Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства

Антитела являются наиболее охарактеризованным классом белков. Антитела связываются с целевыми молекулами с высокой аффиностью и специфичностью. Терапевтические антитела, на сегодняшний день, являются важнейшим инструментом врачей для борьбы с опухолями, воспалением и инфекциями. В настоящее время сотни антител и их производных проходят клинические испытания для терапии соответствующих заболеваний. Общий рынок терапевтических моноклональных антител составляет десятки миллиардов долларов США.

Хотя в природе антитела продуцируются иммунной системой, потребности в больших количествах антител с уникальной специфичностью стимулировали создание новых технологий для производства препаратов антител в биофармацевтических масштабах.

Гибридомные технологии стали первым методом для создания антител против любого необходимого антигена. Гибридомы получают путём слияния клеток селезенки иммунизованного животного с клетками миеломы. Большинство моноклональных антител произведённых с помощью гибридомной технологии являются мышиными, поэтому они иммуногены при использовании их в качестве терапевтических агентов для людей. Иммунный ответ организма человека против мышиных антител быстро снижает эффективность терапии путём очистки кровотока от мышиных антител [1]. Кроме того простого связывания антител с целью часто недостаточно для терапии иммунных заболеваний и рака. Для этого необходимы эффекторыные функции антител, такие как активация комплемента или клеточный ответ опосредованный связыванием с Бс рецептором, и мышиные моноклональные антитела не могут их полностью обеспечить [2].

Разработка человеческой гибридомной технологии, для продукции человеческих антител сталкивается с трудностями как технического (низкая эффективность иммортализации), так и этического характера (недопустимость иммунизации людей) [1].

Существуют различные методы для снижения антигенных свойств мышиных антител при сохранении аффинности. Первой стратегией для снижения иммуногенности было создание химерного антитела соединением вариабельных доменов мышиного антитела с константными доменами человеческого антитела [3, 4]. Было показано, что чужеродные framework области могут вызывать иммунный ответ [5], поэтому для дальнейшего снижения потенциальной иммуногенности было разработано несколько методов гуманизации антител.

Гуманизация включает в себя модификацию чужеродных каркасных аминокислотных остатков при сохранении последовательностей антигенсвязывающих областей. Первым описанным методом гуманизации была трансплантация (grafting) мышиных антигенсвязывающих областей (CDR) в человеческие каркасные области [6, 7]. Этот метод обычно приводит к значительному снижению или полной потере аффинности, так как некоторые каркасные аминокислотные остатки важны для поддержания конформации антигенсвязывающих областей [8, 9] или даже непосредственно участвуют в связывании антигена [10]. Кристаллографические данные помогают идентифицировать подобные аминокислотные остатки в гуманизованных антителах, их сохранение часто обеспечивает аффинность, сравнимую с нативным антителом [11,12].

Детальная структурная информация недоступна для многих антител, поэтому были разработаны методы конструирования вариабельных доменов, позволяющие сохранять аффинность. Эти методы включают в себя конструирование с помощью компьютера [13], перекладка (resurfacing) вариабельного домена [14], метод позиционного консенсуса [15], метод ближайшего гомолога [16], управляемая селекция [17], трансплантация SDR (specificity determining residues) [18], супергуманизация [19], метод Mix&Match [20].

Антитела, генетически 100% идентичные иммуноглобулингам человека, получают из набора генов антител человека с последующей селекцией с помощью фагового дисплея, либо производят в трансгенных мышах, несущих локусы иммуноглобулинов человека. Многие из антител, полученных таким образом, находятся в стадии клинических испытаний. Тем не менее, в настоящее время метод гуманизации является доминирующим для создания терапевтических антител вследствие его доступности. Поэтому разработка более совершенных методов гуманизации актуальна по сей день. В данной работе гуманизированы нейтрализующие антитела против возбудителей чумы и бешенства.

Чума — инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Yersinia pestis. Имея неограниченный природный резервуар в грызунах, чума до сих пор остается непобежденным заболеванием, вспышки которого регулярно регистрируются в разных точках Земного шара. Лечение антибиотиками бывает неэффективно при заражении резистентными штаммами возбудителя чумы Y. pestis или в случае быстротекущей легочной чумы. Для экстренной нейтрализации воздействия чумного микроба на организм человека целесообразно вводить в кровоток иммуноглобулин, специфичный к Y. pestis. Высокоаффинное мышиное антитело F19 против капсульного антигена F1 Y. pestis показало способность предотвращать гибель мышей, которых заражали летальными дозами вирулентного штамма Y. pestis 231(F1+). Такое антитело является наиболее подходящим кандидатом на роль прообраза терапевтического антитела.

По данным Всемирной организации здравоохранения, более 55 тысяч человек в мире ежегодно умирают от бешенства, более половины из нихдети до 15 лет [21]. Основным способом борьбы с бешенством на сегодняшний день является иммунизация человека и домашних животных. После контактов третьей категории, к которым относятся укусы, а также для людей с ослабленной иммунной системой, ВОЗ рекомендует пассивную иммунизацию, то есть введение анти-рабического иммуноглобулина [21]. Моноклональное 9 антитело (мАт) 1С5 полностью защищало мышей при введении через 3 часа после инфицирования и оказывало более выраженный терапевтический эффект, чем лошадиный антирабический иммуноглобулин [22, 23]. Такое антитело является приемлемым для создания терапевтического антитела против вируса бешенства.

Для решения многих практических задач не требуются полноразмерные антитела. Методы молекулярной биологии позволяют создавать различные рекомбинантные фрагменты антител. Например, Fab-фрагмент, образующийся при обработке молекул IgG папаином, структурно и функционально моновалентен, он обладает способностью связываться с антигеном, но не вызывает их преципитации или агглютинации. Поэтому оценку свойств связывания гуманизированных антитела удобнее проводить на примере его Fab-фрагмента. Дрожжи Pichia pastoris успешно используются для продукции Fab-фрагментов [24−26].

Таким образом, целью данной работы является разработка комплексного метода гуманизации антител на примере мАт против гликопротеида вируса бешенства (1С5) и F1 антигена Y. pestis (F19) и системы их продукции в дрожжах P. pastoris.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Антитела.

Антитела — одни из самых востребованных молекул на сегодняшний день. Трудно перечислить все области их применения. Не претендуя на всеобщность обзора, следует упомянуть некоторые из них. Так, антитела применяются для изучения клеточных процессов, для изучения взаимосвязи структуры белков и их функций. С помощью антител осуществляется типирование как молекул, так и клеток. Антигенная диагностика инфекций давно вошла в медицинскую практику, как и анализ компонентов крови с помощью антител. Методы аффинной очистки с помощью антител также широко распространены. Возможности терапевтического применения антител поистине безграничны: иммуносупрессия, визуализация и избирательное поражение опухолевых клеток и прочее. Прежде чем перейти к практическому применению антител, необходимо осветить общие вопросы, касающиеся антител.

5. ВЫВОДЫ.

1. Впервые определена структура Fv-фрагментов моноклональных антител F19 против F1 антигена Y. pestis и 1С5 против гликопротеида вируса бешенства.

2. Разработан метод гуманизации, позволяющий быстро и эффективно получать гуманизированные Fab-фрагменты. Эффективность метода проверена на мАт F19 и 1С5.

3. Показано, что дрожжи P. pastoris способны секретировать функционально активные мышиные и гуманизированные Fab-фрагменты мАт F19 и 1С5.

4. Установлено, что продукция Fab-фрагмента мАт 1С5 в P. pastoris лимитирована на стадии образования дисульфидных связей.

5. При высокоплотной ферментации дрожжей показано, что уровень продукции Fab-фрагмента пропорционален концентрации продуцирующих клеток.