Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста

Диссертация: Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в XXI веке. Так как опухоль представляет собой совокупность бесконтрольно делящихся клеток, то для терапии опухолей самой предпочтительной мишенью является блокада сигнальных путей, ответственных за запуск митотических процессов. Одним из ключевых механизмов проведения таких сигнальных путей является рецептор эпидермального… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Злокачественные опухоли и механизм их образования
    • 1. 2. Рецептор эпидермального фактора роста и его роль в клетках опухолей
      • 1. 2. 1. Строение рецептора эпидермального фактора роста
      • 1. 2. 2. Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста
      • 1. 2. 3. Путь эндоцитоза и деградации рецептора эпидермального фактора роста
      • 1. 2. 4. Блокаторы рецептора эпидермального фактора роста
    • 1. 3. Исследование взаимодействия сигнальных путей при помощи синтетической летальности
    • 1. 4. Биосинтез стеролов их роль и в клетках
      • 1. 4. 1. Путь биосинтеза стеролов
      • 1. 4. 2. С4-деметилирующий комплекс
    • 1. 5. Метаболизм стеролов и опухоли

Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы.

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в XXI веке. Так как опухоль представляет собой совокупность бесконтрольно делящихся клеток, то для терапии опухолей самой предпочтительной мишенью является блокада сигнальных путей, ответственных за запуск митотических процессов. Одним из ключевых механизмов проведения таких сигнальных путей является рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР), стимулирующий деление клеток после активации факторами роста. Это привело к созданию многочисленных блокаторов этого рецептора, которые показали хорошие результаты при исследованиях in vitro (Jimeno and Hidalgo, 2005; Laskin and Sandler, 2004). Однако в клинической практике блокада рецептора ЭФР оказалась значительно ниже предполагаемой вследствие развития опухолями первичной или приобретенной резистентности к используемым препаратам (Hopper-Borge et al., 2009).

Таким образом, поиск способов усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР является крайне актуальной проблемой современной онкологии, над котороый работают многочисленные лаборатории в России и за рубежом. Большинство опубликованных по данной теме работ направлены на изменение структуры самого лекарственного средства для усиления его эффективности и уменьшения вероятности развития резистентности клетками опухолей (Elloumi et al., 2012).

В данной работе был использован новый подход к увеличению эффективности блокаторов рецептора ЭФР. Во многих случаях причиной развития приобретенной резистентности является запуск альтернативных сигнальных путей, поэтому в качестве основы для работы было взято устранение этого обхода. Сигнальная система клеток представляет собой огромную сеть пересекающихся путей, которые до сих пор остаются не до конца изученными. Так как спрогнозировать путь обхода клеткой опухоли блокады рецептора на современном этапе не представляется возможным, то в качестве средства поиска альтернативных путей использовались опубликованные скрининговые исследования, указывающие точечно на гены, которые при их блокаде могут усилить эффект ингибирования рецептора ЭФР (Astsaturov et al., 2010).

Для сужения огромных баз данных были выбраны гены, относящиеся только к пути метаболизма стеролов. Блокада биосинтеза холестерола сама по себе была описана в качестве способа замедления роста опухоли (Israel and Schwartz, 2011), и вместе с сенситизирующим эффектом к ингибиторам рецептора ЭФР может оказаться эффективным средством в терапии опухолей.

В соответствии с вышеизложенным в данной работе была поставлена цель — описать механизм влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР.

2. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы.

3. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов.

4. Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

Научная новизна.

В данной работе было впервые исследовано взаимодействие пути биосинтеза стеролов с сигнальным путем рецептора ЭФР. Показано, что эффект на жизнеспособность опухолевых клеток оказывает не сам факт блокады пути, а точечное ингибирование активности определенных генов, кодирующих этап С4-деметилирования предшественника холестерола. При этом было впервые описано, что эти гены контролируют такой общий клеточный процесс, как везикулярный транспорт, что не относится к их непосредственной функции. Это изменение движения везикул и является основной причиной развития опухолями сенситизации к лечению блокаторами рецептора ЭФР. Научно-практическая значимость работы.

Полученные результаты представляют интерес для разработки новых лекарственных препаратов, которые будут усиливать эффект лечения пациентов антагонистами рецептора ЭФР, а также будут препятствовать развитию приобретенной резистентности опухолевыми клетками к данной терапии.

Кроме этого описанные взаимодействия являются крайне интересными для понимания процессов внутриклеточного везикулярного транспорта, так как описан абсолютно новый механизм модификации данного процесса посредством блокирования генов из пути биосинтеза стеролов. Таким образом, полученные данные представляют интерес как с практической точки зрения в качестве лекарственного препарата, так и с точки зрения таких теоретических дисциплин, как молекулярная биология и биохимия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование двух ферментов С4-деметилирующего комплекса из пути биосинтеза стеролов увеличивают чувствительность опухолевых клеток к блокаде рецептора ЭФР.

2. Блокада С4-деметилирования приводит к изменению внутриклеточного движения везикул, что в результате ускоряет лизосомальную деградацию рецептора ЭФР.

3. Рост ксенографтных опухолей с выключенным ферментом из пути С4-деметилирования подавляется практически полностью лечением блокаторами рецептора ЭФР.

Апробация работы.

Результаты исследования докладывались на ежегодных конференциях «Актуальные проблемы биохимии и нанотехнологии» (Казань, 2012 и 2013), на III Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2012; приз за лучший устный доклад), на 50-й ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (Филадельфия, США, 2010), на 13-й конференции онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2011; второе место в постерной сессии), на конференции «Метаболизм и опухоль» Американской ассоциации исследования опухоли (Балтимор, США, 2011), на конференции «Молекулярные мишени и терапия опухоли» Американской ассоциации исследования опухоли (Сан-Франциско, США, 2011), на I конференции университета Тэмпл (Филадельфия, США, 2012). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в список ВАК и 2 публикации в журналах базы SCOPUS.

Структура и объем диссертации

.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок. Библиография включает 141 наименование.

ВЫВОДЫ.

1. Удаление ферментов БС4МОЬ и катализирующих реакцию С4-деметилирования на дистальном участке пути биосинтеза стеролов, значительно сенситизирует опухолевые лини А431, 8СС61, 8СС68 и РС9 к воздействию антагонистов рецептора ЭФР эрлотинибу и цетуксимабу. Это данные подтвердились как при проведении миРНК трансфекции клеток, так и при использовании мшРНК против соответствующих генов.

2. Биоинформативный анализ генетических и физических взаимодействий ортолога гена 8С4МОЬ в 8ассЬагошусез сегеу1з1ае показал, что 28% всех взаимодействий приходится на гены, регулирующие внутриклеточный везикулярный транспорт.

3. Удаление ферментов 8С4МОЬ иБНЬ в клеточной линии 8СС61 приводит к изменению внутриклеточного транспорта рецептора ЭФР, направляя его преимущественно в сторону деградации. Это уменьшает общий активный пул рецептора, приводя к снижению активности основных онкогенных сигнальных путей.

4. Ксенографтные опухоли с удаленным ферментом 8С4МОЬ растут значительно медленней без лечения по сравнению с контрольными клетками и полностью останавливают рост при лечении цетуксимабом.

1.6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Описанные данные свидетельствуют о большой значимости поиска средств усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР для лечения онкологических заболеваний. В качестве способа усиления эффективности в данной работе использовалась блокада пути биосинтеза стеролов на его дистальном участке, так как анализ опубликованной литературы показал, что этот путь, никогда ранее не исследуемый с этой точки зрения, может влиять на активность рецептора ЭФР. В качестве опухолевой модели были выбраны клеточные линии опухолей, зависимых от сигнальной активности рецептора ЭФР.

В соответствии с выше изложенным в данной работе была поставлена цель — описать механизм влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

5. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР.

6. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы.

7. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов.

8. Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Реактивы и оборудование.

Реактивы.

CellTiter Blue FF-MAS NaCl NaOH SDS T-MAS Аннексии V.

Бычий сывороточный альбумин Вторичные антитела с флуоресцентными метками AlexaFluor488 и AlexaFluor555 Вторичные антитела с флуоресцентными метками IRDye680 и IRDye 800 Диметилсульфоксид Ингибиторы протеаз Ингибиторы фосфатаз Краситель трипановый синий Ланостерол.

Лизирующий буффер RIPA миРНК.

Параформальдегид.

Promega (США).

Avanti (США).

Fisher (США) Fisher (США) Sigma-Aldrich (США) Avanti (США).

Guava Technologies (США) Sigma-Aldrich (США) Invitrogen (США).

Licor (США).

Sigma-Aldrich (США) Thermo Scientific (США) Thermo Scientific (США) Sigma-Aldrich (США) Sigma-Aldrich (США).

Sigma-Aldrich (США).

Qiagen (США).

Electron Microscopy Sciences.

США).

• Первичные антитела Cell Signaling (США).

• Питательная среда DMEM, содержащая LInvitrogen (США) глутамин, 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.

• Протеин-О-конъюгированные агарозные Thermo Scientific (США) бусы.

• Раствор Трипсина-ЭДТА Invitrogen (США).

• Твин-20 Sigma-Aldrich (США).

• Трансфекционный реагент HiPerfect Qiagen (США).

• Тритон Х-100 Sigma-Aldrich (США).

• Холестерол Sigma-Aldrich (США).

• ЭФР Sigma-Aldrich (США).

• ЭФР, меченный зеленым красителем Invitrogen (США) AlexaFlour488.

Santa Cruz Biotechnology.

• Эрлотиниб.

США).

Fox Chase Cancer Center.

• Цетуксимаб.

Pharmacy (США).

Оборудование.

• Камера Горяева для подсчёта клеток Fisher (США).

• Пробирки 1,5 мл Fisher (США).

• Пробирки 15 мл и 50 мл Fisher (США).

• Автоматические пипетки Gilson (Франция).

Fisher (США).

• рН-метр AB 15 Fisher (США).

Вортекс Genie-2.

Весы аналитические PL601-S.

Центрифуга 5804.

Центрифуга Sorval Legend Micro 21 Микроцентрифуга 110 VAC С02-инкубатор Forma Scientific Ламинарный шкаф SteriGuard Hood Установка для содержания лабораторных животных Cage Mouse Vent Rack Спетрофотометр NanoDrop 2000 Планшетный спектрофотометр Envision Оптический микроскоп Флуоресцентный микроскоп Конфокальный микроскоп Nikon С-1 Проточный цитофлуориметр BD FACSCalibur.

Сканер мембран Licor Odyssey Проточный цитометр FACS-VantageSE Термостат.

VWR Scientific (США) Mettler Toledo (США) Eppendorf (Германия) Fisher (США) Fisher (США) Fisher (США) The Baker Company (США) LABEX (США).

Fisher (США) Perkin Elmer (США) Fisher (США) Fisher (США) Nikon (США) BD Biosciences (США).

Licor (США) BD Biosciences (США) VWR Scientific (США).

2.2 Объекты исследования.

2.2.1 Объекты исследования in vitro.

В работе использовались следующие клеточные линии: А431 (эпидермоидная карцинома), SCC61 и SCC25 (сквамозная карцинома), РС9 (немелкоклеточный рак легкого), HeLa (карцинома эндометрия), MCF12 °F (нормальный эпителий молочной железы). Все клеточные линии были получены из American Tissue Culture Collection (АТСС, США). Клеточные линии культивировались в ростовой среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка, Ь-глютамин и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-ного С02 при 37 °C.

Для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизировался 0.25%-ным раствором трипсина с последующей его инактивацией добавлением среды БМЕМ с 10%-ной сывороткой. Далее клетки осаждались центрифугированием при 900 Осадок ресуспендировался в ростовой среде. Оценка жизнеспособности и подсчет плотности клеток производились после окраски клеток 0,4%-ным раствором трипанового синего в камере Горяева под оптическим микроскопом. Расчет количества клеток проводился по формуле:

Са-Ь)Х 100% где, а — общее количество клеток, b — количество синих клеток.

2.2.2 Объекты исследования in vivo.

Опыты in vivo проводились на самцах мышей весом 25 г линии С-B17.SCID (Jackson Laboratory, США). Образование опухолей вызывались однократной подкожной инъекцией 3 млн клеток SCC61 со стабильным нокаутом гена SC4MOL. С момента появления пальпируемых образований (через неделю после инъекции) начинались измерения объёма опухоли и лечение. Экспериментальной группе мышей вводился цетуксимаб, растворённый в 0.9% NaCl, внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг, 2 раза в неделю в течение 3 недель. Контрольным животным вводился 0.9%-ный раствор NaCl. Объём опухоли вычислялся по формуле ab2/2, где, а — длина и bширина опухоли. Измерения проводились 2 раза в неделю в течение четырёх недель.

2.3 Траисфекция клеток с помощью малой интерферирующей РНК.

Для проведения трансфекции использовались клетки в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6луночного планшета в среде DMEM, содержащей 1% сыворотки теленка и L-глютамин. Для одной лунки 6-луночного планшета 1,8 мкл малй интерферирующей РНК (миРНК) (20 мкМ) смешивались с 6 мкл трансфекционного реагента HiPerfect в 96 мкл безсывороточной среды DMEM. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре раствор с образовавшимися комплексами MHPHK-HiPerfect добавлялся в 1 мл 1%-ной среды DMEM с клетками до конечной концентрации миРНК 10 нМ. Через 72 часа после трансфекции происходил полный нокдаун гена и клетки были готовы для проведения экспериментов. В экспериментах с использованием блокаторов через 48 часов начала после трансфекции к клеткам добавлялись лекарственные вещества. Также через двое суток среда клеток сменялась на бессывороточную DMEM для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток.

2.4 Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга.

В случае экспериментов с трансфекцией клетки сажались описанным выше способом. В случае экспериментов без трансфекции клетки сажались в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6-луночного планшета в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка и L-глютамин. Через 24 часа инкубации клеток без трансфекции или через 72 часа после трансфекции клетки стимулировались 100 нг/мл ЭФР в бессывороточной среде. По окончании стимуляции клетки помещались на лед для остановки всех внутриклеточных процессов, отмывались два раза в натрий-фосфатном буфере и лизировались в 50 мкл буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз на лунку 6-луночного планшета. Клетки соскабливались клеточным скребком и полученные лизаты помещались в пробирки. Далее лизаты центрифугировались на скорости 13,000 g в течение 30 минут для осаждения нерастворенных частиц. В полученных супернатантах измерялся уровень белка по методу Лоури, после чего концентрации белка уравнивались путем добавления лизирующего буфера в более концентрированные образцы до концентрации наиболее разбавленного. После этого лизаты кипятились в растворе 2%-ного додецилсульфата натрия в течение пяти минут для полной денатурации белков. Полученные образцы разгонялись методом электрофореза при 120 В на градиентном (4−12%) полиакриламидном геле. Белки с геля переносились на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану с помощью электроблоттинга при напряжении 30 В в течение 4−10 часов. Мембрана блокировалась в течение часа в блокирующем буфере Odyssey, после чего инкубировалась с первичными антителами в конечной концентрации 100 нг/мл в течение 12−24 часов при +4°С. Затем мембрана отмывалась три раза по пять минут в трис-боратном буфере, содержащим 0.05% Твин-20, и в течение часа при комнатной температуре инкубировалась с вторичными антителами, меченными флуоресцентной меткой, в конечной концентрации 1 мкг/мл. После трех отмывок мембрана сканировалась на сканнере Licor Odyssey Scanner.

2.5 Анализ выживаемости клеток.

Для анализа выживаемости клетки сажались в 96-луночные планшеты в концентрации 3 тысячи клеток на лунку (80 мкл в концентрации 37.5 тысяч клеток в 1 мл). миРНК трансфекция проводилась описанным выше способом. Через 24 часа после трансфекции к клеткам добавлялось 10 мкл среды, содержащей 10-кратное количество лекарственных веществ. После этого клетки инкубировались в течение трех дней. Через 96 часов после трансфекции к клеткам добавлось 10 мкл на лунку реагента CellTiter Blue. Живые клетки метаболизируют входящий в состав реагента ресазурин, восстанавливая его до флуоресцентного ресоруфина. Через два часа после добавления реагента флуоресценция клеток считывалась при помощи спектрофотометра на длине волны 573 нм. Интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в лунке.

2.6 Анализ апоптоза.

Анализ клеточной гибели проводился по методу мечения апоптотических клеток красителем аннексином V. При апоптозе или гибели клеток нарушается ассиметричность распределения фосфолипидов в клеточной мембране. В результате фосфатидилсерин, который в живых клетках присутствует только на внутреннем слое мембраны, частично переходит на внешний слой. Краситель аннексии V, обладающий сродством к фосфатидилсерину, присоединяется к апоптотическим и мертвым клеткам. Для отделения мертвых клеток апоптотических клеток используется маркер мертвых клеток 7-амино-актимомицин. Таким образом апоптотические клетки оказываются положительными по окраске аннексином V и отрицательными по окраске 7-амино-актиномицином.

Через 48 часов после трансфекции описанным выше способом к клеткам SCC61 в 6-луночном планшете добавлялся эрлотиниб в рабочей концентрации. Через 72 часа клетки трипсинизировались, ресуспендировались и окрашивались аннексином V, меченным зеленой меткой, и 7-амино-актиномицмном, меченным красной меткой. Результаты считывались при помощи проточного цитометра.

2.7 Иммунопреципитация и анализ убиквитинилирования рецептора.

ЭФР.

Через 72 часа после трансфекции клетки лизировались в буфере RIPA описанным выше способом. Очищенные центрифугированием и нормализованные на уровень белка лизаты растворялись в 0.5 мл натрий-фосфатного буфера и инкубировались с 10 мкл антител к рецептору ЭФР в течение 12 часов при +4°С при постоянном вращении. Затем к лизатам добавлялось 20 мкл протеин-С-конъюгированных агарозных бус и инкубировалиьс в течение 2 часов при +4°С при постоянном вращении. Бусы осаждались центрифугированием при 3,000 g и отмывались в натрий-фосфатном буфере три раза, после чего кипятились в растворе додецилсульфата натрия в течение пяти минут для отщепления белков от бус и их денатурации. Суспензия бус центрифугировалась при 10,000% и полученный супернатант подвергался анализу иммуноблоттингом по описанному выше протоколу. После переноса белков мембрана окрашивалась антителами к убиквитину и рецептору ЭФР в качестве контроля преципитации.

2.8 Иммунофлуоресценция и анализ колоколизации сигналов.

Клетки выращивались и трансфецировались описанным выше способом в 6-луночных планшетах на стеклянных покровных стеклах. Через 48 часов после трансфекции среда клеток сменялась на бессывороточную для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток. Через 72 часа после трансфекции клетки помещались на лед и инкубировались с меченным зеленой меткой ЕОБ в концентрации 200 нг/мл в течение 10 минут, после чего отмывались от несвязавшегося лиганда в холодном натрий-фосфатном буфере, помещались в полную ростовую среду и инкубировались при +37°С для стимуляции рецептора. По окончании стимуляции клетки немедленно помещались на лед для остановки транспорта рецептора и отмывались холодным натрий-фосфатным буфером. Клетки фиксировались в натрий-фосфатном буфере, содержащим 4% формальдегида, в течение 10 минут при комнатной температуре. Все последующие процедуры выполнялись при комнатной температура. Перфорация клеточных мембран проводилась раствором 0.05%-ного тритона Х-100 в натрий-фосфатном буфере в течение 5 минут, после чего клетки блокировались в растворе 3%-ного бычьего сывороточного альбумина в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут. Затем клетки окрашивались по 1 часу первичными и вторичными антителами с тремя пятиминутными отмывками натрий-фосфатным буфером после каждой инкубации. Концентрация первичных антител составляла 1−2 мг/мл, вторичных антител — 2 мкг/мл. Покровные стекла приклеивались на предметные при помощи глицерола, содержащего краситель ДНК DAPI. Фотографии с полученных слайдов снимались на спектральном конфокальном микроскопе Nikon С-1 объективом с 60-кратным увеличением. Полученные снимки анализировались в программном обеспечении MetaMorph (Universal Imaging/Molecular Devices). Анализ колоколизации красного и зеленого сигналов проводился при помощи встроенного в программу приложения.

2.9 Проточная цитометрия.

Клетки трипсинизировались и после подсчета разводились до конечной концентрации 106 клеток/мл в холодном натрий-фосфатным буфере, содержащим 10% сыворотки и 1% азида натрия. Все процедуры проводилиь на льду для замедления внутриклеточного транспорта рецептора ЭФР. В пробирки помещалось по 100 мкл суспензии клеток и добавлялись первичные антитела до конечной концентрации 1 мкл/мл, после чего клетки инкубировались в течение часа. Клетки отмывались от неприсоединенных антител 3 раза в натрий-фосфатным буфере с центрифугированиями со скоростью 900 g для осаждения клеток. Затем клетки инкубировались со вторичными антителами в конечной концентрации 2 мкг/мл в течение часа, после чего отмывались 3 раза в натрий-фосфатным буфере. Готовые образцы хранились при +4°С без доступа света до считывания результатов при помощи проточного цитометра.

2.10 Статистический анализ.

Для статистического анализа полученных данных использовался двустороннийкритерий Стьюдента. Статистически достоверным принималось различие при значении р<0.05. Проверка полученных выборок на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирновакритерием нормальности выборки было значение р>0.10.

Показать весь текст

Список литературы

  1. , Т. Н. Сборка актиновых филаментов в трансформированных клетках при действии мембранных модификаторов, связывающих холестерин / Т. Н. Ефремова, В.И. Чубинский-Надеждин, С. Ю. Хайтлина, Е. А. Морачевская // Цитология 2012. — Т. 54(6) — С. 508 514.
  2. , В. Г. Липидный бислой биологических мембран / В. Г. Ивков, Г. Н. Берестовский М.: Изд-во Наука — 1982. — 224 с.
  3. , Е. Н. Общие представления о таргетной терапии / Е. Н. Имянитов // Практическая онкология 2010. — Т. 11(3). — С. 123−130.
  4. , В. И. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздавсоцразвития России. — 2012. — 260 с.
  5. Чу, Э. Химиотерапия злокачественных новообразований / Э. Чу, В. Де Вита-младший М.: Изд-во Практика — 2006. — 447 с.
  6. Bionda, C. Differential regulation of cell death in head and neck cell carcinoma through alteration of cholesterol levels in lipid rafts microdomains / C. Bionda, A. Athias, D. Poncet, G. Alphonse, A.
  7. Guezguez, P. Gambert, C. Rodriguez-Lafrasse, D. Ardail // Biochemical pharmacology. 2008. — Vol. 75. — P.761−772.
  8. Bogh, I. B. Testicular concentration of meiosis-activating sterol is associated with normal testicular descent / I. B. Bogh, M. Baltsen, A. G. Byskov, T. Greve // Theriogenology. 2001. — Vol. 55. — P. 983−992.
  9. Bose, P. Neratinib: an oral, irreversible dual EGFR/HER2 inhibitor for breast and non-small cell lung cancer / P. Bose, H. Azer // Expert opinion on investigational drugs 2009. — Vol. 18. — P. 1735−1751.
  10. Brough, R. Searching for synthetic lethality in cancer / R. Brough, J. R. Frankum, S. Costa-Cabral, C. J. Lord, A. Ashworth // Current opinion in genetics & development 2011. — Vol. 21. — P. 34−41.
  11. Burke, P. Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking / P. Burke, K. Schooler, H. S. Wiley //Molecular biology of the cell-2001.-Vol. 12.-P. 1897−1910.
  12. Byskov, A. G. Role of meiosis activating sterols, MAS, in induced oocyte maturation / A. G. Byskov, C. Y. Andersen, L. Leonardsen // Molecular and cellular endocrinology 2002. — Vol. 187. — P. 189−196
  13. Byskov, A. G. Chemical structure of sterols that activate oocyte meiosis / A. G. Byskov, C. Y. Andersen, L. Nordholm, H. Thogersen, G. Xia, O. Wassmann, J. V. Andersen, E. Guddal, T. Roed // Nature 1995. — Vol. 374.-P. 559−562.
  14. Byskov, A. G. Cumulus cells of oocyte-cumulus complexes secrete a meiosis-activating substance when stimulated with FSH / G. Byskov, C. Y. Andersen, A. Hossaini, X. Guoliang // Molecular reproduction and development 1997. — Vol. 46. — P. 296−305.
  15. Ceresa, B. P. Regulation of EGFR endocytic trafficking by rab proteins. / B. P. Ceresa // Histology and histopathology 2006. — Vol. 21. — P. 987−993.
  16. Chan, D. A. Harnessing synthetic lethal interactions in anticancer drug discovery / D. A. Chan, A.J. Giaccia // Nature reviews: Drug discovery -2011.-Vol. 10.-P. 351−364.
  17. Chinnaiyan, P. Clinical advancement of EGFR inhibitors in cancer therapy / P. Chinnaiyan, P. M. Harari // Methods in molecular biology 2006. — Vol. 327.-P. 189−202.
  18. Cho, H. S. Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether / H. S. Cho, D. J. Leahy // Science 2002. — Vol. 297. -P. 1330−1333.
  19. Cho, H. S. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab / H. S. Cho, K. Mason, K. X. Ramyar, A. M. Stanley, S. B. Gabelli, D. W. Denney, D. J. Leahy // Nature 2003. -Vol. 421.-P. 756−760.
  20. Costanzo, M. The genetic landscape of a cell / M. Costanzo, A. Baryshnikova. J. Bellay, Y. Kim, E. D. Spear, C. S. Sevier, H. Ding, J. L. Koh, K. Toufighi, S. Mostafavi et al. // Science 2010. — Vol. 327. — P. 425 431.
  21. Coticchio, G. Mouse oocyte meiotic resumption and polar body extrusion in vitro are differentially influenced by FSH, epidermal growth factor and meiosis-activating sterol / G. Coticchio, G. Rossi, A. Borini, C. Grondahl, G.
  22. Macchiarelli, C. Flamigni, S. Fleming, S. Cecconi // Human reproduction -2004. Vol. 19. — P. 2913−2918.
  23. Dean-Colomb, W. Her2-positive breast cancer: herceptin and beyond / W. Dean-Colomb, F. J. Esteva // European journal of cancer 2008. — Vol. 44. -P. 2806−2812.
  24. Dong, Y. Synthetic lethality through combined Notch-epidermal growth factor receptor pathway inhibition in basal-like breast cancer / Y. Dong, A. Li, J. Wang, J. D. Webber, L. S. Mitchel // Cancer Res 2010. — Vol. 70. -P. 5465−5474.
  25. Eden, E. R. The role of EGF receptor ubiquitination in regulating its intracellular traffic / E. R. Eden, F. Huang, A. Sorkin, C. E. Futter // Traffic -2012.-Vol. 13.-P. 329−337.
  26. Elloumi, J. Monoclonal antibodies as cancer therapeutics / J. Elloumi, K. Jellali, I. Jemel, S. Aifa // Recent patents on biotechnology 2012. — Vol. 6. -P. 45.56.
  27. Ferguson, K. M. EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization / K. M. Ferguson, M. B. Berger, J. M. Mendrola, H. S. Cho, D. J. Leahy, M. A. Lemmon // Molecular cell 2003. Vol. 11.-P. 507−517.
  28. Frederick, L. Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human glioblastomas / L. Frederick, X. Y. Wang, G. Eley, C. D. James // Cancer Res 2000. — Vol. 60. — P. 1383−1387.
  29. Gazdar, A. F. Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors / A. F. Gazdar // Oncogene 2009. — Vol. 28(1). — P. 24−31.
  30. Goh, L. K. Multiple mechanisms collectively regulate clathrin-mediated endocytosis of the epidermal growth factor receptor / L. K. Gah, F. Huang,
  31. W. Kim, S. Gygi, A. Sorkin // The Journal of cell biology 2010. — Vol. 189.-P. 871−883.
  32. Gschwind, A. The discovery of receptor tyrosine kinases: targets for cancer therapy / A. Gschwind, O. M. Fischer, A. Ullrich // Nature reviews Cancer -2004.-Vol. 4.-P. 361−370.
  33. Happle, R. The CHILD syndrome. Congenital hemidysplasia with ichthyosiform erythroderma and limb defects / R. Happle, H. Koch, W. Lenz // European journal of pediatrics 1980. — Vol. 134. — P. 27−33.
  34. Harris, R. C. EGF receptor ligands / R. C. Harris, E. Chung, R. J. Coffey // Experimental cell research 2003. — Vol. 284. — P. 2−13.
  35. Hicke, L. A new ticket for entry into budding vesicles-ubiquitin / L. A. Hicke // Cell 2001. — Vol. 106. — P. 527−530.
  36. Hopper-Borge, E. A. Mechanisms of tumor resistance to EGFR-targeted therapies / E. A. Hopper-Borge, R. E. Nasto, V. Ratushny, L. M. Weiner, E. A. Golemis, I. Astsaturov // Expert opinion on therapeutic targets 2009. -Vol. 13.-P. 339−362.
  37. Hortobagyi, G. N. Opportunities and challenges in the development of targeted therapies / G. N. Hortobagyi // Semin Oncol 2004. — Vol. 31 — P. 21−27.
  38. Hummel, M. Left-sided CHILD syndrome caused by a nonsense mutation in the NSDHL gene / M. Hummel, D. Cunningham, C. J. Mullet, P. I. Kelley, G. E. Herman // American journal of medical genetics 2003. — Vol. 122A. -P. 246−251.
  39. Israel, M. The metabolic advantage of tumor cells / M. Israel, L. Schwartz // Mol Cancer 2011. — Vol. 10. — P. 70−79.
  40. Jacobs, R. J. Cholesterol metabolism and colorectal cancers / R. J. Jacobs, P. W. Voorneveld, L. L. Kodach, J. C. Hardwick // Curr Opin Pharmacol -2012-Vol. 12.-P. 690−695.
  41. Janne, P. A. Factors underlying sensitivity of cancers to small-molecule kinase inhibitors. P. A. Janne, N. Gray, J. Settleman // Nature reviews Drug discovery 2009. — Vol. 8. — P. 709−723.
  42. Jiang, X., Grb2 regulates internalization of EGF receptors through clathrin-coated pits / X. Jiang, F. Huang, A. Marusyk, A. Sorkin // Molecular biology of the cell 2003. — Vol. 14. P. 858−870.
  43. Jimeno, A. Blockade of epidermal growth factor receptor (EGFR) activity / A. Jimeno, M. Hidalgo // Critical reviews in oncology/hematology 2005. -Vol. 53. P. 179−192.
  44. Johnston, S. R. Lapatinib: a novel EGFR/HER2 tyrosine kinase inhibitor for cancer / S. R. Johnston, A. Leary // Drugs of today 2006. — Vol. 42. — P. 441−453.
  45. Jones, R. B. A quantitative protein interaction network for the ErbB receptors using protein microarrays / R. B. Jones, A. Gordus, J. A. Krall, G. MacBeath // Nature 2006. — Vol. 439. — P. 168−174.
  46. Kaelin, W. G., Jr. Synthetic lethality: a framework for the development of wiser cancer therapeutics / W. G. Kaelin Jr. // Genome medicine 2009. -Vol. l.-P. 99−104.
  47. Karamouzis, M. V. Therapies directed against epidermal growth factor receptor in aerodigestive carcinomas / M. V. Karamouzis, J. R. Grandis, A. Argiris // JAMA: the journal of the American Medical Association 2007. -Vol. 298.-P. 70−82.
  48. Kato-Stankiewicz, J. Inhibitors of Ras/Raf-1 interaction identified by two-hybrid screening revert Ras-dependent transformation phenotypes in human cancer cells / J. Kato-Stankiewicz, I. Hakimi, G. Zhi, J. Zhang, I.
  49. Serebriiskii, L. Guo, H. Edamatsu, H. Koide, S. Menon, R. Eckl, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002. — Vol. 99. — P. 14 398−14 403.
  50. Konishi, J. Notch3 cooperates with the EGFR pathway to modulate apoptosis through the induction of bim / J. Konishi, F. Yi, X. Chen, H. Vo, D. P. Carbone, T. P. Dang // Oncogene 1992. — Vol. 29. — P. 589−596.
  51. Kritchevsky, S. B. Serum cholesterol and cancer risk: an epidemiologic perspective / S. B. Kritchevsky, D. Kritchevsky // Annual review of nutrition 1992. — Vol. 12. — P. 391−416.
  52. Laskin, J. J. Epidermal growth factor receptor: a promising target in solid tumours / J. J. Laskin, A. B. Sandler // Cancer treatment reviews 2004. -Vol. 30-P. 1−17.
  53. Lees, N. D. Biochemistry and molecular biology of sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae / N. D. Lees, M. Bard, D. R. Kirsch // Critical reviews in biochemistry and molecular biology 1999. — Vol. 34. — P. 3347.
  54. Lengauer, C. Genetic instabilities in human cancers / C. Lengauer, K. W. Kinzler, B. Vogelstein // Nature 1988. — Vol. 396. — P. 643−649.
  55. Lingwood, D. Lipid rafts as a membrane-organizing principle / D. Lingwood, K. Simons // Science 2010. — Vol. 327. — P. 46−50.
  56. Martin, S. A. Genomic instability and the selection of treatments for cancer / S. A. Martin, M. Hewish, C. J. Lord, A. Ashworth // The Journal of pathology 2010. — Vol. 220. — P. 281−289.
  57. Meriggi, F. Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: how to choose the right patient / F Meriggi, B. Di Biasi, A. Zaniboni // Current drug targets 2009. -Vol. 10.-P. 1033−1040.
  58. Miettinen, P. J. Epithelial immaturity and multiorgan failure in mice lacking epidermal growth factor receptor / P. J. Miettinen, J. E. Berger, J. Meneses, Y. Phung, R. A. Pedersen, Z. Werb, R. Derynck // Nature 1995. — Vol. 376.-P. 337−341.
  59. Milanezi, F. EGFR/HER2 in breast cancer: a biological approach for molecular diagnosis and therapy / F. Milanezi, S. Carvalho, F. C. Schmitt // Expert review of molecular diagnostics 2008. — Vol. 8. — P. 417−434.
  60. Nedergaard, M. K. Targeting the epidermal growth factor receptor in solid tumor malignancies / M. K. Nedergaard, C. J. Hedegaard, H. S. Poulsen // BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy 2012. — Vol. 26. — P. 83−99.
  61. Nijman, S. M. Synthetic lethality: general principles, utility and detection using genetic screens in human cells / S. M. Nijman 2011. — Vol. 585. — P. 1−6.
  62. Olayioye, M. A. ErbB receptor-induced activation of stat transcription factors is mediated by Src tyrosine kinases / M. A. Olayioye, I. Beuvink. K. Horsch, J. M. Daly, N. E. Hynes // The Journal of biological chemistry -1999.-Vol. 274.-P. 17 209−17 218.
  63. Olayioye, M. A. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer / M. A. Olayioye, R. M. Neve, H. A. Lane, N. E. Hynes // The EMBO journal 2000. — Vol. 19. — P. 3159−3167.
  64. Pao, W. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from «never smokers» and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib / W. Pao, V. Miller, M. Zakowski, J. Doherty, K. Politi, I.
  65. Sarkaria, B. Singh, R. Heelan, V. Rusch, L. Fulton, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004. -Vol. 101.-P. 13 306−13 311.
  66. Prigent, S. A. Identification of c-erbB-3 binding sites for phosphatidylinositol 3'-kinase and SHC using an EGF receptor/c-erbB-3 chimera / S. A. Prigent, W. J. Gullick // The EMBO journal 1994. — Vol. 13.-P. 2831−2841.
  67. Purow, B. W. Notch inhibition as a promising new approach to cancer therapy / B. W. Purrow // Advances in experimental medicine and biology -2012. Vol. 727. — P. 305−319.
  68. Quesnelle, K. M. STAT-mediated EGFR signaling in cancer / K. M. Quesnelle, A. L. Boehm, J. R. Grandis // Journal of cellular biochemistry -2007.-Vol. 102.-P. 311−319.
  69. Raiborg, C. Hrs and endocytic sorting of ubiquitinated membrane proteins / C. Raiborg, H. Stenmark // Cell structure and function 2002. — Vol. 27. -P. 403−408.
  70. Rozman, D. Perspectives of the non-statin hypolipidemic agents / D. Rozman, K. Monostory // Pharmacol Ther 2010. — Vol. 127. — P. 19−40.
  71. Salomon, D. S. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies / D. S. Salomon, R. Brandt, F. Ciardiello, N. Normanno // Critical reviews in oncology/hematology 1995. — Vol. 19. -P. 183−232.
  72. Sato, J. D. Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors / J. D. Sato, T. Kawamoto, A. D. Le, J. Mendelsohn, J. Polikoff, G. H. Sato // Molecular biology & medicine -1983.-Vol. 1.-P. 511−529.
  73. Schneider, M. R. Beyond wavy hairs: the epidermal growth factor receptor and its ligands in skin biology and pathology / M. R. Schneider, S. Werner, R. Paus, E. Wolf// The American journal of pathology 2008. — Vol. 173. -P. 14−24.
  74. Scita, G. The endocytic matrix / G. Scita, P. P. Di Fiore // Nature 2010. -Vol. 463.-P. 464−473.
  75. Sibilia, M. Strain-dependent epithelial defects in mice lacking the EGF receptor / M. Sibilia, E. F. Wagner // Science 1995. — Vol. 269. — P. 234 238.
  76. Sigismund, S. Clathrin-mediated internalization is essential for sustained EGFR signaling but dispensable for degradation / S. Sigismund, E. Argenzio, D. Tosoni, E. Cavallaro, S. Polo, P. P. Di Fiore // Developmental cell 2008. — Vol. 15.-P. 209−219.
  77. Smyth, E. C. Targeted therapy for gastric cancer / E. C. Smyth, D. Cunningham // Current treatment options in oncology 2012. — Vol. 13. — P. 377−389.
  78. Spicer, J. F. EGFR inhibitors in non-small cell lung cancer (NSCLC): the emerging role of the dual irreversible EGFR/HER2 inhibitor BIBW 2992 / J.
  79. F. Spicer, S. M. Rudman // Targeted oncology 2010. — Vol. 5. — P. 245 255.
  80. Sporn, M. B. Autocrine growth factors and cancer / M. B. Sporn, A. B. Roberts // Nature 1985. — Vol. 313. — P. 745−747.
  81. Stark, C. BioGRID: a general repository for interaction datasets / C. Stark, B. J. Breitkreutz, T. Reguly, L. Boucher, A. Breitkreutz, M. Tyers // Nucleic acids research 2006. — Vol. 34D. — P. 535−539.
  82. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling / M. V. Sundaram // WormBook: the online review of С elegans biology 2006. — P. 1−19.
  83. Trapani, L. Potential role of nonstatin cholesterol lowering agents / L. Trapani, M. Segatto, P. Ascenzi, V. Pallottini // IUBMB life 2011. — Vol. 63.-P. 964−971.
  84. Wang, Q. Identification of EGF receptor C-terminal sequences 1005−1017 and di-leucine motif 1010LL1011 as essential in EGF receptor endocytosis / Q. Wang, F. Zhu, Z. Wang // Experimental cell research 2007. — Vol. 313. -P. 3349−3363.
  85. Wei, X. Mechanism of EGER-related cancer drug resistance / X. Wei // Anti-cancer drugs 2011. Vol. 22. — P. 963−970.
  86. Weinstein, I. B. Oncogene addiction / I. B. Weinstein, A. Joe // Cancer Res 2008. — Vol. 68. — P. 3077−3080
  87. Willett, C. G. Targeted therapy in rectal cancer / C. G. Willet, D. G. Duda, B. G. Czito, J. C. Bendell, J. W. Clark, R. K. Jain // Oncology 2007. — Vol. 21.-P. 1055−1065.
  88. Xu, F. Dual roles for cholesterol in mammalian cells / F. Xu, S. D. Rychnovsky, J. D. Belani, H. H. Hobbs, J. C. Cohen, R. B. Rawson // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-2005.-Vol. 102.-P. 14 551−14 556.
  89. Yaffe, M. B. Phosphotyrosine-bincung domains in signal transduction / M. B. Yaffe // Nature reviews Molecular cell biology 2002. — Vol. 3. — P. 177
  90. Yarden, Y. The EGFR family and its ligands in human cancer, signalling mechanisms and therapeutic opportunities / Y. Yarden // European journal of cancer 2001. — Vol. 37(4). — P. 3−8.
  91. Yarden, Y. Untangling the ErbB signalling network / Y. Yarden, M. X. Sliwkowski // Nature reviews Molecular cell biology 2001. — Vol. 2. — P.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!