Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-генетическими методами

Диссертация: Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-генетическими методами
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

По литературным данным, определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis одновременно к рифампицину и изониазиду проводили, как правило, по генам гроВ и katG, причем изучали кодоны 531 и 315, в которых мутации встречаются наиболее часто, хотя имеются исследования по выявлению мутаций, ответственных за резистентность к данным противотуберкулезным препаратам и в других кодонах… Читать ещё >

Содержание

  • Список сокращений
  • Глава 1. Обзор литературы
    • 1. 1. Современные бактериологические методы определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам. ^
      • 1. 1. 1. Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на ^ плотных средах
      • 1. 1. 2. Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на ^ жидких средах
    • 1. 2. Молекулярные механизмы множественной лекар- ^ ственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis
      • 1. 2. 1. Устойчивость к рифампицину
      • 1. 2. 2. Устойчивость к изониазду
    • 1. 3. Молекулярно-биологические методы определения мутаций, ведущих к становлению резистентности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам
      • 1. 3. 1. Секвенирование ДНК
      • 1. 3. 2. Метод денатурирующего градиентного гель электрофореза — DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis)
      • 1. 3. 3. Метод несовершенного дуплекса (CMC
  • Chemical Mismatch Cleavage)
    • 1. 3. 4. Метод гетеродуплексного анализа (ПЦР — ГДА)
    • 1. 3. 5. Метод выявления мутаций, приводящих к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) (restriction fragments length polymorphism -RFLP)
    • 1. 3. 6. Обнаружение мутаций путем оценки конфор-мационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (single-stranded conformation polymorphism — SSCP)
    • 1. 3. 7. Определение ЛУ МБТ методом гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе
  • Глава 2. Материал и методы исследования
    • 2. 1. Пациенты и клинические образцы
    • 2. 2. Сбор материала
    • 2. 3. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis
      • 2. 3. 1. Подготовка проб для «ТБ-БИОЧИП»
      • 2. 3. 2. Условия проведения полимеразной цепной реакции
      • 2. 3. 3. Проведение гибридизации
      • 2. 3. 4. Регистрация результатов гибридизации
    • 2. 4. Определение устойчивости к изониазиду путем выявления мутаций в гене kasA методом конформа-ционного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP)
      • 2. 4. 1. Подготовка проб
      • 2. 4. 2. Условия проведения полимеразной цепной ре-g акции
      • 2. 4. 3. Выявление мутаций в гене kasA
    • 2. 5. Статистическая обработка данных
  • Глава 3. Собственные исследования

Сравнение эффективности выявления Mycobacterium tuberculosis, чувствительных и резистентных к ри-фампицину и изониазиду, методом «ТБ-БИОЧИП» и бактериологическими методами в культурах и респи- ^ раторных образцах.

3.1. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis бактериологическими ме- ^ тодами.

3.2. Оценка эффективности выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis и определения ее чувствительности к рифампицину и изониазиду в респираторных образцах с помощью тест-системы «ТЪ-БИОЧИП».

3.3. Оценка эффективности выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis и определения ее чувствительности к рифампицину и изониазиду, с помощью «ТБ-БИОЧИП» в культурах

3.4. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных, исследованных с помощью «ТБ-БИОЧИП».

3.4.1. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые ^ выявленным туберкулезом.

3.4.2. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хрониче-, 00 ским течением туберкулеза.

Глава 4. Анализ мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis с помощью метода конформационного полимор- ^ физма одноцепочечных фрагментов (SSCP).

4.1.Выявление мутаций в гене has A Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выяв- ^ ленным туберкулезом легких, методом SSCP.

4.2. Выявление мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим ^ течением туберкулеза, методом SSCP.

Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-генетическими методами (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы.

Одной из основных причин увеличения числа больных туберкулезом в России в настоящее время является широкое распространение Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам. Наиболее опасными в клиническом и эпидемиологическом плане являются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, характеризуемые наличием одновременной лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду [31, 33, 80, 151].

Согласно статистическим данным в Москве в 2003 году Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью обнаружены у 7,6% больных с впервые выявленным туберкулезом легких и у 19,2% пациентов с хроническим течением заболевания [17].

Микробиологические методы диагностики и определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis являются достаточно точными и надежными, однако, получить видимый рост возбудителя на плотной питательной среде возможно только через 6−8 недель, что существенно замедляет процесс верификации диагноза. Для определения лекарственной чувствительности на плотной среде Левенштейна-Йенсена требуется еще 3−4 недели, в связи с чем, выбор обоснованного режима химиотерапии откладывается на 2−3 месяца, а назначение про-тиивотуберкулезных препаратов чаще всего носит эмпирический характер.

Для сокращения времени культуральной диагностики туберкулеза были разработаны автоматизированные бактериологические системы ВАСТЕС MGIT960 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ (BioMerieux), в которых рост микобактерий происходит на жидкой питательной среде. Однако и в этом случае выявление возбудителя в диагностическом материале и определение его лекарственной чувствительности занимает около 3−4 недель [9,10].

Внедрение во фтизиатрию молекулярно-биологических методов дало возможность существенно сократить сроки определения лекарственной чувствительности микобактерий. В настоящее время известны гены Mycobacterium tuberculosis, кодирующие ферменты, которые взаимодействуют с лекарственными препаратами, и появление мутаций в этих генах приводит к становлению резистентности к противотуберкулезным препаратам [1,35,39,40].

Молекулярно-биологические методы обладают высокой точностью и надежностью и многие из них позволяют не только выявить, но и охарактеризовать мутации, возникшие в геноме микобактерий.

Методы определения мутаций различны. Как правило, они совмещают в себе клонирование исследуемого участка гена путем полимераз-ной цепной реакции и детекции полученных ампликонов путем прямого секвенирования ПЦР-продукта, определения полиморфизма длин рест-рикционных фрагментов (restriction fragments length polymorphismRFLP), электрофореза продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле (denaturing gradient gel electrophoresis DGGE)* гетеродуплексного анализа, исследования конформационного полиморфизма одноцепочеч-ных фрагментов (single-stranded conformation polymorphism — SSCP). Большинство из указанных выше методов применяются, главным образом, в научных целях, хотя их адаптация, в частности метода SSCP, возможна для специализированных лабораторий, занимающихся ПЦР-диагностикой.

Принципиально новая, не имеющая аналогов тест-система «ТБ-БИОЧИП», разработанная в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, и апробированная в Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом в условиях клинико-диагностической лаборатории, включает в себя метод мультиплексной асимметричной ПЦР и гибридизацию на микрочипе. На второй стадии амплификации используется праймер, меченый флуоресцентной меткой CY-5. Полученный меченый ПЦР-продукт подвергается гибридизации.

Микрочип представляет собой небольшое стекло, на которое иммобилизуют в виде правильно расположенных микроячеек небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Данные ячейки объединены в 23 группы таким образом, что сравнение интенсивности флуоресцентных сигналов ячеек каждой группы позволяет сделать заключение о наличии/отсутствии мутации (минорного полиморфизма), приводящей к замене одного аминокислотного остатка. Интерпретация результатов гибридизации осуществляется при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, принадлежащих к одной группе. Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствует о наличии совершенного гибридизационного дуплекса [8].

Данная тест-система позволяет детектировать 29 типов мутаций по гену гроВ и 19 типов мутаций по генам katG, oxyR-ahpC и inhA. С помощью этого чипа удается выявить 80−85% всех случаев наличия микобак-терий с множественной лекарственной устойчивостью у обследуемых больных туберкулезом. Каждый этап адаптирован для условий молеку-лярно-диагностических лабораторий, метод не трудоемок и занимает 48 часов [19].

Известно, что 5−16,8% штаммов возбудителя, резистентных к изо-ниазиду, имеют мутации в гене has, А [24, 29, 51]. Поскольку использование мультиплексной полимеразной цепной реакции ограничивает количество анализируемых генов на микрочипе, для выявления мутаций в гене has А, можно использовать метод SSCP. Сочетание метода биологических микрочипов («ТБ-БИОЧИП») и SSCP позволяет охарактеризовать Mycobacterium tuberculosis по пяти наиболее изученным генам, определяющим наличие множественной лекарственной устойчивости.

Цель исследования.

Определение множественной лекарственной устойчивости и анализ спектра мутаций в генах rpoB, katG, inhA, oxyR-ahpC и kasA Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных туберкулезом легких, с помощью молекулярно-биологических методов (биологических микрочипов и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов), адаптированных для условий клинико-диагностической ПЦР-лаборатории.

Задачи исследования.

1. Проведение сравнительного анализа частоты выявления множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis бактериологическими методами и с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».

2. Определение доли резистентных к изониазиду Mycobacterium tuberculosis, имеющих мутации в гене kasA, с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.

3. Анализ спектра мутаций в Mycobacterium tuberculosis резистентных к рифампицину и изониазиду у больных с впервые выявленным туберкулезом легких с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».

4. Анализ спектра мутаций в Mycobacterium tuberculosis резистентных к рифампицину и изониазиду, у больных с хроническим течением процесса с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».

Научная новизна работы.

1. Проведен сравнительный анализ частоты и сроков обнаружения множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis с помощью сочетания методов биологических микрочипов и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов, по сравнению с классическими бактериологическими методами.

2. Определен вклад мутаций в гене kasA в общее число Mycobacterium tuberculosis, резистентных к изониазиду.

3. С помощью молекулярно-биологических методов впервые проведены одновременные исследования Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких, по пяти генам, ответственным за множественную лекарственную устойчивость: rpoB, katG, inhA, oxyR-ahpC и has A.

Практическая значимость исследования.

Сочетание методов биологических микрочипов и конформационно-го полиморфизма одноцепочечных фрагментов позволяет в короткие сроки с высокой степенью точности и надежности в полной мере охарактеризовать диагностический материал, получаемый от больных туберкулезом, на наличие Mycobacterium tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

Быстрое определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду позволяет назначить пациентам адекватный режим химиотерапии непосредственно после поступления в специализированную клинику или внести коррективы в схему лечения в течение 2−3 суток.

Своевременное определение Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью способствует совершенствованию лечения больных и, в свою очередь, сокращает сроки их пребывания в стационаре, что, соответственно, приводит к уменьшению затрат и расхода лекарственных средств. Материалы диссертации были использованы при составлении методических рекомендаций «Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-биологическими методами», Москва, 2006.

Положения, выносимые на защиту:

1. Сочетание методов биологических микрочипов и конформаци-онного полиморфизма одноцепочечных фрагментов позволяет одновременно идентифицировать Mycobacterium tuberculosis и определить чувствительность возбудителя к рифампицину и изониазиду в более короткие сроки (48 часов), по сравнению с классическими бактериологическими методами и охарактеризовать наличие мутаций одновременно в пяти генах, ассоциированных с резистентностью к данным противотуберкулезным препаратам.

2. Среди Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, преобладали чувствительные к рифампицину и изониазиду. В штаммах с множественной лекарственной устойчивостью выявлялись наиболее распространенные типы мутаций, главным образом, в генах гроВ (531 кодон) и katG (315 кодон).

3. Среди Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных с хроническим течением туберкулезного процесса преобладали штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и высокой вариабельностью сочетания мутаций в исследуемых генах.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Европейских респираторных конгрессах, Vienna, Austria, 2003; Glasgow, UK, 2004; Российском съезде фтизиатров, Москва, 2003.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов. В тексте содержится 10 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 155 источников литературы, из них на 33 русском и 122 на иностранном языках.

Выводы.

1. С помощью сочетания методов биологических микрочипов и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов, определяется лекарственная чувствительность Mycobacterium tuberculosis одновременно к рифампицину и изониазиду, посредством выявления мутаций, ассоциированных с резистентностью к данным препаратам, в генах гроВ, katG, inhA, oxyRahpC и kasA, в течение 48 часов.

2. В Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, определили множественную лекарственную устойчивость в 10,4% случаев. В 11,8% случаев обнаружили штаммы резистентные к изониазиду. Резистентных к рифампицину штаммов выявлено не было.

3. Установлено шесть типов сочетания мутаций в Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, (три характерные для штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, главным образом, с мутациями в 531 кодоне гена гроВ и 315 кодоне гена katG). Кроме того, определены три мутации, ассоциированные с резистентностью к изониазиду.

4. Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, в группе больных с хроническим течением туберкулезного процесса, определили в 72,0% случаев. В 14,3% выявили штаммы резистентные к изониазиду и в 4,6% - резистентные к рифампицину.

5. В Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением процесса, определено 34 типа сочетания мутаций (22 характерных для Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, 11 — для резистентных к изониазиду и 1 — резистентный к рифампицину).

6. Мутации в гене kasA, связанные с устойчивостью к изониазиду, были выявлены в пяти штаммах Mycobacterium tuberculosis (три из которых были с признаками множественной лекарственной устойчивости и два — резистентных к изониазиду).

Заключение

.

Максимально быстрое и специфическое выявление Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью у больных туберкулезом является одной из самых актуальных задач современной фтизиатрии [33, 53, 54, 80, 83, 93, 114, 125].

Широко применяемые в настоящее время в лабораторной практике микробиологические методы определения лекарственной чувствительности микобактерий на плотных средах занимают 6−8 недель, поэтому лечение, как правило, начинают без учета данных о чувствительности возбудителя к изониазиду и рифампицину, что часто имеет отрицательные клинико-эпидемиологические последствия [13, 14].

Применение полуавтоматических систем с использованием жидких сред [МВ/ВасТ, Bact/Alert 3D (Bio Merieux), Bactec MGIT 960 (Вес-ton Dickinson)] сокращает время выявления Mycobacterium tuberculosis и определения их чувствительности к противотуберкулезным препаратам до 3−4 недель, что так же довольно длительно и часто заставляет начать лечение до получения лабораторных результатов.

Использование молекулярно-биологических методов для определения лекарственной чувствительности возбудителя к рифампицину и изониазиду, позволяет сократить временные сроки выполнения анализа до 2−3 суток.

К настоящему времени расшифрован геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv [54], и достаточно хорошо изучены молекулярные механизмы резистентности к противотуберкулезным препаратам, обусловленные мутациями в определенных генах возбудителя [24, 25, 34, 42, 78, 79, 113, 118, 120, 129, 130, 138, 140, 144]. Так, резистентность к рифампицину возникает благодаря мутациям в гене гроВ, а устойчивость к изониазиду ассоциирована с мутациями в нескольких генах, основными из которых являются: katG, inhA, oxyR-ahpC и has А.

Молекулярно-биологические методы, применяемые для определения лекарственной чувствительности возбудителя, включают в себя клонирование последовательности-мишени посредством полимеразной цепной реакции и детекции полученных ампликонов.

В Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН разработана тест-система «ТБ-БИОЧИП» (предприятие-производитель ООО «БИОЧИП-ИМБ», Москва), которая затем была апробирована в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом в условиях клинико-диагностической лаборатории. Это экспресс-тест in vitro для одновременной идентификации возбудителя путем выявления наличия последовательности IS6110, уникальной для Mycobacterium tuberculosis complex, и определения лекарственной чувствительности микобактерий к рифампицину и изониазиду путем выявления мутаций в генах rpoB, katG, inhA, и oxyR-ahpC. Для выявления мутаций в гене kasA, приводящих к становлению резистентности Mycobacterium tuberculosis к изониазиду в 5 — 16,8% случаев [24, 51], определение которых нельзя выполнить на биочипе, было решено применить модификацию метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP), разработанную в МНПЦБТ (приоритетная справка № 2 003 111 987, 2003, ФИПС). Собственные наработки заключались в том, что нами были подобраны праймеры, программа амплификации и условия проведения высокоразрешающего электрофореза.

Целью данных исследований было определение множественной лекарственной устойчивости и анализ спектра мутаций в генах гроВ, katG, inhA, oxyR-ahpC и kasA Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных туберкулезом легких с помощью молекулярно-биологических методов (биологических микрочипов и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов), адаптированных для условий клинико-диагностической ПЦР-лаборатории.

Задачи исследований были следующие:

— оценить возможности использования нового метода выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП», по сравнению с бактериологическими методами.

— определить долю резистентных к изониазиду микобактерий, имеющих мутации в гене kasA, методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.

— с помощью сочетания применяемых методов проанализировать спектр мутаций одновременно в пяти генах Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и хроническим течением процесса.

С помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП» нами был исследован диагностический материал с ДНК Mycobacterium tuberculosis, полученных из 82 респираторных образцов и 161 культуры, параллельно с бактериологическими методами.

Клетки Mycobacterium tuberculosis, выделенные из респираторных образцов, а затем посеянные на плотные и жидкие среды, в 12 случаях не дали роста. Для остальных респираторных образцов (п=70) сравнивали результаты определения лекарственной чувствительности, полученные на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7Н9. Сюда входили Mycobacterium tuberculosis, чувствительные к рифампицину и изониазиду (35,7%), резистентные к одному из препаратов (14,3%) и штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (50,0%). Из литературы известно, что на среде Левенштейна-Иенсена при посеве микобактерий, выделенных из диагностического материала, удается получить результат в 65−70% случаев из-за индивидуальных особенностей роста штаммов. На жидких средах процент их выявляемое&trade-, как правило, выше [69].

Высокий процент выживших культур, полученный в наших экспериментах, вероятно, связан с тем, что на посев брали только свежий материал, а, следовательно, Mycobacterium tuberculosis в нем отличались повышенным уровнем выживания. Этим же можно объяснить более высокий процент роста микобактерий, выделенных из респираторных образцов (85,3%), по сравнению с данными других исследователей [14, 15, 69]. Поскольку результаты определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis, выделенных из респираторных образцов и культур, выращенных на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7Н9, были аналогичны, в дальнейшем данные, полученные молекуляр-но-биологическими методами, сравнивали с результатами роста на среде Левенштейна-Йенсена.

При исследовании ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных из культур, удалось получить результаты лекарственной чувствительности микобактерий для всех штаммов: чувствительных — 24,8%, резистентных к одному из препаратов — 16,8% и Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью — 58,4%.

При сопоставлении результатов исследований лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis, выполненных на ДНК возбудителя, выделенной из респираторных образцов, полученных с помощью «ТБ-БИОЧИП» и метода абсолютных концентраций, проценты совпадения составили 92,0% и 95,7% по определению чувствительности и резистентности соответственно. С помощью «ТБ-БИОЧИП» было выявлено 35,7% чувствительных образцов 14,3% резистентных к одному из препаратов и 50,0% с множественной лекарственной устойчивостью, в то время как с помощью культуральных исследований выявлено 32,8% чувствительных образцов, 18,6% - резистентных к одному из препаратов и 48,6% с множественной лекарственной устойчивостью.

Исследование ДНК Mycobacterium tuberculosis из 12 респираторных образцов (14,6% от общего количества исследуемых образцов), не давших роста ни на жидких, ни на плотных средах показало, что пять из них являются чувствительными, один устойчивый к рифампицину, один.

— к изониазиду, и пять — с множественной лекарственной устойчивостью. Таким образом, тест-система «ТБ-БИОЧИП» позволяет не только определить лекарственную чувствительность микобактерий в более короткие сроки, но и в большем числе случаев, т.к. является более чувствительной.

При исследовании респираторных образцов в двух случаях наблюдались расхождения в определении множественной лекарственной устойчивости двумя методами.

Сопоставление результатов определения лекарственной чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis, выращенных на среде Ле-венштейна-Иенсена, показало высокий процент совпадения результатов, полученных с помощью «ТБ-БИОЧИП» и метода абсолютных концентраций (90,5% для чувствительных и 90,9% для резистентных штаммов). При исследовании с помощью метода абсолютных концентраций 42 (26,1%) штамма были определены как чувствительные к рифампицину и изониазиду, 29 (18,0%) — как резистентные к одному из препаратов и 90 (55,9%) как множественно лекарственно устойчивые, в то время как при исследовании на «ТБ-БИОЧИП» только 40 (24,8%) были определены как чувствительные, 27 (16,8%) — как резистентные к одному из препаратов и 94 (58,4%) обладали множественной лекарственной устойчивостью. В 7,4% случаях были несовпадения результатов при определении лекарственной чувствительности двумя методами.

В основе расхождения полученных результатов могут быть следующие причины:

— с помощью биологических микрочипов можно выявить наиболее часто встречающиеся мутации. Новые мутации, которые могут появиться в изучаемых и не изучаемых кодонах исследованных генов на чипах выявить нельзя. В частности, как показало исследование методом SSCP (см. ниже) мутация в одном из образцов ДНК микобактерий, который был определен бактериологическими методами как резистентный к изониазиду, а с помощью «ТБ-БИОЧИП» как чувствительный, была локализована в гене kasA, поэтому ее не удалось выявить;

— из литературы известно, что в популяции Mycobacterium tuberculosis больного могут присутствовать микобактерии с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам [53];

— рост некоторых микобактерий, выше в присутствии противотуберкулезных препаратов [54];

— кроме того, согласно некоторым литературным данным, Mycobacterium tuberculosis с большим количеством мутаций могут обладать меньшей жизнеспособностью [54].

В данной ситуации, скорее всего, Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду, оказалось в процентном соотношении меньше, чем резистентных к одному из данных препаратов и при росте с противотуберкулезными препаратами количество последних превалировало над количеством микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью, поэтому «ТБ-БИОЧИП» их и выявляет.

Особый интерес представляют данные, когда в респираторном образце (один случай) или культуре (два случая) с помощью чипа выявляли Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, а бактериологическими методами обнаруживали микобактерии, устойчивые только к одному из препаратов. По всей вероятности, микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью частично погибли и поэтому при исследовании культуры, выросшей на среде Ле-венштейна-Иенсена, с помощью биочипов их не выявили.

Таким образом, применение биологических микрочипов помогает значительно сократить время анализа, определить лекарственную чувствительность Mycobacterium tuberculosis в мокроте и определить лекарственную чувствительность в штаммах, которые могут не вырасти на среде Левенштейна-Йенсена.

Согласно литературным данным, в 2003 году, в Москве у больных с впервые выявленным туберкулезом количество штаммов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, составило 7,6%. Среди контингента больных с хроническим течением туберкулеза ее уровень достигал 20% [17]. Таким образом, проблема максимально быстрого и специфического выявления штаммов микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью у больных туберкулезом является весьма важной.

Нами было проанализировано 68 респираторных образцов и культур микобактерий, полученных от 55 больных с впервые выявленным туберкулезом легких.

Изучение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких показало, что среди штаммов преобладали чувствительные — 77,9%. Mycobacterium tuberculosis, устойчивые к изониазиду выявили в 11,8% случаев. В тоже время, микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью были обнаружены в 10,3%. Резистентных к рифампицину штаммов выявлено не было.

Известно, что устойчивость к рифампицину в 95% случаев связана с мутациями в гене гроВ, кодирующем В-субъединицу РНК-полимеразы Mycobacterium tuberculosis [40, 42, 105]. В настоящее время известно более 40 мутаций в этом гене, обусловливающих резистентность к рифампицину. В основном они сосредоточены в коротком сегменте гена гроВ, состоящем из 81 основания и кодирующем аминокислоты 507−533 [113]. Примерно 4% штаммов не имеют мутаций в этом сегменте [1].

Резистентность к изониазиду обусловливается мутациями в четырех, основных генах: katG, inhA, oxyR-ahpC и kasA. Мутации в гене katG встречаются в 50−79% устойчивых к изониазиду штаммов возбудителя, по данным М. Stoecle и соавт. (1993) [131] и более чем в 90%, по данным X. Chen и соавт. (2005) [51]. Устойчивость к изониазиду благодаря мутациям в гене inhA, возникает в 10−20% случаев. Мутации в межгенной области генов ahpC и oxyR встречаются, приблизительно в 10% резистентных к изониазиду штаммах [25], и являются компенсаторной реакцией на снижение каталазно-пероксидазной активности, контролируемой генами katG и inhA. [124]. Мутации в гене kasA характерны для 4−16,8% штаммов, имеющих резистентность к изониазиду.

По литературным данным, определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis одновременно к рифампицину и изониазиду проводили, как правило, по генам гроВ и katG, причем изучали кодоны 531 и 315, в которых мутации встречаются наиболее часто, хотя имеются исследования по выявлению мутаций, ответственных за резистентность к данным противотуберкулезным препаратам и в других кодонах [51, 92, 113]. Что касается географического анализа устойчивости к рифампицину, то на Филиппинах она определяется в 531 и 510 кодонах гена гроВ, в Кении в 526 и 531 кодонах [62, 63, 75], в Индии в 531, 530, 511 и 514 кодонах [132]. Таким образом, изучение мутаций в 531 кодоне гена гроВ и 315 кодоне гена katG оправданы, так как они чаще всего встречаются в штаммах микобактерий, полученных от больных туберкулезом в разных странах.

Исследования, проведенные нами в Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом по анализу мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких в изучаемых генах, показали следующее. Микобактерии с мутациями во всех четырех изучаемых генах не обнаружено. В трех генах мутации отмечены только в двух штаммах (причем оба обладали множественной лекарственной устойчивостью), в двух генах — в шести штаммах, причем пять из них обладали множественной лекарственной устойчивостью и один являлся резистентным к изониазиду. В семи случаях были выявлены штаммы Mycobacterium tuberculosis резистентные к изониазиду, с мутацией только в одном гене.

Было определено 15 штаммов с разным генотипом по исследованным генам. Как правило, встречались мутации в 531 кодоне гена гроВ и в 315 кодоне гена katG. Таким образом, сочетание мутаций в двух генах соответствует профилю мутаций, как правило, выявляемых в штаммах микобактерий исследователями из различных стран. Имеются штаммы резистентные к изониазиду по гену inhA (2 из 15), которые очень редко определялись исследователями ранее. И, как мы отмечали ранее, у больных с впервые выявленным туберкулезом легких нами не было обнаружено резистентных к рифампицину Mycobacterium tuberculosis.

У больных с хроническим течением заболевания всего выявлено 16 чувствительных к изониазиду и рифампицину штаммов возбудителя, что составляет 9,1% от общего количества исследованных штаммов, и 159 резистентных штаммов (90,9%). Выявили 33 (18,9%) штамма, резистентных к одному из препаратов. Восемь из них (4,6%) обладали устойчивостью к рифампицину и 25 (14,3%) были резистентны к изониазиду. Чаще всего встречались штаммы с множественной лекарственной устойчивостью — их 126 (72,0%). Мутации во всех четырех генах не были обнаружены ни в одном случае. Мутации в трех генах обнаружены в 25 (14,3%) исследованных штаммах. В двух генах — в 112 штаммах (64,0%), причем 101 из них были с множественной лекарственной устойчивостью и 11 являлись устойчивыми к изониазиду. Мутацию в одном гене имели 14 резистентных к изониазиду штаммов и 8 — резистентных к рифампицину.

У микобактерий, резистентных к одному из препаратов, выявлено 12 вариантов мутаций. Все штаммы устойчивые к рифампицину имели замену Ser на Leu в 531 кодоне гена гроВ. Поскольку резистентность к изониазиду определяли по четырем генам, вариабельность мутаций была выше. В 5 случаях (3,1%) встречалась мутация только в гене katG (315 кодон, замена Ser на Thr), в 6 (4%) случаях данная замена сочеталась с мутацией в гене inhA (Т15), и в одном (0,6%) — с мутацией в гене inhA.

А8). Также наблюдалась замена в гене katG (Ser315>Asn). В одном случае (0,6%) выявлена только она и в двух (1,3%) — в сочетании с мутацией в гене inhA (Т15). В одном (0,6%) штамме также обнаружена замена в гене katG (Trp328>Cys). Обнаружена мутация в гене inhA (G16) в одном штамме (0,6%). Также в одном случае встретилось сочетание мутаций в гене inhA (Т15+Т8) с мутацией в генах oxyR-ahpC (Т10). Мутации только в генах oxyR-ahpC были расположены в 6 (0,6%) и 12 (0,6%) положениях.

Таким образом, для штаммов, полученных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, характерной особенностью являлось относительно малое содержание микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью (10,4% случаев), небольшое разнообразие сочетания мутаций по исследованным нами генам — 6 вариантов. Выявлены штаммы, которые резистентны к изониазиду только по inhA гену.

У пациентов, с хроническим течением процесса, наблюдалось большое разнообразие мутаций в ДНК микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью (всего 22 типа). Чаще всего встречалось сочетание мутаций в гене гроВ (531 кодон, замена Ser на Leu) и гене katG (315 кодон, замена Ser на Thr), что вполне соответствует литературным данным [51, 114]. Оно выявлено в 69 (54,8%) исследованных штаммах. На втором месте сочетание мутаций в генах гроВ (Ser531>Leu), katG (Ser315>Thr) и гене inhA (Т15). Оно встречалось в 10 (7,9%) случаях. В одном случае (0,8%) выявлена двойная мутация в гене гроВ в 531 (Ser53 l>Leu) и 533 кодонах (Leu533> Pro) и получилось сочетание гроВ (Ser531>Leu), (Leu533>Pro), katG (Ser315>Thr) и inhA (T15) и в одном — встречается сочетание гроВ (Ser531>Leu), katG (Ser315>Thr) и inhA (Т8).

Также в семи (5,5%) случаях наблюдалось сочетание замены в гене гроВ (Ser531>Leu) и мутации в гене inhA (Т15), в одном случае (0,8%) данная замена сочетается с мутацией в гене inhA (G16) и в одном (0,8%) — с мутацией в генах oxyR-ahpC (Т10).

В шести (4,8%) случаях наблюдается сочетание мутаций в генах rpoB (Hys526>Asp) и katG (Ser315>Thr). В двух случаях (1,6%) к данному сочетанию мутаций добавилась еще одна — в гене inhA (Т15). Также в двух случаях (1,6%) наблюдалось сочетание мутаций в генах гроВ (Hys526>Leu), katG (Ser315>Thr) и inhA (Т15), в трех (2,3%) — в гроВ (Hys526>Tyr), katG (Ser315>Thr) и в двух (1,6%) — в гроВ (Hys526>Tyr), katG (Ser315>Thr) и inhA (Т15). В одном случае (0,8%) наблюдалось редкое сочетание мутаций в генах гроВ (Hys526>Tyr) и inhA (Т9). Также в одном штамме (0,8%) выявлены две мутации в гене гроВ (Hys526>Asn и Leu533>Pro) и одна мутация в гене inhA (Т10).

В шести случаях (4,8%) обнаружено сочетание мутаций в генах гроВ (Leu533>Pro) и katG (Ser315>Thr) и в четырех случаях (3,2%) к данному сочетанию добавляется мутация в гене inhA (Т15).

Встречались и другие редкие сочетания мутаций. Так, обнаружены замены в генах гроВ (Asp516>Tyr) и katG (Ser315>Thr) в двух случаях (1,6%), а в одном (0,8%) — в генах гроВ (Asp516>Tyr), katG (Ser315>Thr) и inhA (A8). В двух штаммах наблюдалось сочетание мутаций в генах гроВ (Asp516>Val) и katG (Ser315>Thr) и в одном штамме эти замены сочетались с мутацией в гене inhA (С 15). В двух случаях (1,6%) встречалось сочетание мутаций в генах гроВ (Leu511>Рго), katG (Ser315>Thr) и inhA (Т15) и в одном наблюдались две замены в гене гроВ (Leu51 l>Arg и Asp516>Val), гене katG (Ser315>Thr) и в гене inhA (Т15). Наиболее характерными являлись мутации в 531, 526, 516, 533 кодонах гроВ гена. Для штаммов, устойчивых к изониазиду — в 315 кодоне гена katG, Т15 в гене inhA, а также А6 и А8 в генах oxyR-ahpC.

В 315 кодоне гена katG выявлена замена не только Ser на Thr, но и на другие аминокислоты.

Способность «ТБ-БИОЧИП» детектировать большое количество мутаций, в том числе и редких, является одним из ценных качеств данной тест-системы, так как позволяет выявлять резистентные микобакте-рии с большей точностью и надежностью по сравнению с другими методами. Таким образом, у больных с хроническим течением процесса выявлено 22 варианта сочетания мутаций в генах микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью. Кроме того, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП» можно выявить мутации и в штаммах, устойчивых только к рифампицину или изониазиду.

Основной профиль мутаций для генов гроВ и katG следующий: 531 и 315 кодоны — 64,3%, 526 и 315 кодоны — 11,9% и 516 и 315 кодоны -3,2%. Особый интерес представляют сочетания мутаций в генах гроВ и inhA — 6,3%, а также гроВ и oxyR-ahpC — 0,8%. Эти сочетания описаны нами впервые.

Ген kasA, кодирует редуктазу 6-кетоацил-ацилпереносящего белка, которая в комплексе с ферментом AspM, являющимся белком-переносчиком ацильных радикалов, участвует в синтезе миколовых кислот, входящих в состав клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis [89, 113]. Литературные данные говорят о том, что роль данного гена в резистентности к изониазиду спорна, т.к. мутации в данном гене встречались как в чувствительных так и резистентных к изониазиду штаммах. Однако ряд проведенных исследований [113, 129] показал, что некоторые мутации, в частности замены в 269 кодоне приводят к высокому уровню резистентности к препарату. Частота встречаемости мутаций в данном гене колеблется от 1−2% до 10−16,8% [24, 51].

С помощью метода SSCP нами было исследовано 119 проб ДНК микобактерий, ранее проанализированных с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП», полученных от 116 больных с различными формами туберкулеза.

От 55 больных с впервые выявленным туберкулезом было получено 63 штамма, и, согласно результатам исследования, мутация в гене kasA была обнаружена в трех из них (4,8%). Во всех случаях была выявлена замена в 269 кодоне гена kasA. В одном — Gln269>Arg и в двухGln269>Ser. Сопоставление полученных результатов с данными культу-рального исследования тех же штаммов методами абсолютных концентраций и биологических микрочипов выявило, что в одном из штаммов резистентность к изониазиду обусловливалась мутацией только в данном гене, а именно заменой Gln269>Arg.

Что касается двух других штаммов, то оба они при исследовании бактериологическими методами и на тест-системе «ТБ-БИОЧИП» были определены как множественно лекарственно устойчивые, причем в одном штамме, при исследовании обоими методами, была определена резистентность по четырем генам: гроВ (Ser531>Leu), katG (Ser315>Thr), inhA (T15) и kasA (Gln269>Ser), что является большой редкостью, а в другом — по трем: гроВ (Ser531>Leu), katG (Ser315>Thr), kasA (Gln269>Ser).

Также исследовали 56 проб ДНК микобактерий, полученных от больных с хроническим течением туберкулеза. Здесь уровень резистентности по данному гену составил 3,7%. Во всех случаях это была замена Gin на Arg в 269 кодоне гена kasA.

Мутаций только в гене kasA у больных с хроническим течением процесса не выявлено. Интересно, что в одном из устойчивых к изониазиду штаммов удалось выявить мутации в трех генах: katGSer315>Thr, inhA — А8 и kasA — Gln269>Arg. Данное сочетание мутаций является редким.

Таким образом, изучение мутаций в гене kasA не внесло особенного разнообразия в типы сочетания мутаций. Однако факт наличия мутации только в этом гене Mycobacterium tuberculosis, выделенных от одного больного, и то, что есть штаммы, у которых мутация в этом гене является четвертой, возможно, могут иметь значение для определения чувствительности больного к противотуберкулезным препаратам, и назначения наиболее эффективного лечения.

Показать весь текст

Список литературы

  1. И., Портлас Ф. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью.// М.: Медицина и жизнь 2003. — 368с.
  2. И.В., Перельман М. И. Туберкулез на пороге третьего тысячелетия.// Врач 1997. — № 7 — с. 2−6.
  3. .И., Вишневская Е. Б. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза на северо-западе России.// Пробл. туб. 2003. — № 5. — с.42−44.
  4. Э.В., Альтшулер М. Л., Говорун В. М., и др. Детекция и характеристика мутаций в гро В гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.ll Пробл. туб. 1999. -№ 2. — с.39−42.
  5. Э.В., Акопиан Т. А., Владимирский М. А. Прямой генетический анализ резистентных к рифампицину изолятов М. tuberculosis в образцах мокроты.// Пробл. туб. 2003. — № 4. — с.49−52.
  6. И.Р., Попов С. А., Медведева И. М. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979−1998 гг.// Пробл. туб. 2000.-№ 5.-с.15−18.
  7. И.Р., Бадлеева М. В., Скотникова О. И., и др. Состав и лекарственная чувствительность микобактериальной популяции у больных с подозрением на туберкулез.// Пробл. туб. 2005. — № 8. — с.36−38.
  8. О.А., Смирнова Н. С. Культуральное определение чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам.// В сб.: Лабораторная диагностика туберкулеза. 2001. -с.39−50.
  9. О.А., Смирнова Н. С., Слогоцкая Л. В., и др. Автоматизированные методы культурального определения Mycobacterium tuberculosis на жидких средах.// Пробл. туб. 2001. — № 3. — с. 53−55.
  10. М.Ю. Генетические механизмы устойчивости М. tuberculosis. I автореф. дисс. канд. биол. наук. Оболенск. 2004. — 16с.
  11. В.И., Сельцовский П.П" Сон И. М., и др. Туберкулез в Москве.// Москва. 2004. — 78 с.
  12. Р., Шеффилд В., Кокс Д. Обнаружение единичных нук-леотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез.// В кн.: Анализ генома. Методы. — М.: Мир. — 1990.-с. 123−175.
  13. В.М., Лапа С. А., Грядунов Д. А., и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микрочипе для обнаружения рифампицин-резистентных штаммов М. tuberculosis.//Бюлл. экспер. биол. и мед. -2001. т. 131. — с. 112−127.
  14. Л.И. Экспрессия генов.// М.: Наука. 2000. — 527с.
  15. М.И., Хомяков Ю. Н., Киселев В. Н., и др. Молекулярная медицина и лечение туберкулеза.// Пробл. туб. 2001.- № 5 — с.5−7.
  16. О.И., Заседателев А. С., Михайлович В. М., и др. Методы выявления мутаций и результаты их использования.// В сб.: Лабораторная диагностика туберкулеза. М.: 2001. с.91−112.
  17. О.И., Михайлович В. М., Носова Е. Ю., и др. Новые технологии определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis.// Пробл. туб. 2004. — № 6. — с.40−42.
  18. О.И., Соболев А. Ю., Исаева E.JI. Определение чувствительности М. tuberculosis к лекарственным препаратам с помощью молекулярно-генетических методов.// В сб.: Лабораторная диагностика туберкулеза. М.: 2001. — с.87−90.
  19. Е.М., Залуцкая О. М., Рот А., и др. Тестирование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с использованием различных методов.// Пробл. туб. 2001. — № 5. — с.43−45.
  20. А.Г., Голышевская В. И., Корнеев М. В., и др. Распространенность и микробиологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.// В сб.: Туберкулез. 1999. — № 1.-е. 1−6.
  21. Е.Ф., Клименко М. Т. Микробиологическая диагностика туберкулеза.// В сб.: Туберкулез. 1999. — № 3. — с. 1−5.
  22. М.В. Туберкулез в России в конце XX века.// Пробл. туб. 2001. — № 5. — с.8−13.
  23. Ahmad S., Mokaddas Е. Contribution of AGC to ACC and other mutations at codon 315 of the kat G gene in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from the Middle East.// Int. J. Antimicrob. Agents and Chemother. 2004. — v.23. — p.473−479.
  24. Albert H., Stupple M., Wilson S. et al. Rifampicin susceptibility results of Mycobacterium tuberculosis cultures in 48 hours using FAST plaque TB-Rif.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. — v.3. — Suppl.l. — p.130−135.
  25. Bakayev V., Bahrmand A., Samar G. CCM analysis of heterodu-plexes of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis./I Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. — v.3. — Suppl. 1. — p.123−124.
  26. Banerjee A., Sugantino M., Sacchettini J., Jacobs WR. The mabA gene from the inhA operon of Mycobacterium tuberculosis encodes a 3-ketoacyl reductase that fails to confer isoniazid resistance.// Microbiol. -1998. v.144. — p.2697−2707.
  27. Bertand Т., Eady N., Jones J., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase.// J. Biol. Chem. 2004. — v.37. -p.38 991−38 999.
  28. Blanchard J.S. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.!7 Annu. Rev. Biochem. 1996. — v.65. — p.215−239.
  29. Bloch A., Cauthen G., Onorato I. Nationwide survey of drug-resistant tuberculosis in the United States.// JAMA. 1994. — v.271. — p.665−671.
  30. Brunello F., Favari F., Fontana R. Comparison of the MB/BacT and BACTEC 460 ТВ systems for recovery of mycobacteria from various clinical specimens.//J. Clin. Microbiol. 1999. — v.37. — p.1206−1209.
  31. Brunello F., Fontana R. Reliability of the MB/BacT system for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis complex isolates to antituberculosis drugs.//J. Clin. Microbiol. 2000. — v.38. — p.872−873.
  32. Canetti G., Froman S., Grossery J., et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance.// Bull. World Health Org. 1963.- v.29. — p.565−578.
  33. Canetti G. Present aspects of bacterial resistance in tuberculosis// Am. Rev. Respir. Dis. 1965. — v.92. — p.687−703.
  34. Canetti G, Fox W, Khomenko A., et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity and the use of sensitivity tests in tuberculosis control programs.// Bull. World Health Org. 1969 — v.41 — p.21−43.
  35. Cangelosi G., Brabant W., Britschgi Т., Wallis C. Detection of rifampin and ciprofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis by using species-specific assays for precursor rRNA.// Antimicrob. Agents Chemother. -1996.-v.40.-p.l790−1795.
  36. Chakrabarti P. Drug targets and drug resistance in mycobacteria.// Proc. Nat. Acad. Sci. (India, B). 1997. — v.61. — p.169−179.
  37. Chaulet P., Bonlahbal F., Crosset J. Surveillance of drug resistance for tuberculosis control: why and how?// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1995. -v.76. — p.487−492.
  38. Cockerill F., Uhl J., Temesgen Z., et al. Rapid identification of a point mutation of the Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (katG) gene associated with isoniazid resistance.// J. Infect. Dis. 1995. — v. 171 -p.240−245.
  39. Cohn D., Bustreo F., Raviglione M. Drug-resistant tuberculosis: review of the wordwide situation and the WHO/IUATLD global surveillance project.//J. Clin. Infect. Dis. 1997. — v.24. — p. 121−130.
  40. Cole Т., Eisenach K.D., McMurray D., et al. Tuberculosis and tubercle bacillus.//ASM Press. Washington, DS. 2005. — 585p.
  41. Cooksey R., Crawford J., Jacobs W., Shinnick T. A rapid method for screening antimicrobial agents for activities against a strain of Mycobacterium tuberculosis expressing firefly luciferase.// Antimicrob. Agents Chemother. -1993.-v.37.-p.l348−1352.
  42. Davies J. Antibiotic resistance in mycobacteria.// Novartis Found. Symp. 1998. — v.79. — p.2−29.
  43. Diaz-Infantes M., Ruiz-Serrano M., Martinez-Sanchez L. Ortega A. Evaluation of the MB/BacT Mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis J I J. Clin. Microbiol. 2000. — v.38.- p.1988−1989.
  44. Essential components of a tuberculosis program: recommendations of the Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis. MMWR. 1995.- v.44., №RR -11. — 13p.
  45. Foddle R., Losekoot M. Mutation detection by denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE).// Hum. Mutat. 1994. — v.3. — p.83−94.
  46. Gingeras Т., Ghandour G., Wang E., et al. Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of generic Mycobacterium DNA arrays.// Genome Research. 1998. — v.8. -p.435−448.
  47. Githui W., Meme H., Juma E., et al. Isolation of multidrug-resistant tuberculosis strains in patients from private and public health care facilities in Nairobi, Kenya.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2004. — v.8. — p.837−841.
  48. Githui W., Jordaan A., Juma E., et al. Identification of MDR-TB Bei-jing/W and other Mycobacterium tuberculosis genotypes in Nairobi, Kenya.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2004. — v.8. — p.352−360.
  49. Glavac D., Dean M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.// Hum. Mutat. 1993. — v.2. — p.404−414.
  50. Go M., Kapur V., Graham D., Musser J. Population genetic analysis of Helicobacter pylori by multilocus enzyme electrophoresis: extensive allelic diversity and recombinational population structure.// J. Bacteriol. 1996. -v.178. — p.3934−3938.
  51. Grompe M. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids.//Nature Genet. 1993. — v.5. — p. l 11−116.
  52. Guerrero C., Stockmann L., Marchesi F., et al. Evaluation of the rpoB gene in rifampicin-susceptible and -resistant Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. il J. Antimicrob. Chemother. 1994. — v.33. -p.661−663.
  53. Hauer В., Serke M., Loddenkemper R. Various polyresistant strains of Mycobacterium tuberculosis in one patient (case report).// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. — v.3. — p. 122−123.
  54. Heifets L. Rapid automated methods (BACTEC system) in clinical mycobacteriology.// Sem. Respir. Infections. 1986. — v.l. — p.242−249
  55. Heifets L. Antituberculosis drugs: antimicrobial activity in vitro. In L.B. Heifets (ed.), Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections, 1st ed. CRC Press, Boca Raton, Fla. 1991. — p. 14−57.
  56. Heifets L. Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections. CRC Press, Boca Raton 1991. Chapter 3, p.89−121
  57. Heifets L. Drug susceptibility testing in mycobacteriology.// Clin. Lab. Med. 1996. — v.16. — p.641−656.
  58. Heifets L, Cangelosi G. Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis a neglected problem at the turn of the century.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. — 1999. — v.3. — p.564−581.
  59. Heifets L., Linder Т., Sanchez Т., et al. Two liquid medium systems, Mycobacteria Growth Indicator Tube and MB Redox Tube, for Mycobacterium tuberculosis isolation from sputum specimens.// J. Clin. Microbiol. -2000.-v.38.- p.1227−1230.
  60. Herrera L., Valverde A., Saiz P., et al. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated in the Philippines.// Int. J. Antimicrob. Agents Chemother. 2004. — v.23. — p.572−576.
  61. Heym В., Honore N., Truffot-Pernot C. Implications of multidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis: a molecular study.// Lancet. 1994. — v.344. — p.293−298.
  62. Heym В., Alzari P., Honore N., Cole S. Missense mutations in the catalase-peroxidase gene, katG, are associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. I I Mol. Microbiol. 1995. — v.15. — p.235−245.
  63. Hofling C., Pavan E., Giampaglia C., et al. Prevalence of katG Ser315 substitution and rpoB mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. — v.9 -p.87−93.
  64. Hunt J., Roberts G., Stockman L., et al. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens.//Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. — v. 18. — p.219−227.
  65. Iseman M., Madsen D. Drug-resistant tuberculosis.// Clin. Chest Med. 1989.- v.10. — p.341−353.
  66. Iseman M.D. Evolution of drug-resistant tuberculosis: a tale of two species.// Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1994. — v.91. — p.2428−2429.
  67. Jacobs W., Barleta R., Udani R., et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reported phages.// Science 1993. — v.260. — p.819−821.
  68. Jacobs R.F. Multiple drug-resistant tuberculosis.// Clin. Infect. Dis. -1994.-v.19.-p.l-8.
  69. Jin D., Gross C. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance.// J. Mol. Biol. -1988. v.202. — p.45−58.
  70. Kelley C. L., Rouse D. A., Morris S. L. Analysis of ahpC gene mutations in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis J I Antimicrob. Agents Chemother. 1997. — v.41. — p.2057- 2058.
  71. Kochi A., Vareldris В., Styblo K. Multidrug-resistant tuberculosis and its control.// Res. Microbiol. 1993. — v. 144. — p. 104−110.
  72. Kremer L., Dover L., Morbidoni H., et al. Inhibition of InhA activity, but not KasA activity, induces formation of a KasA-containing complex in Mycobacteria.// J. Biol. Chem. 2003. — v.278. — p.20 547−20 554.
  73. Lambregts-van Weezenbeek C.S.B. Drug-resistant tuberculosis.// Eur. Respir. Mon. 1997. — v.4. -p.298−326.
  74. Lee S., Tan K., Chew S., Snodgrass I. Multidrug-resistant tuberculosis.// Ann. Acad. Med. Singapore. 1995. — v.24. — p.442−446.
  75. Lucat-Rodgers G.S., Wengenack N.L., Rusnack F., Rodgers K.R., Carbon monoxide adducts of KatG and KatG (Ser315Thr) as probes of the heme site and isoniazid binding.// Biochemistry. 1999. — v.40. — p.149−157.
  76. Maiden M. Horizontal genetic exchange, evolution, and spread of antibiotic resistance in bacteria.// J. Clin. Infect. Dis. 1998. — v.27. — p. 12−20.
  77. Marrakchi H., Laneelle G., Quemard A. InhA, a target of the antituberculosis drug of isoniazid, is involved in a mycobacterial fatty acid elongation system, FAS-II.// Microbiol. 2000. — v. 146. — p.289−296.
  78. McClatchy J. Susceptibility testing of mycobacteria.// Clin. Lab. Med. 1978.- v.13.-p.908−912.
  79. McClure W.R., Cech C.L. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis.// J. Biol. Chem. 1978. — v.253. — p.8949−8956.
  80. McDermott P., Walker R., White D. Antimicrobials: modes of action and mechanisms of resistance.// Int. J. Toxicol. 2003. — v.22 — p. 13 5−143.
  81. Mduli K., Sherman D., Hickey M.J., et al. Biochemical and genetic data suggest that InhA is not the primary target for activated isoniazid in Mycobacterium tuberculosis .//J. Infec. Dis. 1994. — v.174. — p.1085−1090.
  82. Mduli K., Slayden R., Zhu Y., et al. Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis beta ketoacyl ACP sinthase by isoniazid.// Science 1998. -v.280. — p. 1607−1610.
  83. Mildvan D. Predictors and outcome of multidrug-resistant tuberculosis.// Clin. Infect. Dis. 1995. — v. 21. — p. 1245−1252.
  84. Miller L.P., Crawford J.T., Shinnick T.M. The rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis.// Antimicrob. Agents. Chemother. 1994. — v.39. -p.2484−2489.
  85. Mitchison D.A., Selcon J.B. The bactericidal activities of antituberculosis drugs.// Am. Rev. Tuberc. 1956. — v.74. — p. 116−123.
  86. Moore M., Onorato I., McGray E., Castro A. Trends in drug-resistant tuberculosis in the United States, 1993−1996.// JAMA. 1997. -v.278. — p.833−837.
  87. Musser J. Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: molecular genetic insights.// Clin. Microb. Rev. 1995. — v.8. — p.496−514.
  88. Nachamkin I., Kang C., Weinstein M. Detection of resistance to isoniazid, rifampin and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods.// Clin. Infect. Dis. 1997. — v.24. — p.894−900.
  89. National of Clinical Laboratory Standards: Antimycobacterial Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis.// Tentative standard. NCCLS Document M 24T. — 1995. — 44p.
  90. Neu H. The crisis in antibiotic resistance.// Science 1992. — v.21. -p.1064−1073.
  91. Ohno H, Koga H., Kohno S. et al. Relationship between rifampin MICs for and rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Japan.// Antimicrob. Agents Chemother. 1996. — v.40. — p. 1053−1056.
  92. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya T. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism.// Proc. Natl. Acad. Sci.(USA). 1989. — v.86. — p.2766−2770.
  93. Quemard A., Sacchettini J., Dessen A., et al. Enzymatic characterization of the target for isoniazid in Mycobacterium tuberculosis.// Biochemistry- 1995. v.4. — p.8235−8241.
  94. Ramaswamy S., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update.// Tubercle Lung Dis. 1998. — v.79. — p.3−29.
  95. Rattan A., Awdhesh K., Nishat A. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives.// Emerging Infect. Dis. 1998. -v.4.-p. 195−209.
  96. Rawat R., Whitty A., Tonge P. The isoniazid-NAD adduct is a slow, tight-binding inhibitor of InhA, the Mycobacterium tuberculosis enoil reductase: adduct affinity and drug resistanse.// Biochemistry 2003. — v. 100. — p.13 881−13 886.
  97. Roberts G., Goodman N., Heifets L., et al. Evaluation of the ВАСТЕС radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibility testing of M. tuberculosis.!7 J. Clin. Microbiol. 1983. — v.8. — p.689−696.
  98. Rohner P., Ninet В., Metral C., et al. Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the ВАСТЕС 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens.// J. Clin. Microbiol. 1997. -v.35. — p.3127−3131.
  99. Rouse D.A., Morris S.L. Molecular mechanisms of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis. ll Infect. Im-mun. 1995. — v.63. — p.1427−1433.
  100. Rouse D., Li Z., Bai G., Morris S. Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.// Antimicrob. Agents Chemother. 1998. — v.139. — p.2472−2477.
  101. Rozwarski D., Grant G., Barton D., et al. Modification of the NAD-H of the isoniazid target (InhA) from Mycobacterium tuberculosis./7 Mol. Diagn. 1998. — v.279. — p.98−102.
  102. Rusch-Gerdes S, Domehl C., Nardi G., et al. Multicenter evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs.// J. Clin. Microbiol. 1999. -v.37. — p.45−48.
  103. Saint-Joanis В., Souchon H., Wilming M., et al. Use of site-direct mutagenesis to probe the structure, function and isoniazid activation of thecatalase/peroxidase, KatG, from Mycobacterium tuberculosis. ll Biochemistry- 1999. v.38. — p.753−760.
  104. Sharma S., Mohan A. Multidrug-resistant tuberculosis.// Indian J. Med. Res. 2004. — v. 120. — p.354−376.
  105. Sherman D., Mduli K., Hickey M., et al. Compensatory ahpC gene expression in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis. il Science -1996. v.14. — p.1641−1643.
  106. Shinder D., Cauthen G., Farer L., et al. Drug-resistant tuberculosis.//Amer. Rev. Resp. Dis. 1991. — v.141. — Pt. 1. — p.732−732.
  107. Shinnik T. Molecular approach to the diagnosis of tuberculosis.// Tuberculosis: pathogenesis, protection and control. ASM press. Washington.- 1994. Chapter 30. — p.517−530.
  108. Siddiqi S., Libonati J., Middlebrook G. Evaluation of rapid radiometric method for drug susceptibility testing of M. tuberculosis. il J. Clin. My-crobiol. 1981. — v.13. — p.908−912.
  109. Singh R., Wiseman В., Deemagarn Т., et al. Catalase-peroxidases (KatG) exhibit NADH oxidase activity.// J. Biol. Chem. 2004. — v. 279. — p. 43 098−43 106.
  110. Slayden R.A., Barry C.E. The role of KasA in the biosynthesis of meromycolic acids and isoniazid resistance in Mycobacterium tubercuiosis. il Tuberculosis. 2002. — v.82. — p. 149−160.
  111. Spratt B. Resistance to antibiotics mediated by target alterations.// Science -1994. v.264. — p.388−393.
  112. Stoecle M., Guan L., Riegler N., et al. Catalase-peroxidase gene sequences in isoniazid-sensitive and -resistant strains of Mycobacterium tuberculosis from New York City.// J. Infect. Dis. 1993. — v.168. — p.1063−1065.
  113. Subhash H., Ashwin I., Mukundan U., et al. Drug resistant tuberculosis in diabetes mellitus: a retrospective study from South India.// Trop. Doct. 2003. — v.33. — p.154−156.
  114. Takayama К., Wang L., David H. Effect of isoniazid on the in vivo mycolic acids synthesis, cell growth, and viability of Mycobacterium tuberculosis. II Antimicrob. Agents Chemother. 1972. — v. 2. — p. 29−35.
  115. Taniguchi H., Aramaki H., Nikaido Y. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis. il FEMS Microbiol. Lett. 1996. — v. 144. — p.103−108.
  116. Teleneti A. Genetics of drug resistance in tuberculosis.// Clin. Chest Med. 1997.- v.18. — p.55−64.
  117. Teleneti A., Imborden P., Marchesi F., et al. Detection of rifam-picin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis.// Lancet 1993. -v.341. — p.647- 650.
  118. Vilcheze C., Weisbrod Т., Chen В., et al. Altered NADH/NAD+ ratio mediates coresistance to isoniazid and ethionamide in mycobacteria.// Antimicrob. Agents Chemother. 2005. — v.52. — p.708−720.
  119. Wang J., Burger R., Drlica K. Role of superoxide in catalase-peroxidase-mediated isoniazid action against mycobacteria.// Antimicrob Agents Chemother. 1998. — v.42 -p.709−711.
  120. Watterson S., Wilson S., Yates M., Drobniewski F. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. l'/J. Clin. Microbiol. 1998. — v.36. — p.1969−1973.
  121. Wei C., Lei В., Musser J., Tu S. Izoniazid activation defects in recombinant Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (KatG) mutants evident in InhA inhibitor production.// Am. Soc. Microbiol. 2003. — v.47. -p.670−675.
  122. Wengenack N.L., Uhl J.R., St Amand A.L., et al. Recombinant Mycobacterium tuberculosis KatG (S315T) is a competent catalase-peroxidase with reduse activity toward isoniazid.// J. Infec. Dis. 1997. — v. 176. — p.727−722.
  123. Wengenack N.L., Todorovic S., Yu L., Rusnak F. Evidence of differential binding of isoniazid in Mycobacterium tuberculosis KatG and isoni-azid-resistant mutant KatG (S315T).// Biochemistry 1998. — v.37. -p.15 825−15 834.
  124. Williams D., Waguesrpack C., Eisenach K., et al. Characterization of rifampin resistance in pathogenic mycobacteria.// Antimicrob. Agents Chemother. -1994. v.38. — p.2380−2386.
  125. Williams D., Limbers C., Spring L. PCR-heteroduplex detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. l I In: PCR protocols for emerging infectious diseases. D. Persing (ed.). 1996. — p. 122−129.
  126. Wilson Т., Collins D. ahpC, a gene involved in isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis complex.// Mol. Microbiol. 1996. — v. 19. -p.1925−1934.
  127. Winder F.G., Collins P.B. Inhibition by isoniazid of synthesis of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. l/ J. Gen. Microbiol. 1970. -v.63. — p.41−48.
  128. The World Health Report, 1998.// Life in the 21-st century. A vision for all. Geneva. — 1998. — 54 p.
  129. Wu X., Zhang J., Zhuang Y., et al. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.// J. Chin. Med. -1999.-v.112, — p.524−528.
  130. Yeh R., Hopewell P., Daley C. Simultaneous infection with two strains of Mycobacterium tuberculosis identified by restriction fragment length polymorphism analysis.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. — v.3. -p.537−539.
  131. Zhao X., Girotto S., Yu S., Magliozo R. Evidence for radical formation at Tyr353 in Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (KatG).// J. Biol. Chem. 2004. — v.279. — p.7606−7612.
  132. Zwolska Z., Augustynowicz-Kopec E., Klatt M. New automated, non-radiometric system for the culture of mycobacteria MB/BacT.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. — v.3. — Suppl.l. — 112 p.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!