Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Структурно-функциональные исследования тройного элонгационного комплекса РНК-полимеразы E. coli

Диссертация: Структурно-функциональные исследования тройного элонгационного комплекса РНК-полимеразы E. coli
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Бактериальные и эукариотические РНКП представляют собой многосубъеденичные молекулы, значительный размер и сложная организация которых делают невозможным получение кристаллографической структуры с высоким разрешением. Использвание альтернативных методов для определения структурных элементов молекулы РНКП, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, и выяснение их функциональной роли дало бы… Читать ещё >

Содержание

  • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Краткие сведения о транскрипционном цикле
      • 1. 1. 1. Инициация
      • 1. 1. 2. Элонгация
      • 1. 1. 3. Терминация
    • 1. 2. Традиционные представления о структуре тройного комплекса и механизме элонгации транскрипции
      • 1. 2. 1. Величина участка ДНК, закрываемого молекулой РНК-полимеразы в элонгационном комплексе
      • 1. 2. 2. Величина расплетенного участка ДНК и наличие РНК-ДНК гетеродуплекса в элонгационном комплексе
      • 1. 2. 3. Положение каталитического центра относительно расплетенного участка ДНК
    • 1. 3. Природа стабильности ТЭК
    • 1. 4. Механизм факторнезависимой терминации
      • 1. 4. 1. Роль вторичной структуры РНК в терминации
      • 1. 4. 2. Роль олиго-Т-последовательности в терминации
      • 1. 4. 3. Понятие о сайтах связывания РНК-продукта
      • 1. 4. 4. Реитеративный синтез РНК на промоторе. Стабилизация инициационных комплексов, содержащих короткие РНК
      • 1. 4. 5. ДНК-РНК гетеродуплес в ТЭК
    • 1. 5. Генетические данные, свидетельствующие о роли доменов ?- и ?'- субъединиц РНКП в элонгации
      • 1. 5. 1. Нарушение элонгационных и терминационных свойств
  • РНКП с помощью мутаций
    • 1. 5. 2. Роль «цинкового пальца» в связывании РНКП с нуклеиновым кислотами
    • 1. 5. 3. Значение NADF-района для элонгации
    • 1. 6. Пространственная структура РНК-полимеразы E. col

Структурно-функциональные исследования тройного элонгационного комплекса РНК-полимеразы E. coli (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Удлинение РНК-транскрипта осуществляется в тройном элонгационном комплексе (ТЭК), состоящем из молекулы РНК-полимеразы (РНКП), ДНК-матрицы и РНК-продукта. Во время элонгации РНКП обладает двумя на первый взгляд противоречивыми свойствами: она прочно связывает РНК-продукт и ДНК-матрицу и одновременно свободно скользит вдоль ДНК. Эти два свойства определяют исключительную процессивность РНКП, т. е. способность транскрибировать длинные участки ДНК, не теряя матрицу и транскрипт.

Важно отметить, что РНКП на стадии инициации, узнавая определенные последовательности промотора, ведет себя как сайт-специфичный ДНК-связывающий белок. При переходе от стадии инициации к элонгации РНКП должна претерпевать значительные изменения в природе взаимодействий с матрицей и РНК. Когда транскрипционный комплекс покидает промотор, он приобретает устойчивость к воздействию высоких концентраций моновалентных солей, что указывает на неионную природу взаимодействий на стадии элонгации.

Бактериальные и эукариотические РНКП представляют собой многосубъеденичные молекулы, значительный размер и сложная организация которых делают невозможным получение кристаллографической структуры с высоким разрешением. Использвание альтернативных методов для определения структурных элементов молекулы РНКП, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, и выяснение их функциональной роли дало бы возможность понять природу стабильности и процессивности ТЭК и, возможно, объяснить механизмы регуляции транскрипции на стадии элонгации.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы являлось определение структурных элементов РНКП из Escherichia coii, отвечающих за стабильность и процессивность ТЭК в процессе элонгации.

В работе ставились следующие задачи: 1) биохимически охарактеризовать основные элементы РНКП, отвечающие за связывание нуклеиновых кислот в ТЭК (ДНКи РНК-связывающие сайты) — 2) с помощью методов аффинной модификации локализовать участки субъединиц РНКП, вовлеченные в образование ДНКи РНК-связывающих сайтов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Выявлены и охарактеризованы следующие структурно-функциональные элементы ТЭК: ДНК-связывающий сайт (ДСС), РНК/ДНК-гибрид-связывающий сайт (ГСС) и РНК-связывающий сайт (РСС). ДСС неионно взаимодействует с 9 п.о. ДНК-дуплекса сразу спереди от положения активного центра фермента. ГСС ионно взаимодействует с сегментом РНК/ДНК-гибрида длиной примерно в 6 п.о. от положения -5 до +1, считая от 3'-конца РНК. РСС образует неионные контакты с участком однонитевой РНК, длиной 9−11 нуклеотидов, сразу выходящей из РНК/ДНК-гибрида.

С помощью методов аффинной модификации и картирования РНК-белок и ДНК-белок сшивок были идентифицированы участки субъединиц РНКП, вовлеченные в образование каждого сайта. Показано, что амино-концевой район (З'-субъединицы (метионин 29 цистеин 58) и карбокси-концевой район р-субъединицы (метионин 1232 -метионин 1273) вовлечены в образование как РСС, так и ДСС. Карбокси-концевой район р-субъединицы (метионин 1232 — метионин 1273), вместе с тем, участвует в образовании ГСС. В состав ДСС также вовлечен амино-концевой район р-субъединицы (метионин 130 -метионин 239).

Результаты данной работы позволили предложить структурно-функциональную модель ТЭК, согласно которой совокупность взаимодействий между РНК, ДНК и белком в каждом из трех сайтов необходима и достаточна для полной стабильности и процессивности ТЭК. При этом, РСС и ДСС структурно и функционально интегрированы, т. е. нарушение одного из этих сайтов ведет к инактивации другого. Модель предполагает, что взаимодействия в ГСС являются сравнительно слабыми и достаточны лишь для поддержания целостности ТЭК в условиях низкой ионной силы.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 86 страницах машинописного текста и содержит 13 рисунков и 1 таблицу. Библиография включает в себя 93 названия.

выводы.

1. Биохимически охарактеризованы основные функциональные элементы РНК-полимеразы, отвечающие за стабильность и процессивность тройного элонгацинного комплекса: ДНК-связывающий сайт (ДСС) и РНК-связывающий сайт (РСС).

2. С помощью методов аффинной модификации и ограниченного протеолиза идентифицированы участки субъединиц РНК-полимеразы, вовлеченные в образование РСС: район между метионином 29 и цистеином 58 в р' -субъединице и район между метионином 1243 и метионином 1304 в р-субъединице.

3. С помощью методов аффинной модификации и ограниченного протеолиза уточнена локализация района р'-субъединицы РНК-полимеразы (Мет 29- Цис 58), участвующего в формировании ДСС.

4. Показано, что мотив «цинкового пальца» в амино-концевом районе р'-субъединицы РНК-полимеразы необходим для поддержания стабильности и процессивности ТЭК.

5. Предложена структурно-функциональная модель ТЭК, основанная на пространственной интеграции ДСС и РСС, позволяющая объяснить механизмы регуляции транскрипции на стадии элонгации.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Allison, L.A., Moyle, М., Shales, A. and Ingles, C.J. (1985). Extensive homology among the largest subunits of eucaryotic and procaryotic RNA polymerases. Cell 42, 599−610.
  2. Altmann, C.R., Solow-Cordero, D.E., and Chamberlin, M.J. (1994). RNA cleavage and chain elongation by Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase in a binary enzyme-RNA complex. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91,3784−3788.
  3. Arndt, К. M., and Chamberlin, M. J. (1990). RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase. Factors affecting the stability of elongating ternary complex J. Mol. Biol. 213, 79 108.
  4. Bently, D.L., and Groudine, M. (1986). A block to elongation is largely responsible for decreased transcription of c-myc in differentiated HL60 cells. Nature 321, 702−706.
  5. Bertrand, К., Korn, L., Lee, F. and Yanofsky, C. (1978). The attenuator of the tryptofan operon of E.coii. Heterogeneous З'-OH termini in vivo and deletion mapping of functions. J.Mol.Biol. 117, 227−247.
  6. Borukhov, S., Sagitov, V., Josaitis, C. A., Gourse, R. L., and Goldfarb, A. (1993). Two Modes of Transcription Initiation at the rrnB P1 Promoter of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268, 23 477−23 482.
  7. Burgess, R. R., and Jendrisak, J. J. (1975). A procedure for the rapid, large-scale purification of Escherichia co/i DNA-dependent RNA polymerase involving polymin P precipitationn and DNA-cellulose chromatography. Biochemistry 14, 4634−4638.
  8. Bustby, S., Spassky, A., and Buc, H. (1981). Eur.J.Biochem. 118, 443 451.
  9. Carpousis, A. J., and Gralla, J. D. (1980). Cycling of ribonucleic acid polymerase to produce oligonucleotides during initiation in vitro at the lacUV5 promoter. Biochemistry 19, 3245−3253.
  10. Chamberlin, M.J., and Berg, P. (1964). Mechanisms of RNA polymerase action: characterization of the DNA-dependent synthesis of polyadenylic acid. J. Mol. Biol. 8, 708−726.
  11. , M. (1995). New models for the mechanism of transcription elongation and its regulation. The Harvey Lect. 88, 1−21.
  12. Chan, C.L., and Landick, R. (1989). The Salmonella typhymurium his operon leader region contains an RNA-hairpin dependent transcription pause site. J.Biol.Chem. 264, 20 769−20 804.
  13. Chan, C.L., and Landick, R. (1994). New perspectives on RNA chain elongation and termination by E. co/i RNA polymerase. In Transcription: Mechanisms and Regulation, R. C. Conavay and J. W. Conaway, eds. (New York: Raven Press), pp. 297 321.
  14. Cheng, S., Lynch, E., Leason, K., Court, D., Shapiro, B., and Friedman, D. (1992). Functional importance of sequence in the stem-loop of a transcription terminator. Science 254, 1205−1207.
  15. Clerget, M., Weisberg, R.A., and Jin, D.J. (1995). A zinc binding region in the p' subunit of RNA polymerase is involved in antitermination of early transcription of phage HK 022. J.Mol.Biol.
  16. Darst, S., Edwards, A.M., Kubalek, E.W., and Kornberg, R.D. (1991). Three-dimensional structure of yeast RNA polymerase II at 16 A resolution. Cell 66, 121−128.
  17. Darst, S., Kubalek, E. W., and Kornberg, R. D. (1989). Three-dimensional structure of E. co/i RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature 340, 730−732.
  18. Dieci, G., Denmat, S.H., Lukhtanov, E., Thuriaux, P., Werner, M., and Sentenac, A. (1995). A universally conserved region of the largest subunit participates in the active site of RNA polymerase III. EMBO J. 14, 3766−3776.
  19. Eick, D. and Borncamm, G.W. (1986). Transcriptional arrest within the first exon is a fast control mechanism in the c-myc gene expression. Nucleic1. Acids Res. 14, 8331−8345.
  20. Farnham, P. J. and Piatt, T. (1980). A model for transcription termination suggested by studies on the trp attenuator in vitro using base analogs. Cell 20, 945−951.
  21. Farnham, P. J., and Piatt, T. (1981). Rho-dependent termination: dyad simmetry in DNA causes RNA polymerase to pause during transcription in vitro. Nucleic Acids Res. 9, 563−577.
  22. Fisher R. F., and Yanofsky C. (1983). Mutations of the (3 subunit of RNA polymerase alter both transcription pausing and transcription termination in the trp operon leader region in vitro. J. Biol. Chem. 258, 8146−8150.
  23. Fisher R. F., and Yanofsky C. (1983). A complementary DNA oligomer releases a transcription pause complex. J. Biol. Chem. 258, 9208−9212.
  24. Fox, C.F., Gumport, R.I. and Weiss, S.B. (1965). J. Biol. Chem. 240, 2101−2109.
  25. Gamper, H.B., and Hearst, J.E. (1982). A topological model for transcription based on unwinding angle analysis of E. coii RNA polymerase binary, initiation and ternary complexes. Cell 29, 81−90.
  26. Guo, H.-C,. and Roberts, J.W. (1990). Heterogeneous initiation due to slippage at the bacteriophage 82 late gene promotor in vitro. Biochemistry 29, 10 702 10 709.
  27. Hanna, M.M., and Meares, C.F. (1983). Synthesis of a cleavable dinucleotide photoaffinity probe of ribonucleic acid polymerase: application to trinucleotide labeling of an Escherichia coli transcription complex. Biochemistry 22, 3546−3551.
  28. Hanna, M.M., and Meares, C.F. (1983). Topography of transcription: pass of the leading end of nascent RNA through the Escherichia coli transcription complex. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 4238−4242.
  29. Harley, C.B., Lawrie, J., Boyer, H.W. and Hedgpeth, J. (1990). Reiterative copying by E. coli RNA polymerase during transcription initiation of mutant pBR322 tet promoter. Nucleic. Acids Res. 18, 547−552.
  30. Hinkle, D. C., Mangel, W. F., Chamberlin, M. J. (1972). Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. IV. The effect of rifampicin on binding and on RNA chain initiation. J. Mol. Biol. 70, 209−220.
  31. Jacques, J.-P., and Susskind, M.M. (1990). Pseudo-templated transcription by Escherichia coli RNA polymerase at a mutant promoter. Genes & Dev. 4, 1801−1810.
  32. Johnson, T.L., and Chamberlin, M.J. (1994). Complexes of yeast RNA-polymerase II and RNA are substrates for TFIIS-indused RNA cleavage. Cell77, 217−224.
  33. Johnston, D., and McClure, W. (1976). Abortive initiation of in vitro RNA synthesis on bacteriophage DNA, pp. 413−428. In R. Losick and M. Chamberlin (ed.), RNA polymerase, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
  34. Kainz M., and Roberts, J. (1992). Structure of RNA and DNA chains in paused transcription complexes containing Escherichia co/i RNA polymerase. Science 255, 838−841.
  35. Kao, S.Y., Caiman, A.F., Luciw, P.A., and Peterlin, B.M. (1987). Anti-termination of transcription within the long terminal repeat of HIV-1 by tat gene product. Nature 330, 489−493.
  36. Kashlev, M., Martin, E., Polyakov, A., Severinov K., Nikiforov V., Goldfarb, A. (1993). Histidine-tagged RNA polymerase: dissection of the transcription cycle using immobilized enzyme. Gene 130, 9−14.
  37. Kassavetis, G. A. and Chamberlin, M. J. (1981). Pausing and termination of transcription within the early region of bacteriophage T7 DNA in vitro. J. Biol. Chem. 256, 2777−2786.
  38. Korzheva, N., Mustaev, A., Nudler, E., Nikiforov, V. and Goldfarb, A. (1998). Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coii RNA polymerase. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. in press.
  39. Krakow, J. S., Rhodes, G. T., and Jovin, M. (1976). p. 127−157. RNA polymerase: catalytic mechanisms and inhibitors. In R. Losick and M. Chamberlin (ed.), RNA polymerase, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
  40. Krumm, A., Meulia, T., and Groudine, M. (1993). Common mechanism for the control of eukaryotic transcription elongation. BioEssays 15, 659−665.
  41. Kumar, S.A., and Krakow, J.S. (1975). Studies on the product binding site of the Azotobacter vinelandii ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 250, 2878−2884.
  42. Macdonald L., Zhou, Y., and McAllister, W. (1993). Termination and slippage by bacteriophage T7 RNA polymerase. J.Mol.Biol. 232, 1030−1047.
  43. Maniatis, T., Fritch, E. F., Hayward, R. S. (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
  44. Martin, F. H., and Tinoco, I. Jr. (1980). DNA-RNA hybrid duplexes containing oligo (dA:rU) sequences are exceptionally unstable and may facilitate termination of transcription. Nucleic Acids Res. 8, 2295−2299.
  45. Matsuzaki, H., Kassavetis, G.A., and Geiduschek, E.P. (1994). Analisis of RNA chain elongation and termination by Saccharomyces cerevisiaeRH/K polymerase III. J.Mol.Biol. 235, 1173−1192.
  46. Melnikova, A.F., Beabealashvilli, R., and Mirzabekov, A.D. (1978). Astudy of unwinding of DNA and shielding of the DNA grooves by RNA polymerase by using metilation with dimethylsulphate. Eur. J. Biochem. 84, 301−309.
  47. Metzger, W., Schicor, P. and Heumann, H. (1989). A cinematographic view of Escherichia coli RNA polymerase translocation. EMBO J. 8, 27 452 754.
  48. Pavco, P.A. and Steege, D.A. (1990). Elongation by Escherichia coli RNA polymerase is blocked in vitro by a site-specific DNA binding protein. J. Biol. Chem. 265, 9960 9969.
  49. , T. (1986). Transcription termination and the regulation of gene expression. Annu. Rev. Biochem. 55, 339 372.
  50. Platt, T. and Richardson, J.P. (1992). E. coii Rho factor: protein and enzyme of transcription termination. In Transcription regulation (McKnight, S.L. & Yamamoto, K.R., eds). pp. 365−388, Cold Spring Harbor Lab. press, Cold Spring Harbor, NY.
  51. Polyakov, A., Severinova, E., Darst, S.A. (1995). Three-dimensionalstructure of E. coli core RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme. Cell 83, 365−373.
  52. Rhodes, G., and Chamberlin, M. J. (1974). Ribonucleic acid chain elongation by Escherichia coli ribonucleic acid polymerase. I. Isolation of ternary complexes and the kinetics of elongation. J. Biol. Chem. 249, 66 756 683.
  53. Reynolds, R., and Chamberlin, M.J. (1992). Parameters affecting transcription termination by Escherichia coli RNA polymerase. Constraction and analysis of hybrid terminators. J.Mol.Biol. 224, 53−63.
  54. Reynolds, R., Bermudez, C.R.M. and Chamberlin, M.J. (1992). Parameters affecting transcription termination by Escherichia coli RNA polymerase. Analysis of 13 Rho-independent terminators. J.Mol.Biol. 224, 3151.
  55. Rice, G. A., Kane, C. M., and Chamberlin, M. J. (1991). Footprinting analysis of mammalian RNA polymerase II along its transcript: an alternative view of transcription elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4245−4249.
  56. , J. (1969). Termination factor for RNA syntethis. Nature 224, 1168−1174.
  57. , J. (1992). Antitermination and the control of transcription elongation. In Transcription regulation (McKnight, S.L. & Yamamoto, K.R., eds). pp. 389−407, Cold Spring Harbor Lab. press, Cold Spring Harbor, NY.
  58. Rosenberg, M., and Court, D. (1979). Regulatory sequences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Annu.Rev.Gen. 13, 319 353.
  59. Rosovskaya, T. A., Chenchik, A. A., Beabealashvilli, R. S. (1982). Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Lett. 137, 100−104.
  60. Schmitz, A., and Galas, D. J. (1979). The interaction of RNA polymearse and iac repressor with the lac control region. Nucleic Acids Res. 6, 111−137.
  61. Severinov, K., and Goldfarb, A. (1994). Topology of the Product Binding Site in RNA Polymerase Revealed by Transcript Slippage at the Phage X PL Promoter. J. Biol. Chem. 269, 31 701−31 705 .
  62. Siebenlist, U., Simpson, R. B., Gilber, W. (1980). E. coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell 20, 269 281.
  63. Shaaban, S.A., Bobkova, E.V., Chudzik, D.M., Hall, B.D. (1996). In vitro analysis of elongation and termination by mutant RNA polymerase with altered termination behavior. Mol. Cell. Biol. 16, 6468−6476.
  64. Shaaban, S.A., Krupp, B.M., Hall, B.D. (1995). Termination-altering mutations in the second lagest subunit of yeast RNA polymerase III. Mol. Cell. Biol. 15, 1467−1478.
  65. Shi, Y., Gamper, H., and Hearst, J. (1988). Interaction of T7 RNA polymerase with DNA in an elongation complex arrested at a specific psoralen adduct site. J. Biochem. 263, 527−534.
  66. Spassky, A., Bustby, S., Danchin, A., and Buc, H. (1979). Eur.J.Biochem. 99, 187−201.
  67. Spencer, C.A. and Groudine, M. (1990). Transcription elongation and eukaryotic gene regulation. Oncogene 5, 777−785.
  68. , A. (1969). Studies of the ribonucleic acid polymerase from Escherichia coli V. Studies of its complexes with polyribonucleotides. J.Biol.Chem. 244, 425−429.
  69. Straney, D. C., and Crothers, D. M. (1985). Intermediates intranscription initiation from the E. coii /acUV5 promoter. Cell 43, 449−459.
  70. Studier, F. W., and Rosenberg, A. H. (1981). Genetic and physicalmapping of the late region of bacteriophage 17 DNA by use of cloned fragments of T7 DNA. J. Mol. Biol. 153, 503−525.
  71. Syroid, D.E. and Capone, J.P. (1994). RNA chain elongation and termination by mammalian RNA polymerase III. J.Mol.Biol. 244, 482−493.
  72. Tavormina, P.L., Landick, R. and Gross, C. (1996). Isolation, purification, and in vitro characterization of recessive-lethal-mutant RNA polimerases from Escherichia coli. J. Bacteriol. 17, 5363−5271.
  73. Weilbaecher, R., Hebron, C., Feng, G., and Landick, R. (1994).
  74. Termination-altering amino acid substitutions in the? subunit of Escherichiacoli RNA polymerase identify regions involved in RNA chain elongation. Genes Dev. 8, 2913−2927.
  75. Wu, C. W., and Goldthwait, D. A. (1969). Studies of nucleotide binding to the ribonucleic acid polymerase by a fluorescence technique. Biochemistry 8, 4450−4457.
  76. Xiong, X.F., and Reznikoff, W.S. (1993). Transcriptional slippage during the transcription initiation process at a mutant lac promoter in vivo. J. Mol. Biol. 231, 569−580.
  77. Yager, T. D. and von Hippel, P. H. (1991). A thermodynamic analysis of RNA transcript elongation and termination in E.coli. Biochemistry 30, 10 971 118.
  78. Yang, M-T. and Gardner, J. F. (1989). Transcription termination directed by heteroduplex thr attenuator templates. J. Biol. Chem. 264, 2634 2639.
  79. Nudler Е., E. Avetissova, V. Markovtsov, A. Goldfarb (1996). Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science, 273, 211−217.
  80. Nudler E., I. Gusarov, E. Avetissova, V. Kozlov, A. Goldfarb (1998). Spatial organization of transcription elongation complex in Escherichia coli. Science, 281, 424−428.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!