Тонкослойная хроматография диацилглицеринов и ее применение для анализа видового состава их смеси

Полярные глицеролипиды* нормально функционирующей биологической мембраны, как правило, включают в качестве их главных структурных элементов несколько классов диацильных фосфои гликолипидов, несущих различные полярные головные группы. В свою очередь, любой из этих классов обычно представляет собой совокупность нескольких видов липидов, содержащих одну и ту же гидрофильную головную группу, но имеющих различные диацилглицериновые (5"-1,2-ДАТ) радикалы. Каждый вид липидов, относящийся к тому или иному классу, характеризуется общим числом атомов углерода (тт. + тзп.?) и двойных связей (е5П"1 + е^) в остатках жирных кислот этих радикалов. Физико-химические и биологические свойства таких липидов во многом определяются видовым составом (тонкой структурой) их ДАГ-остатков, т. е. качественным составом и количественным содержанием индивидуальных видов данных липидов в мол.% [5].

НгС-ОСОЯ1 тт. ь етЛ тзп-2, е*п-2 Я2ОСО-СН н2с-он.

В настоящее время липиды биологических объектов чаще всего изучаются с точки зрения содержания их отдельных классов и жирнокислотного состававидовой состав их ДАГ-остатков исследуется значительно реже, поскольку методы анализа тонкой структуры ДАТ развиты еще недостаточно [94]. Между тем, будучи важнейшим элементом структуры липидов, ДАТ принимают участие во всех процессах их биосинтеза и метаболизма, а, следовательно, — и в функционировании клеточных мембран. Кроме того, благодаря особенностям своей структуры — наличию полярной гидроксильной группы и гидрофобных.

Ниже, до конца главы I, полярные глицеролипиды обозначаются термином «липиды». 8 алифатических цепей, свободные ДАТ способны стабилизировать водомасляные эмульсии [154]. Поэтому ДАТ используют в качестве главных компонентов биологически совместимых эмульгаторов в производстве пищевых и косметических продуктов. Эти эмульгаторы обычно получают в промышленном масштабе путем переработки и модификации жиров различных типов, и их технологические свойства зависят не только от жирнокислотного, но и от видового состава ДАТ [154]. При технологическом контроле производства эмульгаторов необходимо располагать данными анализа тонкой структуры ДАТ, проведение которого требует разработки надежных методов определения видового состава ДАТ [154]. Поэтому исследование этого состава в настоящее время весьма актуально.

Таким образом, исследование тонкой структуры липидов является важной задачей современной мембранологии и химической технологии. Основным методом такого исследования обычно служит хроматография. Однако, вследствие сложности видового состава природных липидов, каждая из получаемых хроматографических фракций, как правило, представляет собой смесь отдельных видов липидов. Поэтому в настоящее время для аналитического или препаративного разделения того или иного класса липидов на индивидуальные виды необходимо использовать последовательно несколько хроматографических методов. К их числу принадлежат жидкостная (ЖХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ).

До сих пор главным методом определения видового состава таких липидов обычно служила ГЖХ. Однако для её осуществления необходимо сначала получить летучие липофильные О-производные ДАТ, что значительно затрудняет последующую регенерацию исходных ДАТ. Кроме того, получение таких производных, особенно ненасыщенных, нередко связано с большим или меньшим нарушением нативности проб исходных ДАТобычно он сопровождается изменением состава таких проб, что вызывается их частичной потерей и разрушением в ходе синтеза. Наконец, само ГЖХ-фракционирование О-производных ДАТ приводит к абсорбции части липидов в колонке [47]. 9.

Для ГЖХ этих производных в большинстве случаев пригодны только неполярные стационарные фазы, обеспечивающие фракционирование лишь по числу атомов углерода т. Хотя в последние годы ГЖХ производных ДАТ проводили и на полиэфирных стационарных фазах [94], ГЖХ-разделение данных производных по числу олефиновых связей е ещё не получило широкого распространения, что ограничивает применимость ГЖХ для анализа преобладающих в природных липидах ненасыщенных ДАТ. Кроме того, выполнение их ГЖХ-фракционирования часто затруднено вследствие термолабильности полярной стационарной фазы. Все эти факторы сильно снижают количество информации о видовом составе ДАТ, получаемой при ГЖХ-анализе, даже в сочетании с масс-спектрометриейв данной работе ГЖХ использовали лишь для определения жирнокислотного состава ацилглицеринов.

Мы приходим к выводу, что для исследования состава смесей насыщенных и ненасыщенных видов ДАТ целесообразно применять другую разновидность хроматографии — ЖХ. Таким образом, задача настоящей диссертационной работы состояла в определении видового состава сложной смеси ДАТ методами их ЖХ-разделения, и эта задача является актуальной.

выводы.

1. Разработан метод составления из природных масел препаратов триацилглицеринов с любым заданным жирнокислотным составом. Из продуктов глицеролиза одного из таких препаратов получена с высоким (47 мол. %) выходом модельная смесь свободных диацилглицеринов (ДАТ) с эквимолярным (20 ± 3 мол. %) содержанием остатков стеариновой ©, пальмитиновой (П), олеиновой (О), линолевой (Л) и линоленовой (Ле) кислот.

2. При сопоставлении ДАТ этой смеси со стандартными видами ДАТ известного жирнокислотного состава по их подвижности в условиях обращенно-фазовой ТСХ (ОФ ТСХ) диметилборатных эфиров ДАТ, адсорбционной ТСХ л-комплексов ДАТ с ионами А§-+ (Ag+TCX) и ОФ ТСХ диметилборатных эфиров таких комплексов (А§+ОФ ТСХ) в смеси были однозначно идентифицированы 3, 8 и 11 индивидуальных видов ДАТ, соответственно, при последовательном применении всех трёх ТСХ-методов -13 видов ДАТ, а при сочетании Ag+TCX и Ag+OФ ТСХ в виде двухмерной хроматографии — ещё два вида.

3. Судя по этим данным, модельная смесь ДАТ (п.1), состоит из следующих 15 видов: СС, СП, СО, ПП, ПО, 00, СЛ, ПЛ, ОЛ, ЛЛ, СЛе, ПЛе, ОЛе, ЛЛе и ЛеЛе, т. е. из тех и только тех видов, которые могут образоваться при статистическом распределении ацильных остатков между отдельными оксигруппами молекулы глицерина.

4. По полноте разделения ДАТ двумерная ТСХ (п.2) не уступает методам ОФ высокоэффективной и газо-жидкостной хроматографии.

5. При ОФ ТСХ минимальное различие по величине липофильности между видами ДАТ, необходимое для их отделения друг от друга, равно двум, а зависимость подвижности диметилборатных эфиров ДАТ от их липофильности является обратно пропорциональной и носит линейный характер.

6. С ростом ненасыщенности ДАТ подвижность всех этих ДАТ при Ag+TCX экспоненциально убывает, а при А§+ОФ ТСХ — линейно увеличивается.

7. Любой полиненасыщенный индивидуальный вид ДАГ модельной смеси с остатками жирных кислот резко отличной друг от друга конформации алифатической цепи по сравнению с иным видом ДАТ той же ненасыщенности, отдельные ацильные остатки которого по своей конформации в целом сходны между собой, характеризуется большей полярностью его А§±комплекса и потому — меньшей подвижностью при Ag+TCX и большей подвижностью при А?+ОФ ТСХ.

8. Эти методы обнаруживают сходство друг с другом по свойствам возникающих координационных А^-комплексов ненасыщенных ДАГ, но различаются между собой по механизму фракционирования этих комплексов.

1.5.

Заключение

.

Данные литературного обзора показывают, что за последние годы в ЖХ свободных ДАТ и их липофильных производных были достигнуты.

30 определенные успехи. В целом ряде случаях, когда содержание основного компонента во фракциях превышало 96%, отклонение вычисленных параметров эквивалентной липофильности или ненасыщенности получаемых фракций от номинальных было невелико (¿-х < 1%, < 3%), а степень разделения была высокой (Я > 1,5, см. разделы 1.2−1.4). В то же время во многих опытах этого не наблюдалось вследствие недостаточной эффективности фракционирования ДАТ. Для отдельных фракций даже липофильных производных ДАТ абсолютные величины ¿-х и&tradeчасто превышали соответствующие параметры исходных ДАТ, а рост гидрофобности тех или иных производных ДАТ не приводил к снижению этих величин. Главные недостатки работ по установлению видового состава ДАТ заключались в том, что анализируемые производные характеризовались низкой стабильностью в подвижной фазе, выход фракций был невелик и данные их жирнокислотного состава отсутствовали, что не позволяло достоверно идентифицировать последние, а сами опыты отличались недостаточной воспроизводимостью. Таким образом, для совершенствования методов ЖХ-определения видового состава ДАТ необходимы дальнейшие исследования.

При решении данной проблемы необходимо исходить из того, что разделение фракций ДАТ, характеризующихся различными е или Ь, должно быть, прежде всего, полным (см. выше). Таким образом, следовало обеспечить максимально достижимую степень фракционирования ДАТ, а затем оценить с этой точки зрения пригодность данного метода ЖХ для надёжного определения видового состава ДАТ.

Как видно из обзора, в настоящее время для разделения ДАТ или их липофильных производных часто используют метод ОФ ВЭЖХ, а Ь-фракционирование последних на ВЭЖХ-колонке с микрочастицами силикагеля, содержащими привитые углеводородные цепи, сейчас практически полностью вытеснило другие способы их ¿—разделения. Тем не менее, соотношение величин к' фракций липидов с Ат = 2 не превышало 1,15 [131,148]. Метод А§+ВЭЖХ на колонке ещё не получил широкого распространения для е-разделения ДАТ, поскольку при этом следует.

31 поддерживать исходную концентрацию ионов серебра в стационарной фазе. Это сильно удорожает анализ, поскольку для каждого, в особенности — препаративного фракционирования требуется значительный объём такой фазы. Учитывая эти недостатки, а также высокую стоимость и аппаратурную сложность ВЭЖХ, мы решили не использовать данный метод в нашей работе.

ОФ ТСХ на гидрофобном носителе, покрытом слоем парафиновых углеводородов,. превосходит ОФ ВЭЖХ по степени ¿—разделения липидов [126]. Однако стабильность этого слоя невеликакроме того, ОФ ТСХ трудно автоматизировать. До начала нашей работы этот метод не считался перспективным для определения видового состава свободных ДАТ: ОФ-разделение ДАТ упоминалось лишь в единственном сообщении, носившем предварительный характер [139]. Тем не менее, по нашему мнению, потенциал данного метода еще далеко не исчерпан, и потому мы решили усовершенствовать ОФ ТСХ и применить её для определения видового состава ДАТ.

При оценке других ТСХ-методов по их пригодности для проведения такого определения принимали во внимание, что в случае А§+ТСХ удовлетворительная степень разделения липидов достигалась, когда концентрация в адсорбенте не превышала 2% [108]. Метод Ая+ТСХ часто давал удовлетворительные результаты при е-фракционировании сложных смесей липидов, и потому мы сочли целесообразным оценить в настоящей работе его возможности для установления видового состава ДАТ.

Наконец, имеется еще один метод фракционирования олефиновых нейтральных липидов — ОФ ТСХ их л-комплексов с ионами серебра (А§+ОФ ТСХ). Этот метод применяется уже в течение длительного времени, поскольку он отличается мягкими условиями фракционирования, высокой эффективностью разделения и не требует превращения природных липидов в те или иные производные [98]. По полноте их фракционирования он превышает как ОФ ТСХ, так и А^ТСХ [4], однако ранее [126] для определения видового состава ДАТ этот метод не использовали, и потому он не рассматривался в литературном обзоре. Поэтому представляло.

32 несомненный интерес оценить его применимость для фракционирования ДАТ.

Таким образом, для нашей работы по ЖХ-разделению ДАТ были выбраны методы ОФ ТСХ, А§+ТСХ и Ag" ," OФ ТСХ. Ограниченные рамки данного исследования не позволили включить в него определение количественного состава ДАТ, которое сейчас является отдельной темой лаборатории, и потому цель диссертационной работы состояла в установлении только качественного видового состава сложной смеси ДАТ методами ТСХ.

Во многих случаях для ТСХ-идентификации отдельных видов нейтральных липидов их ТСХ-зоны предварительно элюировали с пластинки, а затем жирнокислотный состав элюата определяли методом ГЖХ [136]. Однако в настоящей работе был использован иной подход к установлению видового состава ДАТ, а именно — применение в процессе ТСХ стандартов ДАТ известного состава. Преимущества такого подхода заключаются в том, что он обеспечивает быстрое проведение массовых анализов качественного состава ДАТ в условиях любой химической (заводской) лаборатории, не требуя при этом сложных и дорогостоящих приборов для ГЖХ и ВЭЖХ, дефицитных и токсичных реактивов и повседневного выполнения трудоёмкого синтеза метиловых эфиров жирных кислот. В данном случае для установления состава ДАТ необходимы лишь набор их стандартов и простое оборудование для ТСХ.

Цель настоящей работы состояла в создании методов ТСХ свободных ДАТ и определении качественного видового состава модельной смеси ДАТ, полученной глицеролизом смеси растительных масел, а также в установлении функциональной зависимости ТСХ-подвижности ДАТ от их состава и свойств.

Задачи настоящего исследования включали:

— составление смеси ТАГ растительных масел с заданным составом, включавшей остатки П, С, О, Л и Ле кислот в эквимолярных концентрациях;

— получение из неё модельной смеси ДАТ с аналогичным.

33 жирнокислотным составом;

— синтез стандартов ДАТ простого видового состава;

— ТСХ-разделение и ЖХ-идентификацию всех индивидуальных видов ДАТ в их модельной смеси с использованием стандартов ДАТ;

— определение (на основе данных идентификации) видового состава ДАТ и закономерностей распределения ацильных остатков в ДАТ этой смеси;

— сопоставление ТСХ с ГЖХ и ВЭЖХ по полноте фракционирования.

ДАГ;

— установление функциональной зависимости подвижности индивидуальных видов ДАТ в различных ТСХ-системах от жирнокислотного состава и конформации видов ДАТ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработанный подход для создания композиций ТАГ любого общего жирнокислотного состава и получения из них модельных смесей ДАГ.

2. Возможность установления видового состава ДАТ без проведения ГЖХ-анализа общего жирнокислотного состава отдельных зон комбинацией Аз+ТСХ и Ag+OФ ТСХ, по полноте фракционирования 15 видов модельной смеси превосходящей ОФ ВЭЖХ и не уступающей ГЖХ.

3. Соответствие видового состава переэтерифицированной модельной смеси ДАТ статистическому распределению ацильных остатков между ее отдельными молекулами.

4. Существование обратной экспоненциальной зависимости между подвижностью и ненасыщенностью ДАТ при Ag+TCX и линейной — при А?+ОФ ТСХ, а также наличие связи полярности и характера подвижности ненасыщенных видов ДАТ с конформацией их молекул.

Экспериментальные исследования, положенные в основу диссертационной работы, выполнены в Лаборатории липидного обмена Института физиологии растений имени К. А. Тимирязева Российской Академии наук.

Автор выражает свою глубокую благодарность заместителю директора Института физиологии растений имени К. А. Тимирязева Российской Академии наук кандидату биологических наук В. Д. Цыдендамбаеву за помощь при выполнении данной работы.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. 1. Синтез метиловых эфиров жирных кислот.

Ацилсодержащие липиды подвергали омылению в 4%-ном этанольном растворе этилата натрия с обратным холодильником в течение 1 ч при т.кип. После омыления этанол отгоняли и замещали водой. Неомыляемые вещества трижды экстрагировали гексаном. К водно-щелочному раствору добавляли 20%-ную серную кислоту (до рН 2−3) и образовавшиеся свободные жирные кислоты также экстрагировали гексаном. Растворитель отгонялисухой остаток растворяли в абсолютном метаноле, смешивали с ацетилхлоридом (9:1, об/об) и выдерживали в течение 1 ч при температуре кипения смеси. Летучие растворители отгоняли, к остатку добавляли воду и метиловые эфиры высших жирных кислот экстрагировали гексаном. Жирнокислотный состав этих эфиров определяли методом ГЖХ [174].

II.2. Получение триметилбората.

Смесь 475 г (600 мл, 14,8 М) абсолютного метанола и 111 г (1,8 М) борной кислоты (х.ч.) нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем смесь охлаждали и выдерживали с избытком безводного сульфата натрия в течение 45 ч для удаления воды, образовавшейся при этерификации. Надосадочную жидкость декантировали и перегоняли с ёлочным дефлегматором, собирая азеотропную смесь метанола и триметилбората с температурой кипения от 54,6 до 55,0°С и «о20 1,3478 [7].

И.З. Приготовление препаратов диацилглицеринов.

И.3.1. Получение смеси триапилглиперинов и ее глиперолиз.

Препараты ТАГ из масла бобов какао (сорт Accra), предварительно подвергнутых двукратной кристаллизации из 10%-ного (в/об) раствора в гексане, и из масел семян мака и льна [3, 4] очищали на колонке с окисью алюминия [80]. Судя по данным ТСХ (см. раздел II.3.2), выделенные из колонки ТАГ не содержали посторонних компонентов. Препараты трипальмигоил- (ППП) и тристеароил- (ССС) глицеринов (С grade, California Foundation for Biochemical Research, США) использовали без дополнительной обработкисодержание основного компонента в этих однокислотных ТАГ принималось равным 100%.

Препарат ТАГ из масла какао (2,63 г) смешивали с ТАГ из масел льна (3,73 г) и мака (2,17 г), прибавляли ССС (0,84 г) и ППП (0,63 г) и определяли жирнокислотный состав полученной смеси (см. стол.1 на рис. 2.1). К 10,00 г (11,5 мМ) этой смеси добавляли 1,30 г (14,1 мМ) безводного глицерина и 11 мг (0,3 мМ) гидроксида натрия в качестве катализатора глицеролиза [141, 158], выдерживали при непрерывном пропускании аргона в слабом вакууме (~1 кПа) при 200 °C в течение 4 ч, растворяли в 100 мл эфира, промывали 20%-ным водным раствором хлорида натрия до нейтральной реакции и высушивали безводным сульфатом натрия. После упаривания в вакууме получали 10,78 г смеси ацилглицеринов (выход 95,4%) и определяли её жирнокислотный состав.

Для установления качественного состава ацилглицеринов в полученной смеси в стартовые точки пластинки «Силуфол» (Kavalier, Чехия) наносили по 100 мкг этой смеси, а также стандартной смеси нейтральных липидов [167]. После ТСХ-разделения в течение 15 мин в системе гексан-эфир-уксусная кислота (50:50:1, об/об/об) липиды окрашивали путем обработки пластинки 5%-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты (ФМК) в смеси пропан-2-ола и воды (1:1, об/об) и нагревания пластинки в течение 10 мин при 120 °C [167].

II.3.2. Получение смеси гас- 1.2-и гас- 1.3-диашшглицеринов (модельной смеси 1) из продуктов глицеролиза.

Выделение препарата ДАТ проводили по видоизмененному методу Квинлина и Вэйзера [137]. В колонку 42×2 см, содержавшую 60 г силикате ля для адсорбционной хроматографии (М. Voelm, Германия), вносили 2,74 г смеси ацилглицеринов в бензольном растворе и разделяли её на отдельные классы, используя последовательно бензол (растворитель 1), смесь бенола и эфира (9:1, растворитель 2) и эфир (растворитель 3). Для сбора элюата использовали автоматический коллектор фракций (Руе ишсаш, Англия). С помощью растворителей 1, 2 и 3 получали фракции ТАГ, ДАТ (модельной смеси 1, см. стол.2 на рис. 2.1) и МАГ, масса которых составила 1,14 г, 1,11 г и 0,33 г, соответственно (выход 94,1%), и устанавливали их жирнокислотный состав [14].

Для оценки степени чистоты полученных фракций выполняли ТСХ-разделение 100-мкг аликвот каждой фракции (см. выше) — в одну из стартовых точек пластинки наносили в качестве стандарта 0,5 мкг ТАГ. Соотношения между величинами интенсивности окраски отдельных зон после ТСХ-разделения (см. раздел П. 3.1) оценивали визуально. Препарат модельной смеси 1 хранили в запаянных ампулах в бензольном растворе на холоду [11].

П. 3.3. Получение смеси гас-.2-изомеров диаиилглицеринов (модельной смеси 2) из модельной смеси 1.

Для получения модельной смеси 2 40 мг модельной смеси 1 (см. раздел П. 3.2) наносили полосой на слой (200×200×0,5 мм), содержавший 9,5 г силикагеля ЛСЛ 5/40 мкм с 13% гипса («Хемапол», Чехия) и 0,5 г борной кислоты, и разделяли в камере для восходящей хроматографии в подвижной фазе хлороформ + ацетон (98:2, об/об, 50 мл) в течение 1,5 ч. После разделения пластинку опрыскивали 0,001%-ным раствором родамина бО и зоны гас-1,2- и гас-1,3-ДАГ (Я/ = 0,3 и 0,5 соответственно) обнаруживали в УФ-свете при 254 нм. Каждый региоизомер ДАТ элюировали с адсорбента в экстракторе [11] смесью хлороформа, метанола и триметилбората (2:1:0,1,.

Рис. 2.1. Схема получения модельных смесей ДАТ 1 и 2, стандартных смесей ДАТ к, м и л и стандартных смесей ДАТ 1−7.

38 об/об/об) в течение 1 ч и растворяли в бензоле. Полученную модельную смесь 2 (15 мг, см. стол. 4 на рис. 2.1) хранили на холоду (см. раздел Н.3.2).

П. 3.4. Получение стандартных смесей гас-1.2- + гас- 1.3-диашшглицеринов и гас- 1.2-диацилглицеринов простого видового состава.

Стандартные смеси гас-1,2- + гас-1,3-ДАТ (к, мил, см. стол.1 на рис. 2.1) для ОФ ТСХ (см. раздел П. 5.1) выделяли как описано выше (см. раздел П. 3.1), но использовали не смесь масел, а отдельные масла какао, мака и льна, соответственно.

С целью создания стандартных смесей гас-1,2-ДАГ (стандартов 1−7, см. стол.4 на рис. 2.1) смеси метиловых эфиров жирных кислот, полученные кислотным метанолизом масел какао, мака и льна (ЯСООМе, см. стол.2 на рис. 2.1 и раздел Ш. З), растворяли в 22%-ном метанольном растворе мочевины и образовавшиеся карбамидные комплексы этих эфиров осаждали фракционной кристаллизацией при различной температуре [11]. Метиллиноленат выделяли из масла льна как описано ранее [2]. Из полученных препаратов составляли семь смесей метиловых эфиров для синтеза ДАТ в стандартах 1−7 (КСООМе, см. стол. З на рис. 2.1), в которых число главных видов жирных кислот п было равно двум или тре м: 1) П + О, 2) С + О, 3) С + П + Л, 4) С + П + Ле, 5) О + Л, 6) О + Л + Ле и 7) Л + Ле.

Для синтеза гас-1,2-ДАГ в стандартах 1−7 (см. стол.4 на рис. 2.1) использовали видоизмененный метод Маркли [105]. К каждой из смесей эфиров 1 — 7 (2 мМ) прибавляли глицерин (1 мМ), п-толуолсульфокислоту (2 мМ) и 10 мл толуола и выдерживали при 118 °C с обратным холодильником в течение 1 ч. Из продуктов этой реакции выделяли сумму гас-1,3- и гас-1,2-региоизомеров ДАГ (см. раздел III.3.2), из которой, в свою очередь, получали гас-1,2-ДАТ, служившие стандартами 1 — 7, а также препарат гас-1,3-ЛЛ (см. раздел И.З.З).

11.4. Изготовление пластинок с постоянным слоем для тонкослойной хроматографии.

Для получения стеклянных пластинок с тонким слоем инертного носителя 20 г кизельгура (Хроматон N, «Хемапол», Чехия, размер частиц 0,100 — 0,125 мм) силанизировали диметилдихлорсиланом [11], смешивали с 60 г 7-мкм порошка стекла [167], полученную смесь суспендировали в 90 мл воды и наносили на пластинки 20×10 см с помощью автоматического аппликатора слоя SSG-1 ('Текнишес Глас", Ильменау, Германия) — величина просвета аппликатора составляла 0,5 мм. После высыхания слоя на воздухе при 20 °C пластинки нагревали при 675 °C в течение 20 мин [167]. Готовые пластинки очищали от органических примесей в смеси серной и азотной кислот (9:1, об/об) при 90 °C в течение 3 ч, а затем через закрепленный слой пропускали метанол. Эти пластинки, которые можно было использовать для разделения неограниченное число раз, в данной работе обозначали термином «пластинки с постоянным слоем носителя» [16].

Стеклянные пластинки с постоянным тонким слоем силикагеля изготовляли по известному методу [167], но для суспендирования смеси порошка стекла и силикагеля применяли не толуол, а воду. Эти пластинки, которые также можно было использовать для разделения неограниченное число раз, в данной работе обозначали термином «пластинки с постоянным слоем адсорбента» [167].

11.5. Тонкослойная хроматография смесей диацилглицеринов II.5.1. Обращённо-фазовая хроматография.

Для нанесения стационарной фазы пластинку с постоянным слоем носителя погружали в 10%-ный (об/об) бензольный раствор тетрадекана и выдерживали на воздухе до полного улетучивания бензола. Стандарты ДАТ к, м и л из масел какао, мака и льна (см. стол. 1 на рис. 2.1), а также модельную смесь 1 наносили на стартовую зону пластинки полосой 65×2 мм с помощью автоматического аппликатора пробы GSG-1 («Текнишес.

Глас"), или в виде отдельных точек.

В качестве подвижной фазы использовали сначала смесь метанола и воды (95:5, об/об), а в дальнейшем для получения такой фазы к 1 объёму азеотропной смеси триметилбората с метанолом (см. раздел II.2) прибавляли 9 объёмов абсолютного метанола и образовавшуюся смесь насыщали к-тетрадеканом.

Препараты ДАТ (200 мкг на стартовой полосе или 20 — 50 мкг в отдельных точках) разделяли в течение 2,5 ч в камере для восходящей ТСХ (тип ОЕ-304, «Лабор», Будапешт, Венгрия) при 23 ± 0,5°С (термостат Bruwa, «Лаборгерэте», Берлин, Германия). Тетрадекан удаляли с пластинок в вакуумном сушильном шкафу LP-402 («Лабор», Эстергом, Венгрия) втечение 45 мин при 140 °C [16]. /;

После обнаружения зон ненасыщенных ДАТ с помощью ФМК (см. раздел II.3.1) хроматограмму фотографировали и получали с негатива позитивное изображение (13×18 см) на рентгеновской пленке РМ-1 («Свема», Шостка, Украина). Снимок сканировали в проходящем свете на универсальном автоматическом денситометре, сконструированном на кафедре автоматизации Московского государственного университета пищевых производств. Площади пиков денситограммы, соответствующих отдельным хроматографическим зонам, определяли гравиметрическим методом. При расчете значения Rf центром каждой такой зоны считали максимум её пика на денситограмме.

II.5.2. Адсорбционная хроматография в присутствии ионов серебра.

Для Ag+TCX пластинку с постоянным слоем адсорбента (10×20 см) пропитывали 1%-ным метанольным раствором нитрата серебра [108]. В стартовые точки этой пластинки наносили по 20−50 мкг модельной смеси 1, модельной смеси 2 и стандартов 1 — 7, а также препаратов гас-1,3-ЛЛ или гас-1,3-ДАГ из модельной смеси 1, и разделяли их в течение 3 ч (при анализе насыщенных, а также moho-, дии триеновых видов ДАТ) или 23 ч (для тетра-, пентаи гексаеновых видов ДАТ), используя в качестве подвижной фазы смесь хлороформа и пропан-2-ола (99:1, об/об),.

1 J насыщенную нитратом серебра [108]. Для разделения использовали непрерывную ТСХ, при которой верхний 1−2-см участок пластинки находился вне хроматографической камеры, и подвижная фаза могла свободно испаряться с этого участка [1]. Ионы серебра удаляли с адсорбента водой и сухую пластинку выдерживали 30 мин в атмосфере паров брома с тем, чтобы при последующем окрашивании ДАТ, как описано в разделе II.3.1, можно было достичь проявления зон не только ненасыщенных, но и насыщенных ДАТ.

II.5.3. Обращённо-Фазовая хроматография в присутствии ионов серебра: двумерная хроматография.

Для одномерного Ag+ОФ ТСХ-фракционирования модельной смеси 2 (раздел И.З.З) всю поверхность пластинки «Силуфол» (15×15 см, Kavalier, Чехия) пропитывали сначала нитратом серебра, а затем w-тетрадеканом (см. разделы II.5.1 — 2). В стартовые точки этой пластинки наносили по 20−50 мкг модельной смеси 2 и стандартов 1−4 (см. стол.4 на рис. 2.1) и разделяли их способом непрерывной ТСХ в течение 3 ч, используя в качестве подвижной фазы 5%-ный метанольный раствор борной кислоты, насыщенный нитратом серебра и тетрадеканом.

Для выполнения двумерной ТСХ модельной смеси 2 участки, А и Б пластинки (рис. 2.2) пропитывали раствором нитратом серебра в направлении 1 и в точку В наносили эту смесь. После проведения Ag+TCX данной смеси в направлении пропитывания 1 участок Б, не использованный при Ag+TCX, пропитывали тетрадеканом, а затем образовавшиеся зоны разделяли методом Ag+ОФ ТСХ в направлении 2, перпендикулярном первому (см. рис. 2.2). Зоны ДАТ обнаруживали как описано в разделе II.6.

П. 6. Обнаружение зон диаиилглицеринов и полуколичественная оценка видового состава стандартных смесей диацилглицеринов и модельной смеси 2.

После удаления с пластинки растворимых солей серебра и/или тетрадекана отдельные ТСХ-зоны иии БИ-ДАГ, где и = О, Л или Ле, обнаруживали с помощью ФМК (см. раздел П. 3.1), а ББ-ДАГ, не реагирующие с ФМК, окрашивали 10%-ным раствором сульфата меди в 8%-ном растворе фосфорной кислоты (СиБС^ + Н3РО4) — этот реактив обнаруживал также БИи ии-ДАГ [36]. Затем пластинку выдерживали 5−10 мин при 170 °C. Относительную интенсивность окрашивания зон ДАТ оценивали визуально и обозначали (в порядке ее повышения) символами «» +", «++» и «+++» .

11.7. Расчет параметров хроматографического разделения.

Для измерения хроматографической подвижности ДАТ при ОФ ТСХ использовали значения удерживания их зон относительно фронта растворителя (Щ.

В наших опытах по Аз+ТСХ и Ag+OФ ТСХ для разделения ДАТ применялась непрерывная ТСХ, которая, по сравнению с обычной ТСХ, улучшает разделение зон ДАТ между собой. Очевидно, что при использовании этого варианта ТСХ расстояние от стартовой точки до границы фронта подвижной фазы по окончании разделения, а, следовательно, — и индекс удерживания отдельных ТСХ-зон относительно этого фронта (Яу) не могут быть определены. Поэтому для измерения хроматографической подвижности вместо Яу применяли значения удерживания зон относительно величин удерживания какого-либо однокислотного стандарта ДАТ (^х).

При непрерывной А§+ТСХ модельной смеси 2 в качестве такого стандарта было целесообразно использовать изомер гас-1,3-ЛЛ, полученный из продуктов каталитической переэтерификации смеси метиловых эфиров жирных кислот масла мака с глицерином, поскольку по величине подвижности он не совпадал ни с одной из зон гас-1,2-ДАГ.

Наблюдавшиеся значения подвижности j-ой зоны ДАТ выражали как отношение к подвижности стандарта (i?i, 3-JDi)j> для которого, очевидно, значение = 1- При Ag+ОФ ТСХ соответствующим стандартом служил гас-1,2-ЛеЛе, поскольку по величине подвижности он превышал все остальные компоненты модельной смеси 2, для которых, следовательно,^1,2-ЛеЛе < 1- Подвижность j-ой зоны ДАТ при этом характеризовали величиной (^1,2-ЛеЛе)] Окончательный результат расчета подвижности ДАТ при непрерывной ТСХ с помощью обоих этих стандартов выражали значением х ± s, где jc — средняя арифметическая пяти измерений ее величины, a s — абсолютное стандартное отклонение этих измерений от х.

Эквивалентную липофильность индивидуальных видов ДАТ при ОФХ выражали величиной Lj (см. раздел 1.1), а при Ag+ОФ ТСХ — величиной L2 = Lj — и, где и — число U-ацильных остатков в молекуле ДАТ [6,17].

Разделяющую способность отдельных разновидностей ТСХ в отношении наших модельных смесей ДАТ выражали величиной полноты фракционирования (ПФ), равной отношению числа индивидуальных видов ДАТ смеси, выделенных и идентифицированных с помощью данной разновидности ТСХ, к общему числу видов ДАТ в той или иной смеси (равному 15). Эффективность данного метода оценивали также значениями AL], LL2 или Ае, т. е. минимальной разностью между соседними зонами ДАТ по величине соответствующего параметра молекулы, еще обеспечивавшую их разделение между собой.

II.8. Расчет статистического видового состава смеси диацилглицеринов.

Обычно в смеси ТАГ, полученной переэтерификацией при высокой температуре в течение продолжительного времени, имеет место статистическое распределение ацильных остатков между молекулами глицерина [5]. Возможное общее число видов ТАГ в такой смеси (N, без учета изомеров положения), концентрации этих видов (Ai, А2,. мол.% от их суммы) и количественный состав этой смеси (мол.%), вычисленный согласно теории статистического распределения, обозначают терминами «статистическое число», «статистические концентрации» и «статистический.

45 состав", соответственно. Значения N и Ai, А2,. рассчитывают, исходя из числа (п) и концентрации (а, Ь,. мол.%) остатков индивидуальных жирных кислот в смеси ТАГ. Как известно, в такой смеси N = п + п (п-1) + п (п-1)(п-2), а статистические концентрации одно-, двухи трёхкислотных видов ТАГ равны а3/104, За2Ь/Ю4 и 6abc/104, соответственно [5].

Можно было считать, что распределение остатков жирных кислот в смесях ДАТ, полученных переэтерификацией, также является статистическим [5]. Поэтому с целью расчета статистического состава ДАТ в этих смесях мы видоизменили соответствующие вероятностные уравнения для вычисления N, а также Ai, А2 (см. выше). Очевидно, что N складывается из общего числа однои двухкислотных видов ДАТ, т. е. N = п + п (п-1)/2 = п (п+1)/2. Аналогичным образом, для каждого одно-кислотного вида ДАТ Ai = а2/100, а для любого двухкислотного вида А2 = 2д6/100- коэффициент 2 был введен в noaiaiee уравнение для учета обоих позиционных изомеров ДАТ [128]. Для описания вычисленного видового состава ДАТ в их смеси, полученной глицеролизом, использовали термины, приведенные выше.

Статистические концентрации ТАГ, ДАТ и МАГ в продуктах глицеролиза рассчитывали по формулам: у3/Ю4, Зу2(100-у)/104 и Зу (100-у)2/104, соответственно [104], где у = 100[ТАГ] /{[ТАГ] + [глицерин]} -содержание этерифицированных оксигрупп глицерина в мол.% от суммарного содержания всех оксигрупп (как этерифицированных, так и свободных) в исходной смеси для глицеролиза, а [ТАГ] и [глицерин] -концентрация ТАГ и глицерина (в мМ) в этой смеси (см. раздел II.3.1). Суммарную концентрацию ацилглицеринов принимали равной 100 мол.% и вычисляли концентрацию каждого из них (мол.%).