Особенности энергетического обмена микроскопических грибов-деструкторов промышленных материалов при экстремальном воздействии температурного и химического факторов

Жизнь любого организма проходит под воздействием множества экологических факторов, которые и определяют особенности его жизнедеятельности. В последнее время отмечено возрастание внимания к влиянию различного рода экстремальных воздействий на живые организмы. Особенно актуально исследование стрессовой реакции — неспецифического адаптационного синдрома.

Несмотря на все многообразие физиологических реакций живых организмов на различные типы стрессовых воздействий, в своей основе они являются достаточно сходными, что позволяет говорить об универсальности адаптивного ответа и существовании детальных различий, зависящих лишь от типа экстремального воздействия и конкретного вида организма (Полевой, 1989; Пахомова, 1995; Пятыгин и др., 1999).

Рядом авторов показано, что одной из реакций в ответ на действие стрессового фактора являются изменения в энергетической системе организмов (Позмогова, Мальян, 1976, 1976аSelwan, 1980; Смирнов и др., 1990; Пахомова, 1995; Андреищева, Звягильская, 1999).

В настоящее время наиболее изученными являются механизмы адаптации к экстремальным воздействиям у растительных и животных организмов, изменения же в метаболизме микроскопических грибов при действии стрессового фактора мало исследованы. Они тем более интересны, что у грибов, помимо стандартных для всех эукариот макроэргических соединений (нук-леозиттрифосфатов), имеется альтернативный вариант доноров фосфора и энергии — неорганические полифосфаты, которые, кроме процессов запасания и расходования энергии, участвуют также в поддержании ионного баланса, в структурной организации клеточной стенки, в регуляции активности ферментов метаболизма ДНК, РНК, полисахаридов, в регуляции экспрессии генов (Кулаев, 1975; Беккер, 1988; Вагабов и др., 2000; Кулаев и др., 2000; Рош 2000). Предполагается также значительная роль полифосфатов в механизме адаптации к неблагоприятным факторам (Иванов и др., 1996; Gonzales, Jensen, 1998; Torres et al., 1998; Schroder, Muller, 1999; Шредер и др., 2000).

Исследование влияния экстремальных воздействий на грибные организмы представляет интерес для понимания механизмов формирования адаптационных реакций живых организмов к стрессу. В практическом плане изучение воздействия стрессовых факторов на микроскопические грибы позволит целенаправленно и планомерно решать вопросы биодеструкции промышленных материалов, фитопатологии и биотехнологии.

Цели и задачи исследования.

Цель данной работы состояла в выявлении особенностей энергетического обмена (систем полифосфатов, адениловых нуклеотидов и ферментативных систем, участвующих в метаболизме этих соединений) микроскопических грибов в условиях экстремальных воздействий некоторых абиотических факторов (ТШ и биоцидов).

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить стрессирующие дозы исследуемых факторов: температурного и химического (биоцидов) для микроскопических грибов.

2. Исследовать влияние стрессовых факторов на полифосфатную систему микромицетов.

3. Исследовать адениловую систему микромицетов при действии стрессовых факторов (ТШ и биоциды).

4. Исследовать стрессирующее воздействие (ТШ и биоциды) на фосфа-тазную и пирофосфатазную активности микроскопических грибов.

5. Исследовать содержание неорганического фосфата у микромицетов в условиях экстремальных воздействий.

6. Выявить общие закономерности и особенности влияния стрессирую-щих температурного и химического факторов на энергетические процессы микроскопических грибов.

Научная новизна работы.

Впервые исследовано влияние двух экстремальных факторов различной природы: температурного и химического, на энергетическую систему мице-лиальных грибов.

Воздействие теплового шока и биоцидов на энергетический обмен мик-ромицетов проявляется как в наличии специфических реакций, ход которых определяется природой стрессового фактора и видовой специфичностью грибов, так и в наличии неспецифических реакций, не зависящих от природы абиотического фактора.

Получены новые данные, подтверждающие универсальность адаптивного ответа и свидетельствующие об участии энергетической системы в формировании ответной реакции на действие стрессовых факторов.

Впервые выявлены общие тенденции и особенности полифосфатной и адениловой систем микроскопических грибов, как в нормальных условиях, так и в условиях стресса.

Впервые для микромицетов исследовано влияние ТШ и фунгицидов на активность трех основных типов АТФаз: Б-, Ри У-типа.

В работе впервые установлено, что экстремальное воздействие температуры и биоцидов приводит к ингибированию фосфатазной активности экзо-форм микроскопических грибов, тогда как активность эндоформ, наоборот, увеличивается. Также при действии данных стрессовых факторов показано увеличение пирофосфатазной активности.

Исследуемые абиотические факторы (температура и биоциды), путем воздействия на некоторые компоненты энергетической системы грибов (полифосфатная и адениловая системы), способны оказывать влияние на адаптационные механизмы микромицетов, что позволяет, в определенной мере, регулировать устойчивость последних при экстремальном воздействии факторов внешней среды.

Практическая значимость работы.

Полученные результаты важны для понимания механизма адаптивной реакции к стрессовым воздействиям. Результаты проведенных исследований дают возможность рассматривать полифосфатную и адениловую системы мицелиальных грибов как важные составляющие в формировании механизма стрессовой реакции. Знания о механизме адаптивной реакции микроскопических грибов позволят целенаправленно и планомерно решать вопросы биодеструкции промышленных материалов, фитопатологии и биотехнологии. Основные выводы и результаты могут быть использованы в учебном процессе на биологическом факультете Нижегородского госуниверситета при чтении спецкурса «Экологическая биотехнология».

II. Обзор литературы.

II. 1. Действие экстремальных факторов на метаболизм микроскопических грибов.

П. 1.1. Механизмы адаптации организмов к действию экстремального фактора (теплового шока). Влияние гипертермии на микроскопические грибы.

Организмы постоянно подвержены воздействию различных экстремальных факторов (радиационный, температурный, химический стресс и др.). По мнению ряда авторов (Селье, 1972; Меерсон, 1986; Войников, 1989; Полевой, 1989; Кузнецов и др., 1990; Блехман, 1992; Пахомова, 1995; Тка-ченко и др., 1998; Андреищева, Звягильская, 1999), самые различные факторы (кислоты, щелочи, гипои гипертонические растворы, температура, соли тяжелых металлов, радиоактивные изотопы и др.) вызывают однотипные морфологические и физиологические изменения в животных и растительных клетках. В данном разделе более подробно остановимся на механизмах адаптации к тепловому стрессу, как наиболее изученному. Повышенная температура, по сравнению с обычной физиологической нормой, относится к одному из широко распространенных экстремальных воздействий, и осуществление процессов жизнедеятельности организмов в этих условиях представляет одно из интересных биологических явлений. Способность выжить, а также расти и развиваться при воздействии повышенной температуры, является одним из совершенных механизмов, выработанных в процессе эволюции, — механизмом адаптации. Этот механизм сходен у разных форм организмов и характеризует не только влияние гипертермии, но и воздействие других экстремальных факторов (Карасевич, 1975; Билай, 1985).

Общеизвестно, что концепция стресса была сформирована Г. Селье. По определению Селье, стресс — это совокупность всех неспецифических изменений организма, возникающих под влиянием любого сильного воздействия и являющихся результатом работы неспецифического защитного организма, увеличивающего сопротивляемость организма к стрессовым факторам, или стрессорам (Пахомова, 1995). Селье (1972) разделил весь адаптационный процесс организма на три стадии: 1 — реакция тревоги, 2 — стадия адаптации, 3 — стадия истощения.

Однако первоначально стресс — это напряжение организма во время развития в нем универсальной защитной реакции на всевозможные воздействия. Стресс, как форма преодоления живой материей экстремальных условий, должен иметь общебиологический смысл, т. к. обеспечивает переход на новый уровень метаболизма. Нарушение гомеостаза — не критерий гибели клетки, а условие для перехода в новое состояние (Войников и др., 1989).

В первой фазе стресса развивается целый комплекс однотипных изменений, зависящих как от типа и дозы стрессора, так и от вида организма. К начальным обратимым неспецифическим процессам, происходящим в клетке гл 2+ при действии стрессора, относятся: переход Са в цитоплазму из вакуолей, митохондрий, эндоплазматической сетиизменение молекулярного состава в отдельных классах липидов и текучести мембранактивация гидролазснижение синтетических процессов (но одновременно активируется синтез РНКазы) — разрыхление белковых глобул, изменение их вторичных, третичных и четвертичных структурповышение проницаемости мембран и выход из клеток различных веществдеполяризация мембрансдвиг рН цитоплазмы в сторону более низких значенийнарушение окислительного фосфорилиро-ванияразвитие свободнорадикальных реакцийсинтез стрессовых белков на фоне падения общего количества белка и т. д. (Александров, 1985; Браун, Моженок- 1987; Полевой, 1989; Войников и др., 1989; Кулаева и др., 1991; Андреищева, Звягильская, 1999; Андреищева и др., 1999; Watson et al., 1999).

По мнению Г. Л. Шкорбатова (1982), адаптивный процесс может быть расчленен на следующие этапы:

1. Мобилизационная фаза (активация защитных механизмов);

2. Фаза перестройки адаптационных процессов;

3. Фаза включения новых механизмов адаптации;

4. Фаза стабилизации механизма.

Возможность адаптации обусловлена зависимостью термодинамических, химических, кинетических констант от температуры. Эта зависимость определяет направление и скорость химических реакций, конформационных переходов биологических макромолекул, фазовых переходов липидов, изменения проницаемости мембран и других процессов, функционирование которых обеспечивает жизнедеятельность организмов при повышенной температуре (Билай, 1985).

В.Я. Александров (1975) выдвинул гипотезу о механизмах адаптации организмов к повышенной температуре, заключающуюся в том, что для нормального функционирования организмов при высокой температуре их белки, нуклеиновые кислоты и липиды должны обладать определенным уровнем конформационной гибкости (т. е. они должны находиться в «семилабильном» или «семистабильном» состоянии). При подъеме температуры, несмотря на сдерживающее влияние гидрофобного взаимодействия, имеет место общая или локальная лабилизация молекул. Стрессовые белки, устойчивые к нагреву, находясь в среде, где присутствуют лабильные белковые макромолекулы, подвергшиеся развертыванию в результате стресса, препятствуют их взаимной агрегации, т. к. снижают скорость диффузии.

Согласно денатурационной теории повреждений, основными объектами репарации в клетках, пострадавших от шока, должны быть белки и белковые конструкции с нарушенной пространственной структурой. Их репарация может осуществляться путем замены поврежденных молекул вновь синтезируемыми или путем их ренативации. Для успешного осуществления ренати-вации белков, пространственная структура которых нарушена при стрессе, они должны быть предохранены от протеолиза и агрегации. Этому способствует некоторые стрессовые белки и родственные им конститутивные белки так называемые шапероны (Кулаева и др., 1991; Александров, Кислюк, 1994; Пахомова, 1995).

Биосинтез стрессовых белков в неблагоприятной ситуации — явление общебиологическое. Вызванные тепловым шоком изменения активности генов в клетках сопровождаются двумя характерными событиями на уровне синтеза белка. Во-первых, начинается синтез белков теплового шока (БТШ), и, во-вторых, прекращается (или сильно замедляется синтез всех остальных белков) (Войников с соавт., 1984; Пахомова, 1995). О существенной роли БТШ в жизни клеток говорит их высокая консервативность в эволюции. Например, 1⁷⁰ имеет высокое сходство аминокислотной последовательности у насекомых, птиц, млекопитающих, грибов, растений. Отдельные участки Ьзр70 сохраняют свыше 90% гомологии у бактерий и человека (Войников с соавт., 1986; Кулаева и др., 1991).

БТШ представлены группой высокомолекулярных (110−60 кЭа) и низкомолекулярных (35−15 кОа) белков. Уотсон К. с соавторами (1999) исследовали стрессовую реакцию у дрожжей, выделенных из различных экологических ниш, на различные виды воздействий: тепло, спирт, а также окислительный и свободнорадикальный стресс. Были выявлены заметные различия в стрессовой реакции в отношении, например, к данному виду стресс — температуре, при которой индуцируются стрессовые белки, и в степени приобретаемой устойчивости. Однако для всех исследованных дрожжей наблюдался одинаковый набор БТШ: Ьзр104, Ьзр90, Ьзр70 и ЬзрбО. Аналогичные исследования с №игозрога сгаББа показали, что тепловая обработка стимулирует образование у данного вида гриба БТШ с молекулярной массой 105, 99, 78, 43 и 23 кОазначительные количества Ьзр99 и Ьзр78 связаны с ядром (Войников с соавт., 1984).

Предполагают, что гены холодового стресса отличаются от генов БТШ, хотя в клетках, например, сои полипептид с молекулярной массой 67 кБа обнаруживается как при гипо-, так и при гипертермии (Войников и др., 1989).

Малые белки теплового шока являются разнообразной группой индуцированных нагревом белков, которые обнаружены в прокариотах и эука-риотах. Последние данные свидетельствуют, что малые БТШ действуют как молекулярные шапероны для предотвращения термической агрегации белков посредством связывания ненативных промежуточных соединений, структура которых затем может быть восстановлена АТФ-зависимым образом другими шаперонами (Lee, Vierlin, 2000). Hsp30 может стабилизировать гексокиназу in vivo во время теплового шока (Plesofsky, Brambl, 1999). При осмотическом стрессе у дрожжей синтезируются hsp26 и hspl2. Хотя их функции остаются до конца не выясненными, отмечено массированное накопление обоих белков при тепловом и осмотическом стрессе, в присутствии этанола, Н202, истощении среды по глюкозе (Андреищева, Звягильская, 1999).

В формировании повышенной устойчивости большое значение придают накоплению защитных и адаптогенных соединений. Как известно, пролин благодаря своим гидрофильным группам может образовывать агрегаты, которые, взаимодействуя с белками, повышают их растворимость и защищают от денатурации (Пахомова, 1995). Предполагают, что растворимые углеводы также играют при стрессе защитную роль. Они не только стабилизируют белковые макромолекулы, но и влияют на метаболизм в целом (Колупаев, Трунова, 1992; Cansado et al., 1998; Wera et al., 1999). Полиамины обладают свойствами поддержания нативной структуры нуклеиновых кислот, стабилизации мембран, торможения РНКазной и протеазной активности и перехвата радикалов (Пахомова, 1995; Ткаченко и др., 1998).

Как уже говорилось ранее, адаптационная реакция на воздействие теплового стресса присуща всем живым организмам. И грибы не являются исключением из этого общего правила. По современным представлениям в основе экспрессии генов, кодирующих стрессовые белки, у эукариот лежит взаимодействие особого белка — фактора теплового шока (HSF) с определенной консервативной нуклеотидной последовательностью в промоторе этих генов, называемой элементом теплового шока (HSE). Фактор теплового шока и элемент теплового шока присущи и грибам. Но, в отличие от животных и растений, у грибов для транскрипции м-РНК стрессовых белков недостаточно связывания с Н8Е, необходима активация На это, в частности, указывает то, что у дрожжей Н8Б связан с Н8Е, но в отсутствие стресса экспрессии генов стрессовых белков не происходит. Для запуска транскрипции у дрожжей требуется активация фактора, сопровождающаяся изменением его конформации — переходом из мономерного в трехмерное состояние — и фос-форилированием (Александров, Кислюк, 1994).

Различают два типа адаптационных реакций. Первый тип — это физиологическая адаптация, когда происходит лишь реализация потенциальных возможностей организма без изменений наследственного материала. Второй тип связан со стойкими преобразованиями генетической информации (Кара-севич, 1975). При фенотипической адаптации организм реализует свои потенциальные возможности без изменения количества и качества имеющейся генетической информации, т. е. без изменения наследственности данного организма. В основе ее лежит регуляция клеточного метаболизма в связи с изменениями внешней среды под контролем генотипа. Поэтому ее называют еще физиологическим приспособлением (физиологической адаптацией) (Па-хомова, 1995).

Что касается генетической адаптации, то гипертермия, вызвавшая изменения наследственной информации, привела к появлению такой группы грибов, как термофилы. По отношению к температуре грибы разделяют на три группы: психрофильные, мезофильные, термофильные, — каждая из которых характеризуется своими температурными границами, температурным оптимумом и степенью толерантности. Так, психрофильные грибы растут в пределах от -3 до +10°С, мезофильные — от 10 до 38 °C, термофильные — от 10 до 50 °C (Билай, 1974). Термофильные грибы, в свою очередь, делят еще на две группы (Билай, 1985):

Термофильные грибы.

Облигатные термофилы Факультативные термофилы.

Термомезофилы.

Мезотермофилы.

ТЕМПЕРАТУРА.

Р О С Т А, °С ппп 20−25 opt 42−55 шах 55−63 пип 10−15 ор! 30−40 тах 40−52 тт 5−10 ор! 24−28 тах 40−45.

Установлено, что генетические структуры термофилов, в частности ДНК, более резистентны к действию температур, чем у других групп грибов (Билай, 1985). Термотолерантность микромицетов в определенной степени зависит от конформационной прочности нуклеиновых кислот, от структуры, молярного содержания и соотношения в-С-парвзаимосвязи нуклеиновых кислот с белками и другими соединениями (Карасевич, 1975; Григоров и др.,.

Белоксинтезирующие системы термофилов (и-РНК, т-РНК и т-РНК-лигаза, р-РНК и рибосомы) в силу специфического строения (увеличение степени спирализации, увеличение температуры плавления) более стабильны при высоких температурах. Ферменты, синтезируемые термофильными организмами (как внеклеточные, так и внутриклеточные) устойчивы к действию такого денатурирующего фактора, как повышенная температура. Эта термоустойчивость связана с различными конформационными состояниями и свойствами этих белков.

Клеточные мембраны термофилов характеризуются значительными отличиями в составе липидно-белкового комплекса: липиды у изученных видов термофилов состоят из более насыщенных жирных кислот с разветвленной углеродной цепочкой.

Полученные экспериментальные данные показывают, что между теп-лолюбивостью организма и свойствами важнейших компонентов клетки в процессе эволюции выработался параллелизм. Вся совокупность признаков, отличающих термофилов, наследственно закреплена в генотипе. И эта зако.

1997). дированная информация реализуется в фенотипе только при определенных условиях — при повышенной температуре, т. е. при температуре, оптимальной именно для термофилов.

Облигатность термофилии можно рассматривать как эволюционно более закрепленную адаптационную способность, а факультативность — как выражение активного процесса адаптации к повышенной температуре (Билай, 1985).

Поскольку биохимические механизмы, обеспечивающие устойчивость к действию стрессовых факторов, энергозависимы, исследование влияния экстремальных воздействий на энергетические процессы организмов представляет интерес в связи с выяснением механизмов устойчивости к стресси-рующим факторам.

По мнению Ф. З. Меерсона (1986) мобилизация энергетических ресурсов сочетается с неравномерным их распределением — передачей их из систем, не участвующих в адаптациях к данному фактору, в системы, ответственные за эту адаптацию.

В последнее время рядом авторов проводится работа по изучению взаимосвязи между активностью ферментов фосфорного обмена грибов и действием стресса. Так, в работах Selwan (1980) было показано, что активность фосфатаз у Aspergillus nidularis может изменяться при повышении температуры. Активность кислой фосфатазы при повышении температуры до 37 °C в присутствии белковых гидрализатов увеличивалась на 70−80%. Такие же результаты наблюдались и при 43 °C. Активность Са+2-АТФазы увеличивалась только в присутствии липидов и при 43 °C. Активность пирофосфата-зы увеличивалась в 2 раза и не зависела от используемого источника энергии.

В работе Лайвениекса М. Г. с соавт. (1978) показано существенное увеличение активности кислой фосфатазы при обезвоживании при 37 °C в течение 24 часов, тогда как при лиофилизации активность значительно снижалась. По мнению авторов, данное повышение активности при обезвоживании при повышенной температуре является результатом синтеза de novo конститутивной формы фермента.

Полагают, что полифосфатазы, к которым относят и пирофосфатазу, участвуют в адаптивном ответе на экстремальное воздействие (Кулаев, 1975; Кулаковская, 2001). При адаптации клеток Escherichia coli к присутствию ок-симочевины отмечено двукратное увеличение активности неорганической пирофосфатазы в клетках (Heinonen et al., 1976).

Что касается химического воздействия, то для дрожжей показано, что ингибирующая активность веществ определяется в основном их химической природой и не зависит от осмотического эффекта, которой создает тот или иной раствор (Калюжин, 1998).

II.1.2. Фунгициды как один из способов защиты от биоповреждений.

Действие фунгицидов на метаболизм грибов.

В качестве химических средств защиты промышленных материалов от биоповреждений, вызываемых микроскопическими грибами, в последнее время находят применение фунгициды, по химическому строению которые можно разделить на следующие группы:

1. неорганические соединения;

2. органические соединения;

3. металлорганические соединения.

В основе токсического действия фунгицидов лежит их способность ин-гибировать те или иные реакции метаболизма микромицетов, нарушать их клеточные структуры. Как и любое экзогенное вещество, фунгицид первоначально контактирует с клеточной оболочкой и мембраной, проникает через них и затем уже вступает во взаимодействие с внутриклеточным содержимым. Наиболее вероятным механизмом поступления токсинов в клетку является диффузия через клеточную оболочку по градиенту концентрации, а в случае заряженных веществ определенная движущая сила создается градиентом заряда по обе стороны мембраны (Анисимов и др., 1988).

Вопрос о механизме действия фунгицидов многими авторами рассматривается с точки зрения ингибирования метаболитов и ферментативных систем грибов. Многие фунгициды ингибируют метаболизм более, чем на одной стадии его последовательного пути (Кадыров, 1970; Анисимов и др., 1987).

Фунгициды взаимодействуют с достаточно узким кругом функциональных групп веществ клетки. Однако, это те группы, которые играют важнейшую роль в метаболизме и образовании клеточных структур (Ильичев и др., 1987). Некоторые фунгициды нарушают структуру или функцию клеточных компонентов, например, реагируя с сульфгидрильными или аминогруппами белков оболочки, они изменяют ее проницаемость (Уэбб, 1966). Атакуя активные группы ферментативных белков, фунгициды инактивируют многие энзимы. Атомы галогенов могут вступать в реакции замещения с МН2- и 8Н-группами (Мельников, 1968; Кадыров, 1970). Так, фунгицид 4,5,6-трихлорбензоксазолин инактивирует изоцитратдегидрогеназу и малатдегид-рогеназу (Анисимов и соавт., 1977).

Фунгициды взаимодействуют в клетке также с соединениями, содержащими карбоксильные, спиртовые, альдегидные группы, путем нуклеофиль-ного замещения, окислительно-восстановительной реакции, образования хе-латных комплексов и т. д. (Коваль, Сидоренко, 1989). Кроме этого, некоторые фунгициды являются мутагенами. Так, при исследовании влияния некоторых фунгицидов на БасскаготусеБ сегегг81ае показано, что сильным мутагенным действием обладают производные нитрофурона С7Н6Ы204 и морфолина ВНХ-Л-20-Мь тетраметилтиурамдисульфид, фундазол, индуцирующие реверсии по гистидину и рекомбинации по лизину (Пашкявичус, 1993).

Биологическая активность ряда химических соединений определяется их способностью взаимодействовать с клеточной мембраной и, следовательно, изменять структуру мембраны, ее проницаемость для определенных ионов, ингибировать связанный с мембраной белок, влиять на активный и пассивный транспорт (Пирузен и др, 1974).

Из всех известных в настоящее время биоцидов самую большую группу представляют органические антисептики, среди которых хорошо известны четвертичные аммониевые соединения (ЧАС). ЧАС принадлежат к большому классу поверхностно-активных веществ, т. е. соединений, легко адсорбирующихся на поверхности реагентов и, в силу этого, способных снижать поверхностное натяжение растворителя. ЧАС являются агентами, вызывающими денатурацию белка и нарушающими целостность клеточной мембраны (Вер-бина, 1973; Злочевская и др., 1980; Иванов и др., 1996). Белок может либо образовывать с ПАВ-ами комплексы, которые по своим свойствам значительно отличаются от исходного белка, либо осаждаться, либо может произойти диссоциация белковых молекул на субъединицы. Механизм действия поли-алкилгуанидинов (ПАГов), относящихся к ЧАС, связан с разрушением клеточной стенки микроорганизмов, которая имеет отрицательный заряд, и атом N+ электростатически притягивается к ней. Кроме этого, ПАГи разрушают воспроизводящую функцию нуклеиновых кислот микромицетов, угнетают систему дыхания грибов (Гудзь и др., 1987; Леонтьева с соавт., 1998), нарушают систему транспорта через мембрану (Александрова и др, 1985; Леонтьева, Чеголузова, 1987). Изучение влияния различных ЧАС на биохимические свойства микромицетов показало, что эти биоциды вызывают концентрационное выделение в окружающую среду «агрессивных метаболитов» (ферментов, аминокислот, оргкислот). При этом грибы не теряют своей жизнеспособности, если содержание биоцида не превышает определенного, различного для разных культур, уровня (Гончарова, 1991). В первую очередь поражаются окислительно-восстановительные ферментные системы. Это выражается в уменьшении концентрации оксидоредуктаз, что связано с нарушением клеточной структуры и выходом ферментов наружу, частичным разрушением самих ферментов (Вербина, 1973). Полное подавление роста грибов в присутствии мертиолата и ТБОХ в концентрации 0,5% может происходить за счет ингибирования данными соединениями активности грибных липаз (Смирнов с соавт., 1989).

Злочевской И.В. с соавт. (1975, 1975а, 1977) изучено активное антигрибное действие некоторых органических биоцидов. Было установлено, что по-лиэтиленимин в концентрации 0,1%, метили этил-тетрагидрохинолин, а также некоторые диазоаминосоединения задерживают рост грибов: Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Penicillium cyclopium, Trichoderma legnorum. Катапин, катамин АБ в концентрации 0,1%, фунгицидной для гриба A. ustus, вызывают освобождение из мицелия аминокислот — аланина, фенилаланина, аргинина, глютаминовой кислоты, лизина и углеводов, что свидетельствует о нарушении проницаемости мембран (Злочевская с соавт., 1980, 1981).

Органические фунгициды вызывают ингибирование биосинтеза белка у плесневых грибов. Так действуют монохлорацетаминоканифоль и 4,5,6-трихлорбензоксазолинон (Смирнов, 1976), триэтилоловохлорид (Злочевская,.

Галимова, 1984). Биоцидную активность обнаруживают и эфиры различных органических кислот, в частности, сульфокислот. При этом установлено, что наивысшую активность имеют метиловые эфиры (Айзенман с соавт., 1973; Айзенман с соавт., 1975). Антигрибной и антибактериальной активностью обладают галогенопроизводные эфиров малоновой кислоты (Злочевская и ДР-, 1989).

Органические соединения, содержащие в своем составе атомы тяжелых металлов, таких как ртуть, олово, свинец, серебро и др., угнетают развитие многих биоразрушителей (Ховрычев с соавт., 1976; Заботин с соавт., 1988; Жильцов, Шустров, 1991; Щербаков и соавт., 1991; Анисимова с соавт., 1994; Заботин с соавт., 1998; Соломатов и др., 2001). Токсичность производных меди и ртути, вероятно, связана с взаимодействием этих соединений с дыхательными энзимами, содержащими сульфгидрильные группы (Иванова, 1964). Металлы в составе металлорганических биоцидных соединений реагируют с сульфгидрильными группами активных центров многих ферментов, вызывая их блокирование. Имеющиеся экспериментальные данные показывают, что в высоких концентрациях металлы, особенно тяжелые, коагулируют белки, вызывая тем самым немедленную гибель клеток (Александрова с соавт., 1987; Ильичев и др., 1987).

Наиболее эффективными являются ртутьсодержащие и оловосодержащие соединения. Органические соединения, содержащие олово, ртуть, понижают проницаемость цитоплазматических мембран для белков (Злочевская, 1975). Кроме ртутьи оловосодержащих органических биоцидов широкое применение имеют и органические соединения, содержащие ионы других тяжелых металлов. К наиболее эффективным неорганическим биоцидам относятся, в частности, уранилнитрат и сулема (хлорид ртути) (Ильичев и др., 1987).

Установлено, что токсичность оловоорганических соединений, в частности, трифенилбутилолова, объясняется их ингибирующим действием на транспорт электронов при окислительном фосфорилировании, т.к. данные соединения оказывают влияние на мембраносвязанные компоненты АТФаз. Имеются сведения о том, что соединения олова тормозят синтез клеточной стенки мицелиальных грибов (Ильичев и др., 1987).

В работе Фельдмана М. С. с соавт. (1981) изучалось действие оловоорга-нических соединений, в частности ТБОХ — трибутилоловохлорида, на интенсивность дыхания и активность некоторых ферментов: гексокиназы, альдола-зы, каталазы, пероксидазы у плесневых грибов: A. niger, A. flavus, Р. cyclopium, P. chrysogenum. В ходе эксперимента было показано, что в результате действия ТБОХ происходит существенное снижение активности суммарных дегидрогеназ. При введении фунгицида в концентрации 3×10″ 5 М активность ферментов у A. niger ингибируется в среднем на 70%. Значительное снижение интенсивности дыхания достигается, вероятнее всего, за счет связывания ионов металлорганических соединений (ионов олова) с сульфгид-рильными группировками, входящими в состав активных центров ферментов.

Тумановым А.А. с соавт. (1976) изучалось влияние катионов (соли HN03) и анионов (соли калия) на рост грибов Aspergillus niger, A. terreus, A.oryzae. Было установлено, что различные виды грибов обладают примерно одинаковой чувствительностью к одним и тем же ионам. Тяжелые металлы, в порядке снижения токсичности их ионов, можно расположить в ряд: Ag>Hg>Cd>Cu>Pb>Zn>Sr>Rb.

Показано, что ионы Zn, Со, Мп влияют на синтез органических кислот микромицетов, ионы Си, Со и Мо оказывают ингибирующее действие на морфогенез микроскопических грибов p. Fusarium (Элланская и др., 1993). Катионы ртути и серебра имеют большее сродство к сульфгидрильным группам. Соединяясь с сульфгидрильными группами активных центров тиоловых ферментов, они необратимо их ингибируют. Ионы Fe3+ взаимодействуют с активным центром РНК-азы микроорганизмов и, тем самым ингибируют фермент. Ряд катионов Hg2+, As2+, Cd2+, Cr3+, Cr6+, Ag+ и другие подавляют рост клеток, вызывая деградацию ДНК (Ильичев и др., 1987; Сидоренко, Коваль, 1991). Миллимолярные концентрации ванадата приводят к изменению ультраструктуры клеток и нарушению вакуолярной и секреторной активностей у дрожжей Hansenula polymorpha (Mannazzu et al., 1998). Гидроокись меди может снижать скорость роста, скорость репродукции и ферментацию различных видов дрожжей (Batus et al., 999).

Никель является эффективным фунгицидом, хотя он менее токсичен для грибов, чем ртуть, серебро и медь. Ионы никеля, поглощенные клетками, могут выступать в качестве конкурентного хелатообразующего катиона, например для ионов железа, и оказывать вредное влияние на жизнеспособность (Gonzales, Jensen, 1998). Снижение токсичности никеля может быть вызвано изменением pH среды или другими ионами металлов, а также органическими соединениями, которые способствуют образованию комплексов металлов (Joho et al., 1995).

В работе Ховрычева Е. А. с соавт. (1976) было исследовано влияние Н*, ОН-, Си и Ag на аминокислотный состав Candida utilis. Авторами был определен аминокислотный состав данной культуры при ингибировании роста неблагоприятными значениями pH, ионами меди и серебра и обнаружены некоторые специфические различия в аминокислотном составе дрожжей в зависимости от природы ингибитора.

В ряду галогеноидов наиболее токсичным для грибов, по мнению Туманова A.A. с соавт. (1976), является йод. Токсичность серы, входящей в состав биоцидных соединений, заключается в действии ее как акцептора водорода, и, таким образом, она принимает участие в процессах гидрогенизации и дегидрогенизации, происходящих в клетках грибов группы (Иванова, 1964). Эффективность карбодитиодных фунгицидов зависит от типа входящего в их структуру эфира, что приводит к изменению способности образования группамиC (=S)SR ассоциированных полимерных водородных связей, а также политиоструктур, возникающих после гидролиза 2,4,6-тригидроксибензенокарбодитиоидного аниона (Grazyna, Andrzej, 1993; Османов и др., 1998).

Широко применяются галоидные производные фенолов: н-хлор-м-крезол и пентахлорфенолятгетероциклических соединений: оксантины. бен-зимидазолы, пиримидины (Лукьянова и др., 1976; Burchfield, Storrs, 1976; Cremlyn, 1977; Hall, 1979). Механизм действия некоторых соединений (хлорированные нитробензолы и хелатобразующие соединения) заключается в ингибировании митоза клетки, в результате чего нарушается спорообразование (Кадыров, 1970). Было показано, что фенольные соединения подавляют активность дегидрогеназ за счет связывания с тем участком фермента, к которому присоединяется НАД (Гейл, Кандлифф, 1975). Механизм токсического действия соединений фенольной природы связывается с нарушением работы ферментативной системы цепи переноса электронов, в результате чего снижается интенсивность дыхания. Это относится, например, к ряду галоид-нитрозамещенных фенолов, которые могут служить проводниками протонов в биомембранах и выступать, следовательно, как агенты, разобщающие дыхание и фосфорилирование (Бобкова и др., 1971).

Биоцидность хинонов связывают с высокой реакционной способностью. Взаимодействуя с клеточными метаболитами, хиноны блокируют их, выключают их из обменных процессов. Основными мишенями их действия являются, видимо, аминогруппы и тиолы. Ингибируя тиоловые и аминосодержащие ферменты, хиноны, в первую очередь, нарушают дыхательные системы, разобщают окислительное фосфорилирование, инактивируют коэнзим А. Фун-гитоксичность уменьшается с изменением ядра хинона в следующем порядке: нафтохинон > фенантрахинон > бензохинон > антрахинон. Галоидирова-ние увеличивает биоцидность в такой последовательности: I < Br < С1 (Ильичев и др., 1987).

В работах целого ряда авторов изучалось действие разных классов фунгицидов на процесс дыхания у плесневых грибов. Было показано снижение интенсивности дыхания при воздействии на грибы таких биоцидов как мер-тиолат, монохлорацетоаминоканифоль, трилан, тетрафторборат аммония (Анисимов с соавт., 1975, 1983, 1984), сернокислый натрий, хлористый натрий (Бочева, 1974), малеимид (Ротенберг, Кельман. 1975), фурфурол (Гусарова, Витринская, 1970), этоний, н-трибутилолвохлорид (Смирнов, 1991) по-лиалкиленгуанидины (Смирнов с соавт., 1997).

Специфичными ингибиторами цитохромоксидазного комплекса являются цианиды и сероводород. Активность сукцинатдегидрогеназы в значительной степени подавляется ионами тяжелых металлов (Н§-, Си, РЬ) и хинонами. Это фермент, как содержащий сульфгидрильные группировки, может также ингибироваться цианкобаламином и производными малеимида (Ротенберг, Кельман, 1975).

В результате угнетения дыхания и активности дыхательных ферментов под влиянием органических и металлорганических фунгицидов у грибов наблюдается торможение синтеза органических кислот, образующихся в цикле Кребса.

Токсическое действие на грибы некоторых антибиотиков связано с торможением биосинтеза белка. Так стрептомицин, соединяясь с ЗОБ-субъединицей рибосом, вызывает деформирование их А-участка, что предотвращает связывание с данным участком амино-ацил-тРНК. Антибиотики группы тетрациклина также действуют на область А-участка, но кроме этого, они могут связываться и с другими участками рибосом (Гейл, Кандлифф, 1975). Действие антисептиков может приводить и к изменениям в структуре мембран, что отражается на активности связанных с мембраной ферментов. Антибиотик амфотерицин В, например, снижает активность щелочной фос-фатазы, АТФазы, лактатдегидрогеназы в мембранах микроорганизмов (Ани-симов, Александрова, 1983). Антибиотики могут ингибировать как биосинтетические процессы непосредственно, так и за счет подавления дыхания и, соответственно, энергообеспечения биосинтеза (Сгеш1уп, 1977).

Редко фунгицид ограничивается единичным механизмом действия. В этом отношении они могут рассматриваться как неспецифические. Но для отдельных микроорганизмов, в определенных условиях, они могут быть высоко специфичными.

V. Выводы.

1. На основе изучения действия абиотических факторов (температуры и биоцидов) на жизнедеятельность микроскопических грибов подобраны стрессирующие дозы температуры и биоцидов для исследуемых микро-мицетов. Они составляют: температура — 62 °C и 60 °C, метацид — 0,1% и 0,5%, АБП-40 — 0,01% и 0,1% - для А. т%ег и Р. оскго-сМогоп, соответственно.

2. При экстремальном действии факторов (гипертермии и биоцидов) не выявлено изменений в содержании неорганических ПФ в мицелии иследуе-мых грибов, а имеет место перераспределение ПФ по фракциям: увеличение количества щелочерастворимых и уменьшение солерастворимых ПФ. Для А. niger характерно также снижение содержания ПФ кислотораство-римой фракции.

3. ТШ вызывает снижение количества АТФ, АДФ и суммы адениловых нук-леотидов и увеличение количества АМФ у изучаемых микромицетов, в то время, как метацид увеличивает содержание всех адениловых нуклеоти-дов, а АБП-40, наоборот, снижает их количество в мицелии.

4. Воздействие ТШ и биоцидов в сублетальной концентрации приводит к увеличению полии пирофосфатазной активности у исследуемых грибов. Особенно значительно активность данных энзимов возрастает в условиях гипертермии.

5. Экстремальное гипертермическое воздействие приводит к ингибированию экзофосфатазной активности и активации эндофосфатазной. Действие биоцидных соединений также активирует эндоформы фосфатаз, однако, в меньшей степени, чем ТШ.

6. Гипертермия приводит к снижению общей АТФазной активности, как in vivo, так и in vitro, и снижению активностей F-, Ри V-типов АТФаз микроскопических грибов исследуемых микроскопических грибов. Метацид также ингибирует общую АТФазную активность микромицетов (in vivo и in vitro), а также подавляет активность плазматических и вакуолярных АТФаз. АБП-40 in vitro не оказывает влияния на общую АТФазную активность изучаемых мицелиальных грибов, однако имеет место ее активация in vivo, а также увеличение активности плазматических АТФаз.

7. Воздействие теплового шока и биоцидов на энергетический обмен микромицетов проявляется как в наличии специфических реакций (изменения в системе адениловых нуклеотидов и активности ферментов, участвующих в их метаболизме, изменения экзофосфатазной активности, интенсивности дыхания и содержание неорганического фосфата у микромицетов), ход которых определяется природой стрессового фактора и видовой специфичностью грибов, так и в наличии неспецифических реакций (перераспределение ПФ: увеличение количества щелочерастворимых и уменьшение солерастворимых ПФ, активация поли-, пирофосфатазной и эндофос-фатазной активности), не зависящих от природы абиотического фактора.

8. Исследуемые абиотические факторы (температура и биоциды), путем воздействия на некоторые компоненты энергетической системы грибов (полифосфатная и адениловая системы), способны оказывать влияние на адаптационные механизмы микромицетов, что позволяет, в определенной мере, регулировать устойчивость последних при экстремальном воздействии факторов внешней среды.

IV.

Заключение

.

Известно, что стрессом называется совокупность неспецифических реакций, протекающих на различных уровнях организма под влиянием любых сильных воздействий (стрессоров). Стресс — это одна из форм адаптации в условиях экстремальных воздействий. Проявление адаптационного механизма к стрессовому воздействию чрезвычайно многообразно и осуществляется в различных физиологических реакциях. Однако в ответе на действие стрессоров различают как неспецифические реакции, характерные для большинства организмов под влиянием любых сильных воздействий, так и специфические, связанные с природой экстремального фактора и видовыми особенностями организма.

Ряд авторов считает, что, несмотря на все многообразие физиологических реакций в ответ на различные типы стрессовых воздействий, в своей основе они являются достаточно сходными, что позволяет говорить об универсальности адаптивного ответа и существовании детальных различий, зависящих лишь от типа экстремального воздействия и конкретного вида организма.

Целью настоящей диссертации явилось изучение особенностей энергетического обмена (систем полифосфатов, адениловых нуклеотидов и ферментативных систем, участвующих в метаболизме этих соединений) микроскопических грибов в условиях экстремальных воздействий (действие теплового шока и биоцидов). Данные исследования важны как с точки зрения понимания механизмов адаптации, поскольку одной из реакций в ответ на действие стрессового фактора являются изменения в энергетической системе организмов, так и в практическом плане: при поиске эффективных средств защиты промышленных материалов от биоповреждений, а также средств защиты сельскохозяйственных растений.

В данном заключении сделана попытка показать те общие закономерности, которые были обнаружены в исследованиях при действии на микроскопические грибы А. niger и Р. оскго-сЫогоп гипертермии и стрессирующих концентраций биоцидов: метацида и АБП-40, то есть выявить те неспецифические реакции, проявляющиеся при действии на исследуемые грибы разных экстремальных факторов, а также показать и некоторые существующие различия, связанные с природой стрессового фактора и зависящие от конкретного вида организма.

Так, и при действии ТШ, и при воздействии биоцидов на грибные культуры не зафиксировано изменений в содержании неорганических ПФ в мицелии исследуемых грибов, имеет место лишь перераспределение ПФ по фракциям. Для обоих видов грибов, не зависимо от природы стресс-фактора, характерно увеличение количества щелочерастворимых ПФ и уменьшение числа солерастворимых ПФ, что указывает на особую роль ПФ данных фракций в процессе адаптации к стрессовому воздействию, связанную, вероятно, с восстановлением клеточной структуры, а также с энергообеспечением экспрессии генов и биосинтетических процессов.

Для А. niger характерно уменьшение количества ПФ кислотораствори-мой фракции при действии ТШ, в то время как у Р. оскго-сЫогоп каких-либо видимых изменений в данной фракции не наблюдается. Еще одно отличие состоит в трм, что изменения в «полифосфатном статусе» у А. niger более выражены, чем у Р. оскго-сЫогоп, что может быть связано с видовыми особенностями этих видов грибов.

Увеличение или уменьшение суммы ПФ зависят от преобладания в клетке полифосфаткиназной или полифосфат-гидролазной активности. В нашем случае имело место относительное постоянство общего количества ПФ, но наблюдались изменения в пофракционном содержании данных соединений. Данные результаты говорят о том, что при действии ТШ сохраняются как полифосфат-гидролазная, так и полифосфаткиназная активности, причем оба направления метаболизма ПФ (гидролиз и синтез), по-видимому, уравновешивают друг друга.

В данной работе исследовалась полифосфат-гидролазная активность, и результаты показали, что и действие ТШ, и воздействие стрессирующих концентраций биоцидов приводят к активации полифосфатаз микроскопических грибов. Сопоставление данных результатов с результатами по определению содержания ПФ в этих же экстремальных условиях позволяет предположить участие исследуемых ферментов в перераспределении ПФ при действии данных стресс-факторов.

Как показали результаты исследований влияния ТШ на систему адени-ловых нуклеотидов, при гипертермии снижается количество АТФ, АДФ и сумма адениловых нуклеотидов.

Фунгициды: метацид и АБП-40 — по-разному влияют на систему адениловых нуклеотидов микроскопических грибов. Воздействие стрессирующей концентрации метацида на культуры грибов вызывает повышение количества всех адениловых нуклеотидов и повышение их суммарного содержания, тогда как оловоорганическое соединение приводит к противоположному эффекту. По всей видимости, такое отличие в ответной реакции адениловой системы связано с различием в механизме действия биоцидов и, вероятно, в первую очередь, с различным влиянием на мембранные структуры клетки. Однако данные фунгицидные соединения, столь различные по своей природе, вызывают схожие изменения в процессе перераспределения аденозин-фосфатов у микромицетов.

Анализируя результаты исследований воздействия экстремальных факторов на систему адениловых нуклеотидов и сравнивая их с результатами действия данных факторов на содержание полифосфатов, можно сделать вывод, что ТШ и биоциды по-разному оказывают влияние на адениловую и полифосфатную системы микроскопических грибов. Данные результаты, возможно, связаны с тем, что основная функция адениловых нуклеотидовэнергообеспечение клетки, тогда как ПФ участвуют не только в процессах запасания и расходования энергии, но и в поддержании ионного баланса, в структурной организации клеточной стенки, в регуляции активности ферментов, участвующих в метаболизме ДНК, РНК, полисахаридов, в регуляции экспрессии генов.

Исследования действия стрессирующих факторов (ТШ и биоцидов) на грнбоь.

АТФазную активность микроскопических позволили установить, что изучаемые факторы в сублетальных дозах оказывают как непосредственное, так и опосредованное влияние на АТФазу микромицетов. При этом огромное значение имеет механизм действия того или иного фактора и, в первую очередь, его влияние на мембранные структуры клетки, поскольку АТФаза является мембраносвязанным ферментом.

Так, ТШ посредством денатурации белков может приводить к дезорганизации мембран, результатом чего, скорее всего, и является снижение АТ-Фазной активности. Метацид вызывает нарушение целостности мембранных структур и тоже приводит к снижению АТФ-гидролазной активности. Кроме этого, и ТШ, и метацид способны непосредственно ингибировать АТФазу микромицетов.

При действии АБП-40, наоборот, наблюдается резкое увеличение активности, что на фоне отсутствия прямого влияния на фермент говорит об активации энергетической системы при стрессирующей концентрации данного биоцида.

Исследование активности трех основных типов АТФаз, основанное на чувствительности данных ферментов к специфическим ингибиторам, показало наличие всех трех типов АТФаз у микроскопических грибов А. пщег и Р. оскго-сЫогоп. При изучении влияния экстремальных факторов на АТФазную активность было установлено, что ТШ по-разному влияет на различные типы АТФаз, метацид снижает общую АТФазную активность за счет подавления активности плазматической и вакуолярной АТФаз. АБП-40 не оказывает непосредственного влияния на какой-либо тип фермента, а вызывает, скорее, опосредованное повышение АТФазной активности, и, вероятнее всего, это повышение происходит за счет увеличения активности АТФаз плазматических мембран.

Поскольку синтез ряда макроэргических соединений, в частности, аде-ниловых нуклеотидов, связан с процессом дыхания, исследовалось также влияние изучаемых фунгицидных соединений на дыхание микроскопичсеких грибов. Результаты экспериментов показали, что при применении биоцидных соединений в сублетальных концентрациях интенсивность дыхания микроскопических грибов изменяется по-разному. При действии метацида наблюдается снижение интенсивности дыхания микроскопических грибов, а АБП-40, наоборот, приводит к тому, что интенсивность дыхания увеличивается. Данные результаты, по всей видимости, связаны с механизмом действия данных фунгицидов.

ТШ и воздействие сублетальных концентраций биоцидов оказывают влияние и на фосфатазную активность исследуемых микроскопических грибов А. niger и Р. оскго-сЫогоп. Как видно из полученных результатов, имеются общие тенденции в изменении активности. В ходе экспериментальных работ установлено, что имеется прямая зависимость активности экзои эн-дофосфатаз микромицетов от степени устойчивости исследуемых грибов к действию температуры (мезофильные и термофильные грибы). В условиях химического стресса отмечалось разное изменение активности фосфатаз при воздействии на грибы различных по химическому строению биоцидных препаратов.

Анализируя данные, можно сделать вывод о том, что экстремальное воздействие температуры и биоцидов приводит к ингибированию фосфатазной активности экзоформ микроскопических грибов, тогда как активность эндоформ, наоборот, увеличивается. Такое разнонаправленное действие изучаемых стрессирующих факторов связано, по всей видимости, с локализацией и функциональной нагрузкой экзои эндофосфатаз.

Для данных видов грибов было показано наличие активности еще одного фермента фосфорно-энергетического обмена, работа которого тесно связанного как с полифосфатной, так и адениловой системами — пирофосфатазы.

Установлено, что при действии ТШ и биоцидов происходит увеличение пи-рофосфатазной активности у обоих видов микромицетов.

Таким образом, полученные результаты в определенной степени подтверждают участие энергетической системы в формировании ответной реакции на стрессовое воздействие. Действие различных стрессовых воздействий на организм вызывает универсальный адаптивный ответ, проявляется в разнообразных внутриклеточных реакциях и напрямую связано с изменениями в системе энергообеспечения организма. У микроскопических грибов действие стрессовых факторов затрагивает метаболизм таких высокоэнергетических соединений, как неорганические полифосфаты и адениловые нуклеотиды.

Данные результаты в определенной степени могут служить подтверждением существования универсальности адаптивного ответа и существовании детальных различий, связанных с природой стрессового фактора и зависящих от конкретного вида организма.