Самодиффузия в многофазных системах с ограничениями

Актуальность проблемы. Многокомпонентные гетерогенные системы с микронными и субмикронными размерами внутренних неоднородно-стей находят исключительно широкое применение в жизни и практической деятельности человека. Наиболее простыми представителями таких систем •являются пористые вещества насыщенные жидкостью. Это неорганические вещества природного (глины, пески, минералы, нефтесодержащие породы) и искусственного (катализаторы, строительные материалы, бытовая и медицинская керамика) происхождения. Более сложные явления характерны для органических гетерогенных веществ, например полимерных композиционных материалов, гелей, эмульсий. Еще более сложны биологические объекты. В последние годы предпринимаются многочисленные усилия для исследования структуры и физических свойств таких систем с применением различных физико-химических методов. Раскрытие универсальных для данных систем закономерностей, также как исследование особенностей каждого из перечисленных вида и подвидов гетерогенных систем требует проведения исследований как теоретических, так и экспериментальных на всех уровнях от молекулярного до макроскопического.

В последнее десятилетие, наряду с традиционными методами исследования пористых и гетерогенных систем, большое развитие получили методы, которые построены на основе изучения протекания в пористой среде физических процессов — поступательного движения молекул (самодиффузии) [1−3] и фазовых переходов [4−7]. В качестве метода регистрации этих процессов, как показали предшествующие исследования, наибольшими преимуществами обладает метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) благодаря своей низкой энергии воздействия, высокой проникающей способности и возможности изучения процессов на молекулярном уровне.

К настоящему времени на модельных, упрощенных объектах наработаны наиболее общие теоретические [8−12] и экспериментальные подходы [13−15] к анализу самодиффузии в гетерогенных системах. Наибольший прогресс сделан благодаря работам сотрудников лабораторий Шлюмберже (США), Каллахана (Новая Зеландия), Каргера с сотрудниками (Германия) и Кафедры молекулярной физики Казанского университета (Россия). Ими изучены закономерности самодиффузии низкомолекулярных веществ различной полярности, а также полимеров, в пористых средах с различной геометрией в широком диапазоне размеров пор, в полностью и частично насыщенном состоянии среды [6, 16−19]. Разработаны экспериментальные методики определения размеров пор [4, 20].

Несмотря на достаточно большое количество экспериментальных работ, которое на сегодняшний день исчисляется тысячами, многие проблемы остаются неисследованными. Так вопросы получения информации о структуре среды по данным молекулярной подвижности рассматривались только для наиболее простых моделей, при этом анализируется, как правило, усредненное значение коэффициента самодиффузии. Не рассматривался вопрос однозначности соотнесения подвижности введенной жидкости и структуры. Наибольшее внимание уделяется характеристикам индивидуальной поры, а вопросы связности исследованы в значительно меньшей степени. При рассмотрении фазовых переходов веществ, введенных в пористую среду, детально рассматривалось только плавление низкомолекулярных жидкостей. Не исследованы особенности процесса кристаллизации в пористой среде связанные со структурой среды. Не рассмотрены фазовые переходы в таком практически важном классе адсорбатов как полимеры.

К актуальным задачам биологии, медицины и биотехнологии относится исследование процессов в биологических дисперсных системах. В биологических объектах (ткани, лекарственные препараты, пищевые продукты, и др.) границы клеточных и субклеточных структур образованы бислойными мембранами, состоящими, в основном из липидов. Удобной моделью биомембраны является бислой, образующийся при смешении липида с водой. Благодаря отмеченным выше особенностям (низкая энергия воздействия и высокая проникающая способность радиоизлучения) метод ЯМР ИГМП имеет преимущество при исследовании биологических систем (особенно живых или моделирующих живые), однако возможности его использования до сих пор ограничены, в частности, из-за отсутствия подходящих методик анализа результатов эксперимента.

Целью работы является:

1. Экспериментальное исследование самодиффузии молекул жидкостей в пористых системах, использование для этого анализа зависимостей коэффициентов самодиффузии и формы диффузионных затуханий спинового эхо от времени диффузии. Разработка методов, расширяющих возможности ЯМР ИГМП для получения информации о самодиффузии и структуре поро-вого пространства в пористых телах.

2. Исследование самодиффузии в двухфазных аморфно — кристаллических полимерах, в ходе кристаллизации и плавления. Изучение влияния кинетики фазового перехода в этих системах на структуру образовавшихся фаз и молекулярную подвижность в аморфной фазе.

3. Изучение особенностей самодиффузии в модельных биологических системах: биологических мембранах и мультислойных везикулах, в том числе в условиях фазового разделения. Выяснение влияния состава и температуры на самодиффузию липидов в биомембранах.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовались: пористые системы — осадочные горные породы: песчаники, известняк, мелобразцы гипсового камня, углеродные адсорбенты, стекла с узким и известным распределением размеров порадсорбаты — вода, низкомолекулярные углеводороды, кристаллизующиеся и некристаллизующиеся линейные синтетические полимерыа также гетерогенные системы — многофазные липидные бислои, дисперсии лецитина в воде и частично-кристаллические полимеры и смеси полимеров. Критерием при выборе объектов являлись их охарактеризованность, изученность другими методами и возможность наблюдения явлений типичных для исследуемых классов объектов.

Измеряемые параметры. При исследовании самодиффузии измеряли диффузионные затухания стимулированного спинового эхо в зависимости от квадрата амплитуды импульса градиента поля. Коэффициент самодиффузии определяли из наклона затухания. В случае неэкспоненциального затухания производили его разложение, согласуясь с природой исследуемой системы, зависимостью от времени диффузии и варьируемых параметров эксперимента. При исследовании ЯМР релаксации получали спады поперечной намагниченности, спады и восстановления продольной намагниченности. Динамическую степень кристалличности определяли путем разложения спадов поперечной намагниченности в частично кристаллических образцах.

Научная новизна. В работе получены следующие новые результаты:

— Предложены новые подходы к проведению эксперимента ЯМР ИГМП для получения информации о самодиффузии и структуре пористых систем. Разработана импульсная последовательность, позволяющая более детально исследовать структуру порового пространства.

— Для установления деталей структуры порового пространства разработана методика, основанная на исследовании самодиффузии в жидкой фазе в условиях последовательного исключения из диффузионного затухания части сигнала диффузанта в порах большего размера. Такая методика, названная «криодиффузометрия», позволяет оценивать среднеквадратичные размеры участков порового пространства и исследовать их связность.

— Впервые на примере фракций полиэтиленоксида с молекулярными массами от 1500 до 40 000, их смесей и смесей с фракциями некристалли-зующегося полипропиленоксида изучена самодиффузия в системах, в которых изменение структуры ограничений производится путем варьирования концентрации некристаллизующегося компонента и условий кристаллизации. Показано, что метод ЯМР ИГМП позволяет получить информацию о размерах и сообщаемости межфибриллярных аморфных областей. Установлено, что зависимости размеров этих областей от температуры кристаллизации и концентрации кристаллизующегося компонента для исследованных систем согласуются с феноменологической моделью фибриллярной кристаллизации. Установлено, что в ходе кристаллизации молекулярно-массовое фракционирование является основной причиной изменения коэффициента самодиффузии.

— На примере фракций полиэтиленоксида, введенных в пористые среды с диаметром пор от 40 до 1440 А, выявлена роль основных факторов, влияющих на кинетику кристаллизации полимера в условиях ограничений. Показано, что скорость кристаллизации определяется, в основном, изменением числа конформационных состояний макромолекулы в присутствии ограничений и геометрией порового пространства. Установлено существование критического размера пор d*, близкого к минимальной толщине кристаллической ламели. В порах больше d* происходит ламеллярная кристаллизация, аналогично объемному полимеру, а при размере пор меньше d* кристаллическая структура разупорядочена по сравнению с объемным полимером и может быть отнесена к мицелярному типу. Показано, что во всех исследованных системах самодиффузия молекул не является определяющим фактором кристаллизации.

— Для плоских бислоев ряда фосфолипидов (модельных биомембран) детально исследована латеральная самодиффузия фосфолипидов в зависимости от температуры и доли насыщенных углеводородных цепей, а также содержания холестерола в условиях ориентации образца под «магическим углом» (54,7°) относительно магнитного поля. Показано, что процесс самодиффузии в таких системах характеризуется моноэкспоненциальным диффузионным затуханием. При этом с ростом доли насыщенных цепей коэффициент самодиффузии уменьшается, а энергия активации процесса самодиффузии увеличивается. Зависимости коэффициента самодиффузии и энергии активации от доли насыщенных цепей носят неаддитивный характер.

— Для бислойных систем, содержащих бинарные смеси ряда насыщенных фосфолипидов с холестеролом, впервые методом ЯМР систематически исследована самодиффузия в условиях жидкокристаллического фазового расслоения на упорядоченную (обогащенную холестеролом и характеризующуюся большим порядком в расположении цепей) и неупорядоченную фазы. На основе анализа концентрационных и температурных зависимостей коэффициентов самодиффузии липидов показано, что упорядоченная фаза характеризуется пониженными (до ~3 раз) значениями коэффициентов самодиффузии и повышенными (до ~2 раз) значениями энергии активации самодиффузии липида по сравнению со значениями для неупорядоченной фазы. Границы области фазового разделения по данным ЯМР ИГМП согласуются с данными других методов.

— Для бислоев фосфолипида, содержащего 50% насыщенных цепей, используя ЯМР ИГМП, впервые экспериментально по признакам отклонения температурной зависимости коэффициента самодиффузии от Аррениу-совой формы и нарушению монотонной зависимости коэффициента самодиффузии от концентрации холестерола обнаружено присутствие упорядоченной жидкокристаллической фазы в узком температурном интервале вблизи перехода жидкий кристалл — гель.

— Впервые исследована самодиффузия в бислоях липидов, содержащих тройную смесь компонентов, соответствующих основным компонентам клеточной мембраны (холестерол, фосфолипид с ненасыщенными цепями, сфингомиелин — фосфолипид с насыщенными цепями), в которых могут образовываться особые домены («rafts») упорядоченной ЖК фазы с повышенным содержанием сфингомиелина и холестерола. И в этом случае, также как для бинарных смесей, границы области фазового разделения по данным ЯМР ИГМП согласуются с данными других методов. Установлены характерные особенности трансляционной динамики фосфолипидов в «rafts», отличающие их от окружающей неупорядоченной ЖК фазы: пониженные коэффициенты самодиффузии липидов (до ~5 раз) и более высокая энергия активации самодиффузии (до ~2 раз). Показано, что данные ЯМР ИГМП могут быть использованы для построения фазовой диаграммы бислоев, образующих «rafts» .

— Установлено, что двухкомпонентная форма диффузионного затухания в этих системах обусловлена вкладом от молекул фосфолипидов в «rafts» и в окружающей жидкокристаллической фазе. Независимость формы диффузионного затухания от времени диффузии свидетельствует о выполнении условий медленного обмена между молекулами этих фаз и об отсутствии эффектов ограничений, связанных с наличием границы фазового раздела. Сделанные на основании этих фактов оценки размеров «rafts» согласуются с данными флуоресцентной микроскопии, полученными для подобных систем.

— На примере латеральной самодиффузии в системе лецитин-вода при концентрациях, соответствующих образованию мультислойных везикул, рассмотрены особенности самодиффузии для случая сферической формы ограничений. На основе анализа полученных экспериментальных данных разработана модель самодиффузии в тонком сферическом слое. Применение этой модели позволило впервые для систем лецитин-вода описать зависимость формы диффузионного затухания ЯМР от времени диффузии в диапазоне от миллисекунд до секунд при использовании одного фиксированного набора структурных (радиусы везикул) и динамических (коэффициенты самодиффузии) параметров.

Практическая и научная ценность. Научная ценность работы обусловлена новизной полученных результатов и возможностью применения обнаруженных закономерностей и разработанных методик к исследованию структуры различных пористых систем. Предложенные новые экспериментальные методики качественно расширяют возможности метода ЯМР ИГМП для исследования структуры гетерогенных систем различной природы. Установленные закономерности кристаллизации и плавления полимеров в пористых средах могут быть использованы для прогнозирования и управления свойствами полимерного компонента в химической технологии (каталитическая полимеризация, армирование полимеров и др.), экологии и нефтяной индустрии (управление фильтрационными свойствами горных пород). Предложенные методики анализа диффузионных затуханий намагниченности ЯМР в дисперсиях лецитина могут быть использованы для определения размеров везикул других липидных систем, а также для анализа микроструктуры эмульсий, образуемых различными эмульгирующими веществами, применяемых в биологии, медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности. Обнаруженные особенности самодиффузии в двухи трехкомпонентных ориентированных бислоях липидов показывают роль состава (в частности, концентрации холестерола, содержания воды) и температуры на фазовое состояние и подвижность молекул липида в биомембранах, что важно, в особенности, для биологии мембран. Проведенные исследования показывают, что метод ЯМР ИГМП может быть применен для широкого круга гетерогенных систем, в том числе в условиях фазовых переходов.

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики КГУ и является частью проводимых здесь исследований трансляционной молекулярной подвижности в гетерогенных системах, в том числе исследований, проведенных в рамках научно-образовательного центра КГУ (грант BRHE, REC-007). Часть работы выполнена в сотрудничестве с кафедрой биофизической химии Университета Умео (Швеция).

Достоверность полученных результатов. Достоверность измерений обеспечивалась комплексным характером проведенных экспериментальных исследований, многократной повторяемостью измерений. При этом в дополнении к методу ЯМР ИГМП применялись методы ЯМР релаксации, ЯМР высокого разрешения на 'Н, 2Н и 31Р, широко и малоугловое рентгеновское рассеяние, оптическая микроскопия, дифференциальная сканирующая калориметрия. При проведении исследований использовались образцы с характеристиками, известными из справочных данных или определенными с помощью стандартных методов. Экспериментальные данные обрабатывались с использованием стандартных методов, а в тех случаях, когда применялись новые методы обработки, это теоретически обосновывалось. Полученные результаты неоднократно докладывались на конференциях и совещаниях, где они анализировались на предмет их достоверности и согласия с результатами, полученными другими научными группами.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ в 1988;2000 годах, на III Всесоюзной конференции по пластификации полимеров (Суздаль, 1988), Всесоюзной конференции «Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве» (Казань, 1988) XXIV конгрессе Ампера (Познань, 1988), конференции «MARECO'89» (Лейпциг, 1989), XIX Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Дрезден, 1989), II Всесоюзной конференции «Смеси полимеров» (Казань, 1990), II Всесоюзном совещании «Динамика макромолекул» (Казань, 1990), Всесоюзной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (Ленинград, 1990), XV Всесоюзной конференции по химической технологии неорганических веществ (Казань,.

1991), VI конференции Технического университета в Кошице (Кошице,.

1992), II Всероссийской конференции «Нефтехимия-92» (Нижнекамск, 1992), на XXVII конгрессе Ампера (Казань, 1994), Всероссийском совещании «Физико-химические методы исследования структуры и динамики молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 1994), Конференции университета в Кошице с приглашением международных участников (Кошице, 1994), V конференции по химии и физикохимии олигомеров (Черноголовка, 1994), III Всероссийской конференция по интенсификации нефтехимических процессов «Нефтехимия-94» (Нижнекамск, 1994), VI Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Франция, 1995), XIII совещании международного общества по гематологии (Стамбул, 1995), Всероссийском семинаре «Структура и динамика полимерных систем» (Йошкар-Ола, 1995), IV конференции по интенсификации нефтехимических процессов «Нефте-химия-96» (Нижнекамск, 1996), XIII Европейской конференции по экспериментальному ЯМР (Париж, 1996), IV Международном совещании по новейшим достижениям ЯМР в пористых средах (Тронхейм, 1997), Международном совещании по пористым средам (Дельфы, 1998), III Международном симпозиуме «Молекулярная подвижность и порядок в полимерных системах» (Санкт-Петербург, 1999), VI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (КазаньЙошкар-Ола, 1999), 5 Международной конференции по магнитной резонансной микроскопии (Гейдель-берг, 1999), VII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (МоскваЙошкар-Ола, 2000), Biophysical Society 46 Annual Meeting (San Francisco, 2002), Biophysical Society 47 Annual Meeting (San Antonio, 2003), Конференции по ЯМР-Микроскопии (Гётеборг, 2003).

Содержание диссертации опубликовано в 92 печатных работах, включающих в себя 27 журнальных статей, 18 статей в сборниках, 47 тезисов в трудах научных конференций и совещаний.

Личный вклад автора. Автору принадлежат большая часть основных идей постановки работы, большая часть экспериментального материала, основные идеи по интерпретации результатов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения, представленного в виде выводов, изложена на 282 страницах машинописного текста, содержит 115 рисунков и 32 таблицы. Список используемой литературы содержит 300 наименования.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

Методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля исследована самодиффузия молекул жидкости в системах различной природы с различной геометрией ограничений: полностью насыщенных жидкостью пористых системах, кристаллизующихся полимерах, плоских ориентированных многокомпонентных бислоях липидов и мультислойных липидных везикулах. Рассмотрена возможность получения информации о структуре этих систем из данных о самодиффузии молекул в жидкой фазе с помощью существующих методик анализа ограниченной самодиффузии.

Показано, что при исследовании самодиффузии в системах с распределением размеров или анизотропной формой пор экспериментальные данные, полученные с помощью стандартных методик ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля, не позволяют выявить детали исследуемой структуры. Для решения этой проблемы: а) разработана специальная последовательность, содержащая дополнительный временной интервал для анализа развития процесса самодиффузии после частичного подавления сигнала и позволяющая избирательно исследовать самодиффузию отдельных групп молекул, различающихся КСДб) разработана методика, основанная на использования эффекта Гиббса-Томпсона, позволяющая избирательно исключать сигнал эхо от части жидкости в крупных порах путем ее замораживания. При этом оставшийся сигнал относится к молекулам жидкой фазы в порах меньшего размера, самодиффузия в которых может быть исследована методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Преимущества разработанных методик продемонстрированы на примере исследования структуры гипсового камня.

Показано, что при кристаллизации полимера изменение формы диффузионного затухания обусловлено главным образом изменением концентрации кристаллизующегося компонента в аморфной фазе и его молеку-лярно — массовым фракционированием. Эффекты, связанные с неравновесностью процесса, не являются доминирующими. На примере частично-кристаллического полимера полиэтиленоксида показано, что с точки зрения самодиффузии макромолекул он может быть рассмотрен как микро пористая среда, образованная кристаллическими фибриллами. Для самодиффузии в межфибриллярном пространстве могут наблюдаться коротковременной, промежуточный и длинно-временной режимы, типичные для самодиффузии низкомолекулярных жидкостей, введенных в пористые тела. Среднеквадратичные смещения, соответствующие переходам между режимами, зависят от концентрации некристаллизующегося компонента в системе и температуры кристаллизации, определяющими сформировавшуюся структуру ограничений. На примере фракций полиэтиленоксида, введенных в пористые среды с диаметром пор от 40 до 1440 А, выявлена роль основных факторов, влияющих на кинетику кристаллизации полимера в условиях ограничений. Показано, что скорость кристаллизации определяется, в основном, изменением числа конформационных состояний макромолекулы в присутствии ограничений и геометрией порового пространства. Установлено существование критического размера пор d*, близкого к минимальной толщине кристаллической ламели, больше и меньше которого структура надмолекулярных кристаллических образований различна. В порах больше d* происходит ламеллярная кристаллизация, аналогично объемному полимеру, а при размере пор меньше d* кристаллическая структура разупорядочена по сравнению с объемным полимером и может быть отнесена к мицеллярному типу. Показано, что во всех исследованных системах самодиффузия молекул не является определяющим фактором кристаллизации.

Для плоских бислоев ряда (диолеоилфосфатидилхолин, пальмитоило-леоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин) фосфолипи-дов (модельных биомембран) в условиях ориентации образца под «магическим углом» относительно магнитного поля детально исследована латеральная самодиффузия фосфолипидов в зависимости от температуры и доли насыщенных углеводородных цепей, а также содержания холестерола. Показано, что процесс самодиффузии в этих системах характеризуется моноэкспоненциальным диффузионным затуханием. При этом с ростом с доли насыщенных цепей коэффициент самодиффузии уменьшается, а энергия активации процесса самодиффузии увеличивается. Зависимость коэффициента самодиффузии и энергии активации от доли насыщенных цепей носит неаддитивный характер. Для бислойных систем, содержащих бинарные смеси ряда (димиристо-илфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, сфингомиелин) насыщенных фосфолипидов с холестеролом, впервые методом ЯМР систематически исследована самодиффузия в условиях жидкокристаллического фазового расслоения на упорядоченную (обогащенную холестеролом и характеризующуюся большим порядком в расположении цепей) и неупорядоченную фазы. Анализ концентрационных и температурных зависимостей коэффициентов самодиффузии липидов, проведенный во всей области исследования, позволил определить коэффициенты самодиффузии, соответствующие неупорядоченной и упорядоченной жидкокристаллическим фазам. Показано, что упорядоченная фаза характеризуется пониженными (до ~3 раз) значениями коэффициентов самодиффузии и повышенными (до ~2 раз) значениями энергии активации самодиффузии липида по сравнению со значениями для неупорядоченной фазы. Границы области фазового разделения по данным ЯМР ИГМП согласуются с данными других методов.

Для бислоев фосфолипида, содержащего 50% насыщенных цепей (паль-митоилолеоилфосфатидилхолин), впервые экспериментально (по признакам отклонения температурной зависимости от Аррениусовой формы и нарушению монотонной зависимости коэффициента самодиффузии от концентрации холестерола) обнаружено присутствие упорядоченной жидкокристаллической фазы в узком температурном диапазоне вблизи перехода жидкий кристалл — гель.

Впервые исследована самодиффузия в бислоях липидов, содержащих тройную смесь компонентов, соответствующую основным компонентам клеточной мембраны (холестерол, фосфолипид с ненасыщенными цепями и сфингомиелин — фосфолипид с насыщенными цепями), в которых могут образовываться особые домены («rafts») упорядоченной ЖК фазы с повышенным содержанием сфингомиелина и холестерола. а) Установлены характерные особенности трансляционной динамики фосфолипидов в «rafts», отличающие их от окружающей неупорядоченной ЖК фазы: пониженные коэффициенты самодиффузии липидов (до ~5 раз) и более высокая энергия активации самодиффузии (до ~2 раз). Показано, что данные ЯМР с импульсным градиентом поля могут быть использованы для построения фазовой диаграммы бислоев, образующих «rafts». б) Установлено, что двухкомпонентная форма диффузионного затухания в этих системах обусловлена наличием вкладов от молекул фосфолипидов в «rafts» и в окружающей жидкокристаллической фазе. Независимость формы диффузионного затухания от времени диффузии свидетельствует о выполнении условий медленного обмена между молекулами этих фаз и об отсутствии эффектов, связанных с наличием границы фазового раздела. Сделанные на основании этих фактов оценки размеров доменов «rafts» не противоречат данным флуоресцентной микроскопии.

10 На основе экспериментальных данных, полученных для системы лецитин-вода при концентрациях, соответствующих образованию мультис-лойных везикул, рассмотрены особенности самодиффузии при сферической форме ограничений, разработана и применена модель самодиффузии в тонком сферическом слое. Применение этой модели позволило впервые для такого типа дисперсных систем описать зависимость формы диффузионного затухания ЯМР от времени диффузии в диапазоне от миллисекунд до секунд при использовании одного фиксированного набора структурных и динамических (коэффициенты самодиффузии) параметров. т.