциации. ДНК-ДНК реассоциация (20%) выявила низкую степень родства между S. cerevisiae и S. bayanus (Martini, Kurtzman, 1985). Самостоятельность вида S. paradoxus также подтверждена определением гомологии ядерной ДНК, которая у штаммов S. paradoxus составляет 79−99%, ас S. cerevisiae, S. pastorianus и S. bayanus — соответственно 46−59, 8−29 и 0−34% (Martini, 1989). Полученные данные свидетельствуют о значительной дивергенции видов-двойников комплекса Saccharomyces sensu stricto. Изучение генома S. pastorianus (syn. S. carlsbergensis) показало, что он имеет высокую гомологию с S. cerevisiae и S. bayanus (57 и 72% соответственно) и, по всей видимости, представляет собой естественный гибрид последних двух видов. Изучение штаммов S. pastorianus, изолированных в условиях виноделия и пивоварения, также свидетельствует о высокой степени гомологии их геномов. Так ДНК-ДНК реассоциация с видом S. cerevisiae составляет 19−71%, а с S. bayanus 67−78% (Vaughan Martini, Martini, 1987).

Позже на основании изучения кариотипов нескольких штаммов S. pastorianus было выявлено, что одна часть хромосом этих дрожжей близка по размерам соответствующим хромосомам S. cerevisiae, а вторая — хромосомам S. bayanus. Это согласуется с гибридным происхождением данного таксона (Наумова и др., 1991).

В определителе (Kurtzman, Fell, 1998) род Saccharomyces включает 14 видов дрожжей: S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus, S. pastorianus, S. barnetti, S. castelli, S. dairenensis, S. exiguus, S. kluyveri, S. rosinii, S. servazzii, S. spencerorum, S. transvaalensis, S. unisporus.

В настоящее время широкое применение для идентификации и классификации дрожжей получили различные молекулярные методы, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Этот метод позволяет одновременно изучать большое количество штаммов. В зависимости от целей исследования используют различные праймеры. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование определенного фрагмента ДНК с помощью ДНК-полимеразы (Mullis, Falcona, 1987; Weising et al., 1995). Различают два основных типа праймеров: геноспецифичные, направленные на известную нуклеотидную последовательность (геноспецифичная ПЦР) и неспецифичные праймеры (RAPD-PCR, микрои минисателлиты и другие), ненаправленные на какой-либо ген и имеющие случайную последовательность нуклеотидов (Булат, Мироненко, 1996).

Использование ПЦР с неспецифическими минии микросателлитными праймерами позволяет дифференцировать дрожжи как на видовом, так и на штаммовом уровнях. Тандемно организованные повторяющиеся последовательности ДНК различных типов широко представлены в эукариотических геномах. Они варьируют по длине кластера и размеру повторяющегося звена. Минисателлитные и микросателлитные ДНК являются наиболее полиморфными и их изменчивость проявляется, в частности, в аллельных вариациях числа повторяющихся звеньев (Рысков, 1999).

Минисателлиты характеризуются размером повторяющегося мономерного звена в интервале 6−100 п.н. и длиной кластера 0.2−20 т.п.н. Большинство из них относится к GC-типу, но известны и АТ-обогащенные варианты. Содержание различных классов и типов минисателлитов широко варьирует, составляя от нескольких сотен до нескольких тысяч копий на геном. Некоторые из них имеют преимущественно теломерную локализацию, тогда как другие равномерно распределены по геному (Рысков, 1999).

Микросателлиты характеризуются короткими мотивами, сравнительно низкой степенью повтора и распространением по всему геному дрожжей (Lieckfeldt et al., 1993; Weising et al., 1995). Характерные размеры мономерного звена микросателлитов — 2−6 п.н., кластера — 20−60 п.н. (Рысков, 1999). Использование техники RAPD (randomly amplified polymorphic DNA — «случайно амплифицированная полиморфная ДНК») и микросателлитных праймеров позволяет изучить генетическую изменчивость дрожжей на популяционном уровне. Микросателлитный праймер (GTG)5 был использован для идентификации индивидуальных штаммов и дифференциации видов-двойников рода Saccharomyces: S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus и S. paradoxus. С помощью этого праймера была проанализирована структура европейской популяции дрожжей S. paradoxus (Naumova et al., 2000). Ранее с помощью изоферментного и гибридологического анализов были изучены европейская, северо-американская, дальневосточная и гавайская популяции дрожжей S. paradoxus (Naumov et al., 1997aНаумов, 1999). В более поздней работе с использованием RAPD-PCRанализа было установлено, что первые три популяции также отличаются по ПЦР-профилям (Fernandez — Espinar et al., 2003).

В 1990 году была разработана модификация ПЦР техники с использованием праймеров, не направленных на какой-либо ген: УП-ПЦР или ПЦР с универсальными праймерами (Булат, Мироненко, 1990). Для УП-ПЦР используются более длинные праймеры в 15−20 нуклеотидов оригинального дизайна (Булат и др., 1992; Булат, Мироненко, 1996). Универсальные праймеры состоят из двух частей: консервативной (5'-конец, 6−10 нуклеотидов) и вариабельной (3'-конец, 8−10 нуклеотидов). Консервативная последовательность служит для стабилизации отжига праймера, т.о. обеспечивая образование ПЦР-продуктов на ДНК различных организмов (Bulat et al., 1998). Основным свойством ПЦР с универсальными праймерами является видоспецифичность амплифицированной ДНК, т. е. сходство ПЦР-профилей организмов в пределах биологического вида.

Использование УП-ПЦР и электрофоретического анализа ферментов продемонстрировало пригодность этих молекулярных методов для дифференциации близкородственных видов комплекса Saccharomyces sensu stricto.

Полученные результаты хорошо согласуются с данными гибридологического анализа, секвенирования района 18S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS), а также с данными ДНК-ДНК реассоциации (Naumova et al., 2003а).

В настоящее время для идентификации и классификации дрожжей используется рестриктазный анализ амплифицированных некодирующих участков рРНК: внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2, а также межгенного спейсера 2 (IGS2). Размер спейсеров и их нуклеотидная последовательность коррелирует с видовой принадлежностью изолятов. При этом наблюдается видоспецифичный рестриктазный профиль спейсерных областей при минимальном внутривидовом полиморфизме (Chen, 1992; Chen et al., 1992).

Амплификация гена 5.8S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 (5.88-ГГ8-фрагмент) и последующий рестриктазный анализ позволяют дифференцировать близкородственные виды комплекса Saccharomyces sensu stricto. Размер района ITS одинаков у видов Saccharomyces sensu stricto, примерно 850 п.н. (Valente et al., 1996). Виды Saccharomyces sensu lato значительно отличаются по длине амплифицированных 5.88−1Т8-фрагментов (от 700 до 875 п.н.), а также по рестриктазным профилям (Fernandez-Espinar et al., 2000). Виды Saccharomyces sensu stricto также отличаются рестриктазным анализом района IGS2 (Molina et al., 1993; Nguyen, Gaillardin, 1997). Рестриктазный анализ района IGS2 рДНК выявил две группы штаммов внутри вида S. bayanus (Nguyen, Gaillardin, 1997). В первую вошли типовые культуры S. bayanus, S. globosus, S. heterogenicus, S. intermedius var. valdensis и S. inusitatus, а во вторую — типовая культура S. uvarum, S. abuliensis и многочисленные винные штаммы S. bayanus (syn. S. uvarum). Две группы также отличаются по кариотипам и по последовательностям ITS1 и ITS2 рДНК (Naumov et al., 2000а). Изучение ряда физиологических характеристик у представителей групп «bayanus» и «uvarum» дало основания высказать мнение о необходимости восстановления вида S. uvarum (Rainieri et al., 1999). Позже на основании гибридологического анализа было установлено, что гибридные штаммы с тестером S. bayanus (MCYC 623), несмотря на высокий уровень ДНК-ДНК-гомологии (86−100%) родителей, дают пониженную фертильность (9−39%). Это свидетельствует о частичной генетической изоляции между двумя группами дрожжей. Было предложено рассматривать эти две группы как разновидности таксона S. bayanus: S. bayanus var. bayamis и S. bayanus var. uvarum (Наумов, 2000). Разновидности S. bayanus var. bayanus, S. bayanus var. uvarum также можно дифференцировать с помощью RAPD-PCR-анализа (Fernandez-Espinar et al., 2003).

Для изучения дрожжей широко применяется молекулярное кариотипирование (пульс-электрофорез), представляющее собой электрофоретическое разделение в агарозном геле нативных хромосомных ДНК согласно их размерам (Carie, Olson, 1984; 1985; Schwartz, Cantor, 1984; Zimmermann, Fournier, 1996; Belloch et al., 1998; Naumova et al., 1993; Naumov, Naumova, 2002). В зависимости от числа и размера хромосом в результате электрофореза получается специфический профиль хромосомных полос штамма. Хромосомы дрожжей имеют размеры от нескольких сотен до нескольких тысяч пар нуклеотидов.

Проведение кариотипического анализа большого количества штаммов вида S. cerevisiae и двух его видов двойников S. paradoxus и S. bayanus показало, что все три вида обладают одинаковым числом хромосом, равным 16 (Naumov et al., 1992а). Электрофоретические кариотипы диких штаммов S. cerevisiae и S. paradoxus практически идентичны, тогда как S. bayanus и S. cariocanus обладают видоспецифичным кариотипом.

В свое время было предложено использовать в дрожжевой таксономии Саузерн-гибридизацию со специфическими клонированными генами (Seehaus et al., 1985). Саузерн-анализ видов-двойников Saccharomyces sensu stricto с использованием генетических маркеров для каждой из 16 хромосом S. cerevisiae, показал, что S. cerevisiae, S. paradoxus и S kudriavzevii имеют одинаковый порядок и размер гомологичных хромосом, тогда как у остальных трех видов размеры отдельных гомологичных хромосом отличаются от таковых у S. cerevisiae (Naumov et al., 2000b). Дрожжи комплекса Saccharomyces sensu stricto легко отличимы по своим кариотипам от дрожжей Saccharomyces sensu lato (Vaughan-Martini et al., 1993; Naumov et al., 1995cPetersen et al., 1999), это позволяет идентифицировать дрожжи Saccharomyces, выделяемые из природы (Naumov et al., 1992b). Использование метода пульс-электрофореза дало возможность выявить значительную гетерогенность двух видов комплекса Saccharomyces sensu lato: S. exiguus и S. dairensis (Naumov et al., 1995c). Полученные кариотипические данные хорошо согласуются с исследованиями по ДНК-ДНК реассоциации и с анализом последовательностей генов рДНК. На основании ДНК-ДНК-реассоциации гетерогенного комплекса S. exiguns были описаны два новых вида S. spencerorum и S. barnettii, имеющие всего 30% гомологии с типовым штаммом S. exiguous (Vaughan-Martini, 1995).

В систематике дрожжей широко используется сравнительный анализ последовательностей рибосомальных генов (Kurtzman, Robnett, 1995, 1997, 1998; Fell et al., 2000). Анализ последовательностей генов рРНК, в отличие от ДНК-ДНК реассоциации позволяет оценивать родство дрожжей как на видовом, так и на более высоких таксономических уровнях.

Выбор того или иного гена или участков РНК для секвенирования очень важен для молекулярной таксономии (Kurtzman, 2000аValente et al., 1999). Ген 5S рРНК благодаря своей консервативной природе и небольшому размеру стал первым рибосомальным геном, используемым для установления родства организмов. Так, изучение последовательностей этого гена у аскомицетов позволило выделить три филогенетические дивергентные группы: делящиеся дрожжи, почкующиеся дрожжи и мицелиальные грибы (Walker, Doolittle, 1982; Walker, 1985). В систематике обычно анализируются более информативные и менее консервативные молекулы, такие как 18S и 26S рРНК. Анализ этих молекул широко применяется для изучения родов и видов дрожжей (Peterson, Kurtzman, 1991; Cai et al., 1996; James et al., 1998). Секвенирование гена 18S рРНК позволило пересмотреть систематическое положение некоторых таксонов внутри рода Saccharomyces (James et al., 1997), описать новые виды (S. kunashirensis, S. martiniae) и дифференцировать представителей комплекса Saccharomyces sensu stricto и Saccharomyces sensu lato (Ando, 1996; Oda et al., 1997, 1999; Mikata et al., 2001). Анализ 26S рРНК также используется для установления близкородственных связей на родовом или видовом уровнях. Секвенирование вариабельного района, расположенного на 5'- конце 26S рРНК (300 нуклеотидов) показало, что данный фрагмент обладает достаточной изменчивостью для разделения близких видов родов Issatchenkia, Pichia и Saccharomyces (Peterson, Kurtzman, 1991). Конспецифичные штаммы отличаются не более чем по двум парам нуклеотидов. Позднее для анализа дрожжей на видовом уровне стали использовать вариабельный участок D1/D2 размером примерно 600 нуклеотидов. Секвенирование типовых культур всех известных видов аскомицетовых дрожжей показало, что различия в шесть и более нуклеотидов в районе D1/D2 указывают на принадлежность изучаемых штаммов к различным видам, в то время как конспецифичные штаммы обычно имеют идентичные последовательности или отличаются 1−3 нуклеотидами. Тем не менее, штаммы, имеющие от 0 до 5 нуклеотидных замен не обязательно относятся к одному и тому же виду (Kurtzman, Robnett, 1998; Kurtzman, 2000а).

Для разделения близкородственных таксонов (виды-двойники и разновидности) применяется анализ последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 (James et al., 1998). Два новых вида S. kunashirensis и S. martiniae были выделены из кариотипически гетерогенного таксона S. dairensis на основании секвенирования последовательностей 18S рРНК (James et al., 1997), а виды — S. imisporiis и S. cervazii, имеющие сходные кариотипы (Naumov et al., 1995c), филогенетически более близки друг другу, чем к другим видам рода Saccharomyces (Kurtzman, Robnett, 1991). Позднее рядом авторов были описаны еще пять видов Saccharomyces: S. bulderi, S. naganishii, S. humaticus, S. yakushimaensis, S. turicensis (Middelhoven et al., 2000; Mikata et al., 2001).

Проведенный Kurtzman и Robnett (1998) анализ домена D1/D2 26S рДНК у всех известных на тот период видов аскомицетовых дрожжей позволил разделить их на одиннадцать кладов. Клад Saccharomyces наряду с дрожжами Saccharomyces sensu stricto и Saccharomyces sensu lato включил в себя также представителей родов Arxiozyma, Eremothecium, Hanseniaspora (анаморфа, Kloeckera), Kluyveromyces, Torulaspora, Zygosaccharomyces и другие.

Недавно Kurtzman и Robnett (2003) провели комплексный мультигенный филогенетический анализ (18S, ITS, 5.8S и 26S рДНКEF — la, a также анализ последовательности митохондриальной ДНК), на основании которого 75 видов «клада Saccharomyces» разделились на 14 кластеров. Виды Saccharomyces sensu stricto сформировали отдельный кластер. Все остальные представители рода Saccharomyces распределились между четырьмя другими кластерами. Однако статистическая поддержка последних кластеров невысокая и составляет 58−87% (Kurtzman, Robnett, 2003). Представители родов Kluyveromyces, Zygosaccharomyces и других также распределились между различными кластерами. На основании 14 кластеров были сформированы роды Saccharomyces, Kazachstania, Tetrapisispora, Kluyveromyces, Eremothecium, Hanseniaspora, Saccharomycodes и описаны новые роды Lachancea, Nakaseomyces, Naumovia, Vanderwaltozyma и Zygotorulaspora. В настоящее время род Saccharomyces Meyen ex Reess представлен шестью видами: S. bayanus, S. cariocanus, S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus и гибридным таксоном S. pastorianus (Kurtzman, 2003). Все остальные виды, ранее входившие в комплекс Saccharomyces sensu lato распределились между тремя родами: Kazachstania (S. servazzii, S. unisporus, S. transvaalensis, S. martiniae, S. spencerorum, S. rosinii, S. kunashirensis, S. exiguous, S. turicensis, S. bulderi, S. barnettii), Lachancea (S. kluyveri) и Naumovia (S. castellii, S. dairenensis).

ВЫВОДЫ.

1. Наряду с дрожжами биологических видов Saccharomyces cerevisiae и S. paradoxus в Дальневосточной Азии впервые обнаружены дикие дрожжи S. bayanus.

2. Рестриктазный анализ ПЦР-амплифицированных 5.88-ГГ8-фрагментов позволил дифференцировать дрожжи с сатурновидными спорами родов Williopsis, Zygowilliopsis и Komagataea. Шесть видов-двойников комплекса Williopsis sensu stricto неразличимы рестриктазным анализом.

3. Минисателлитный праймер М13 рекомендован для идентификации видов W. saturnus, W. beijerinckii, W. mrakii, W. sargentensis, W. suaveolens и W. subsufficiens, а также для обнаружения новых таксонов комплекса Williopsis sensu stricto.

4. Штаммы Williopsis CBS 1669, CBS 6291 и IFO 1776, обладающие уникальными ПЦР-профилями с минисателлитным праймером М13 и отличающиеся по последовательностям ITS 1 и ITS2 рДНК представляют собой новые таксоны. Три японских штамма переопределены как W. saturnus и W beijerinckii. Три штамма с сатурновидными спорами, изолированные нами на Дальнем Востоке России идентифицированы как W. suaveolens.

5. Филогенетическим анализом нуклеотидных последовательностей домена D1/D2 26S рДНК показано, что род Zygowilliopsis не является монотипичным. На материале японских изолятов обнаружено два новых вида Zygowilliopsis sp. 1 (штаммы IFO: 1771, 1880, 1881, 1882) и Zygowilliopsis sp. 2 (IFO 1767).

6. С помощью сравнительного анализа 5.88−1Т8-фрагментов и секвенирования рибосомальных последовательностей рДНК выявлен значительный генетический полиморфизм дрожжей Z. californica. Показано, что вид Z. californica включает в себя три таксона, соответствующих рангу разновидностей.

7. Установлено, что различные молекулярные методы не всегда дают сопоставимые результаты. На примере дрожжей Williopsis sensu stricto и Zygowilliopsis видна необходимость использования различных молекулярных, генетических и фенотипических методов для идентификации и классификации дрожжей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Род Saccharomyces в настоящее время включает шесть видов: S. bayanus, S. cariocanus, S. cerevisiae, S. kitdriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus и гибридный таксон S. pastorianus (Kurtzman, 2003). Космополитный вид S. cerevisiae содержит, в основном, культурные штаммы, хотя известны и его дикие популяции из Японии, Дальнего Востока и Сибири, а также США (Naumov, 1996; Sniegowski et al., 2002). В природе повсеместно встречается дикий вид S. paradoxus, обитающий преимущественно в сокотечениях широколиственных деревьев, а также в почве. Последний вид представлен дивергировавшими популяциями: европейской, дальневосточной, гавайской и северо-американской (Naumov et al., 1993, 1997а, 1998; Наумов, 1999). Генофонд культурных дрожжей сахаромицетов включает виды S. cerevisiae, S. bayanus и гибридный таксон S. pastorianus.

С помощью молекулярно-генетического анализа нам удалось обнаружить на Дальнем Востоке три биологических вида рода Saccharomyces. Четыре изолированных нами (3.00, 22.00, 159.01, 163.01) и два северо-корейских штамма (CCY 21−4-89, CCY 21−4-93) отнесены к виду S. cerevisiae. Один штамм (61.02) идентифицирован как S. paradoxus и два (136.01, 148.01) как S. bayanus.

Разработана новая методология молекулярной дифференциации видов рода Saccharomyces на основе рестриктазного анализа амплифицированных 5.8S-ITS-фрагментов рДНК. С помощью эндонуклеаз НаеIII и Hpall можно различить виды S. cerevisiae, S. paradoxus и S. bayanus. Обнаружено полное соответствие молекулярной и генетической идентификации штаммов Saccharomyces. При этом рестриктазный анализ амплифицированных 5.88−1Т8-фрагментов имеет ряд преимуществ по сравнению с гибридологическим анализом. Последний метод применим только для спорулирующих фертильных культур, а рестриктазный анализ не зависит от споруляции и позволяет быстро проводить идентификацию большого количества штаммов дрожжей.

Особо следует отметить обнаружение нами на Дальнем Востоке криофильного вида S. bayanus. В Европе этот вид, как правило, ассоциирован с алкогольными ферментационными процессами при низких температурах: производства сладких и игристых вин, сидра (Naumov et al., 2000а, 2001а, b). До настоящего времени были известны только пять природных изолятов S. bayanus из Испании, Словакии, США и Венгрии (Santa Maria, 1978; Naumov et al., 1992a, b, 1996; Naumov, 1996; Tornai-Lehoczki et al., 1996; Наумов, 2000).

Надо отметить, что оба штамма S. bayanus выделены нами из сокотечений вяза Ulmus pumila. Ранее один штамм S. bayanus был изолирован из сокотечения граба Carpinus betulus в Венгрии (Наумов, 2000). Из 50 сокотечений дубов Quercus robur, О. mongolica, О. rubra, Q. alba в Восточной Европе, на Кавказе, Дальнем Востоке и в Северной Америке ранее были выделены только дрожжи S. paradoxus и S. cerevisiae (Naumov et al., 1996, 1997a, 1998). По-видимому, дрожжи S. bayanus ассоциированы с сокотечениями определенных широколиственных деревьев. Большую роль в распространении этого криофильного вида, очевидно, играет сезонный и географический температурный фактор. Наконец, выявлению дрожжей S. bayanus в накопительных культурах должна способствовать температура ниже 20 °C. Адаптивное значение у дрожжей S. bayanus может иметь активная а-галактозидаза (ген MEL). Обращает на себя внимание, что в США из сокотечений вяза Ulmus carpinifolia был тоже выделен штамм, сбраживающий мелибиозу, но другого вида — S. paradoxus (Naumov et al., 1997). Для последних дрожжей это крайне редкий признак.

Полученные нами результаты и литературные данные (Naumov et al., 2000b) свидетельствуют о необычном разнообразии дрожжей Saccharomyces в Дальневосточной Азии. Из шести известных видов Saccharomyces в этом регионе обнаружено пять: S. bayanus, S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus. Принимая это во внимание, целесообразно продолжить поиск новых видов этого рода в указанном регионе.

Методом рестриктазного анализа амплифицированного фрагмента рДНК, включающего ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 мы изучили 53 штамма дрожжей с сатурновидными спорами. Показано, что с помощью эндонуклеаз НаеIII и Mspl можно дифференцировать дрожжи W. mucosa, W. salicorniae, Zygowilliopsis californica, Komagataea pratensis и Williopsis sensu stricto. Предложено использование минисателлитного праймера М13 для разделения видов-двойников Williopsis sensu stricto, имеющих идентичные рестриктазные профили. Использование ПЦР с праймером М13 позволило провести реидентификацию ряда музейных штаммов, определить видовую принадлежность выделенных нами на Дальнем Востоке дрожжей с сатурновидными спорами, а также обнаружить три штамма, представляющих собой новые таксоны. Последние штаммы (CBS 1669, CBS 6291 и IFO 1776) имеют уникальные ПЦР-профили и отличаются по нуклеотидным последовательностям участков ITS1 и ITS2 рДНК от других представителей комплекса Williopsis sensu stricto.

Из шести известных видов Williopsis sensu stricto на Дальнем Востоке мы обнаружили три — W saturnus, W saaveolens и W. beijerinckii, редкие случаи выделения последнего вида были известны только из почв южного полушария (Вустин, Бабьева, 1981; Вустин и др., 1982; Бабьева, Решетова, 1996). В среднеевропейской части России дрожжи Williopsis sensu stricto представлены в основном популяциями вида W. suaveolens, тогда как на юге европейской части России (Краснодарский край) преобладающим является вид W. saturnus (Наумов и др., 1985, 2000; Голубев, Вдовина, 1973).

Обнаружен значительный молекулярно-генетический полиморфизм дрожжей Zygowilliopsis. Филогенетический анализ домена D1/D2 26S рДНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 свидетельствуют о том, что род Zygowilliopsis не является монотипичным. На материале японских изолятов обнаружено два новых вида Zygowilliopsis sp. 1 (штаммы IFO: 1771, 1880, 1881, 1882) и Zygowilliopsis sp. 2 (IFO 1767).

Полученные нами результаты и имеющиеся литературные данные (Наумов и др., 1981, 1985; Kurtzman, 1991; Liu, Kurtzman, 1991; Kurtzman, Robnett, 1998) свидетельствуют о том, что вид Z. californica также генетически неоднороден и включает в себя три таксона соответствующих рангу разновидностей: Z. californica var. californica, Z. californica var. dimennae и Z. californica var. fukushimae. Указанные разновидности частично генетически изолированы. Они образуют между собой полустерильные гибриды с мейотической рекомбинацией контрольных маркеров (Наумов и др., 1981, 1985).

Обращает на себя внимание большое научное значение дрожжей Zygowilliopsis. Анализ полученных нами и литературных данных позволяет говорить об ограниченности филогенетической концепции вида. На дрожжах Zygowilliopsis вскрылось противоречие между различными молекулярными подходами в видовой идентификации дрожжей. Филогенетическая концепция вида, основанная на сравнении нуклеотидных последовательностей рибосомальных генов, может противоречить определению видового родства на основе ДНК-ДНК реассоциации. Несмотря на 96−100%-ную ДНК-ДНК реассоциацию (Kurtzman, 1991), три разновидности Z. californica значительно отличаются по последовательностям ITS1 и ITS2 рДНК: 14−26 нуклеотидных замен. Тогда как у частично генетически изолированных разновидностей дрожжей Kluyveromyces laciis, имеющих более низкий уровень ДНК-ДНК реассоциации (64−78%), отличия по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 составляют только 1−3 нуклеотида (Naumova et al., 2004b). С другой стороны, виды-двойники Williopsis sensu stricto, обладающие значительной дивергенцией геномов по данным ДНК-ДНК реассоциации и образующие стерильные межвидовые гибриды имеют довольно сходные последовательности ITS1 и ITS2: различия не превышают семи нуклеотидных позиций.

С точки зрения генетики, даже 100%-ная реассоциация ДНК не может гарантировать конспецифичность штаммов. На примере дрожжей Z. californica видна высокая разрешающая способность генетического анализа, позволяющего идентифицировать частично изолированные популяции, а также необходимость применения различных молекулярных методов для идентификации и классификации дрожжей.