Исследование экспрессии генов нейротрофических факторов человека в трансгенных линиях дрозофил

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Ген gdnf человека экспрессируется в трансплантированных эмбриональных нервных клетках линии СЗ-1М в мозг крысы. Это свидетельствует о том, что несмотря на то, что эмбриональные нервные клетки дрозофилы попадают в принципиально иное микроокружение в результате трансплантации, ген gdnf способен экспрессироваться при действии heat-шоковой для дрозофилы температуры тела млекопитающих. Перед нами была… Читать ещё >

Содержание

Глава 1. Обзор литературы
Ы.Трансгенные животные как экспериментальная модель 7 изучения генной экспрессии
- 1. 1. 1. Использование трансгенеза в решении проблем генетики развития
- 1. 1. 2. Трансгенные Drosophila
- 1. 1. 3. Гены Notch и Delta
- 1. 2. Векторы для клонирования в клетках насекомых
- 1. 2. 1. Использование бакуловирусов для экспрессии чужеродных генов в 13 клетках насекомых
  - 1. 2. 1. 1. Посттрансляционная модификация в клетках насекомых
  - 1. 2. 2. Использование Р-элементов для экспресии чужеродных генов 14 в клетках насекомых
  - 1. 2. 2. 1. Общая характеристика Р-элементов Drosophila
  - 1. 2. 2. 2. Векторы Карнеги
  - 1. 2. 2. 3. Вектор Карнеги
  - 1. 2. 2. 4. Вектор CaSpeR
  - 1. 2. 2. 5. Вектор рРА-I с геном Adh
  - 1. 2. 2. 6. Вектор pUChsneo
  - 1. 2. 2. 7. Плазмиды-помощники
- 1. 3. Нейротрофические факторы
  - 1. 3. 1. Общая характеристика нейротрофических факторов
  - 1. 3. 2. Нейротрофические факторы суперсемейства TGF-p
    - 1. 3. 2. 1. Характеристика нейротрофических факторов суперсемейства TGF-p
    - 1. 3. 2. 2. Рецепторы нейротрофических факторов суперсемейства TGF-p
    - 1. 3. 2. 3. Биологические эффекты нуль-мутаций лигандов и рецепторов семейства 25 GDNF
    - 1. 3. 2. 4. Сигнальный каскад Ret
    - 1. 3. 2. 5. Эффект GDNF в культурах клеток и тканей. 32 1.3.2.6.3ащитные и восстановительные свойства GDNF
  - 1. 3. 3. Фактор роста нервов. 35 1.3.3.1.Характеристика фактора роста нервов
    - 1. 3. 3. 2. Сигнальные каскады, вызываемые NGF
    - 1. 3. 3. 2. 1 .Характеристика сигнальных каскадов, вызываемых NGF
    - 1. 3. 3. 2. 2. Ras-MAPK киназный путь. 37 1.3.3.2.2.1. Генная экспрессия: немедленно ранние гены. 39 1.3.3.2.2.2.Экспрессия задержанно-ранних генов. 40 1.3.3.2.2.3.Фосфолипазный путь
    - 1. 3. 3. 2. 3. Ras-независимые сигнальные пути
    - 1. 3. 3. 2. 4. Нейротрофиновый р75 рецептор
  - 1. 3. 4. Нейротрофический фактор мозга (BDNF). 43 1.3.4.1 .Общая характеристика нейротрофического фактора мозга
    - 1. 3. 4. 2. Исследование мышей, нокаутированных по гену BDNF
    - 1. 3. 4. 3. Внутриклеточные каскады, активируемые BDNF
  - 1. 3. 5. Перспективы использования нейротрофических факторов в 46 лечении болезни Паркинсона
Глава 2. Материалы и методы
- 2. 1. Ферменты и реактивы
- 2. 2. Конструкции
- 2. 3. Приготовление компетентных клеток
- 2. 4. Трансформация Е. col
- 2. 5. Выделение плазмидной ДНК из Е. col
- 2. 6. Метод инъекций
- 2. 7. Выведение линий
- 2. 8. Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну)
  - 2. 8. 1. Выделение хромосомной ДНК
  - 2. 8. 2. Рестрикция хромосомной ДНК
  - 2. 8. 3. Гель-электрофорез ДНК
  - 2. 8. 4. Перенос ДНК на фильтр
  - 2. 8. 5. Приготовление меченого зонда
  - 2. 8. 6. Гибридизация
- 2. 9. Контроль экспрессии (Нозерн блот-гибридизация)
  - 2. 9. 1. Выделение тотальной РНК
  - 2. 9. 2. Гель — электрофорез РНК
  - 2. 9. 3. Перенос
  - 2. 9. 4. Гибридизация
- 2. 10. Гибридизация in situ на целых эмбрионах
  - 2. 10. 1. Приготовление меченого зонда
  - 2. 10. 2. Сбор и фиксация эмбрионов
  - 2. 10. 3. Подготовка эмбрионов к гибридизации
  - 2. 10. 4. Гибридизация
  - 2. 10. 5. Предадсорбция антител
  - 2. 10. 6. Отмывка гибридизации и обработка антителами
  - 2. 10. 7. Окрашивание
- 2. 11. Гибридизация in situ на срезах
- 2. 12. Вестернблоттинг
  - 2. 12. 1. Получение белковых лизатов
  - 2. 12. 2. Фракционирование белков в полиакриламидном геле
  - 2. 12. 3. Имунноблоттинг
  - 2. 12. 4. Имуннодетекция
- 2. 13. Иммуногистохимическое окрашивание на тирозингидроксилазу 70 и глиальный фибрилярный кислый белок
- 2. 14. Окрашивание X-gal
Глава 3. Результаты
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

Исследование экспрессии генов нейротрофических факторов человека в трансгенных линиях дрозофил (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

В последние годы все больше внимания уделяется использованию достижений фундаментальной науки в прикладных целях. Реализации этой задачи посвящены, в частности, исследования в области клеточной и генной терапии. Одним из важных аспектов работ такого рода является синтез генно-инженерных конструкций и подбор подходящих промоторов, которые обеспечили бы активное функционирование таких конструкций в мозге млекопитающих и человека. Недавно было показано, что ряд репортерных генов успешно функционируют в ксенотрансплантатах нейральных производных дрозофилы в мозге грызунов, будучи поставленными под промотор белка теплового шока дрозофилы (Корочкин, 2000; Александрова и др., 2000). Этому способствует то обстоятельство, что температура тела млекопитающих является шоковой для дрозофилы, и, естественно, что, попав в такие условия клетки дрозофилы’будут реагировать адекватным образом.

Встает вопрос — а как будут себя вести гены, кодирующие нейротрофические факторы человека, соединенные в генно-инженерном конструкте с хит-шоковым промотором дрозофилы? Если результаты будут положительными, можно будет думать об использовании этих промоторов в генной и клеточной терапии.

На первом этапе этой работы, проводимой в лаборатории нейрогенетики ИБГ РАН и в лаборатории молекулярной биологии ИБР РАН им. Н. К. Кольцова, требовалось проверить, будут ли «работать» гены человека под промотором гена теплового шока дрозофилы как в условиях развивающегося организма мухи под влиянием теплового шока, так и при помещении трансформированных клеток дрозофилы в мозг млекопитающих, т. е. в температурные условия, хит-шоковые для мухи.

Перед нами была поставлена задача осуществления именно этой проверки с целью подготовки проведения прямых генно-тералевтических экспериментов на животных. Работа облегчалась наличием хорошо разработанной экспериментальной модели, используемой нашими лабораториями совместно с лабораторией М. А. Александровой.

Прежде чем приступить к изложению материалов диссертации, считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем, без кого эта работа была бы невозможной. Я признателен научным руководителям член-корреспонденту, д.м.н. проф. Корочкину Л. И. и к.б.н. Павловой Г. В. Особую благодарность следует выразить к.б.н. Мерцалову И. Б., к.б.н. Башкирову В. Н., Модестовой Е. А, к.б.н. Ревищину А. В. за ценные консультации и методические советы. Хочу выразить признательность сотрудникам Института белка Гиоевой Ф. К. и Дерябиной О. А. за любезно предоставленную возможность исследовать экспрессию гена ngf методом Вестернблоттинга в их лаборатории.

Выводы.

1. Получены три линии D. melanogaster-r8, Г7 и СЗ содержащие нейротрофические гены человека ngf, bdnf и gdnf соответственно под хит-шоковым промотором.

2. Получены три гомозиготные линии содержащие соответствующий трансген, мутантный ген Delta и lac Z. Г7−1М (bdnf, Delta, lac Z), Г8−1М (ngf, Delta, lac Z), C3−1M (gdnf, Delta, lacZ).

3. В результате блот-гибридизации по Саузерну в линиях Г7иСЗ были выявлены фрагменты длиной 3500 нуклеотидов. В линии Г8 был выявлен фрагмент длиной 1300 нуклеотидов.

4. Проведен молекулярный анализ полученных линий, в результате которого было показано, что гены нейротрофических факторов человека активно транскрибируются под влиянием теплового шока. С помощью блот-гибридизации по Нозерну на разных стадиях развития выявлена индуцированная экспрессия гена gdnf на эмбриональной и личиночной стадиях, но не у взрослых мух, что позволяет предположить, что активность трансгенов под heat-шокоъъш промотором регулируется на разных этапах развития различными факторами.

5. Сигналы инициации транскрипции, по крайне мере для генов gdnf и bdnf, заключены не в кодирующей области, т.к. у дрозофилы нет аналогов генов gdnf и bdnf.

6. Показано, что ген gdnf человека под //еаг-шоковым промотором D. melanogaster транскрибируется в центральной нервной системе эмбрионов в головном и торакальном ганглиях, ngf — в головном ганглии, a bdnf транскрибируется по всей поверхности эмбриона равномерно.

7. Ген gdnf человека экспрессируется в трансплантированных эмбриональных нервных клетках линии СЗ-1М в мозг крысы. Это свидетельствует о том, что несмотря на то, что эмбриональные нервные клетки дрозофилы попадают в принципиально иное микроокружение в результате трансплантации, ген gdnf способен экспрессироваться при действии heat-шоковой для дрозофилы температуры тела млекопитающих.

8. Эмбриональные нервные клетки линии СЗ-1М (gdnf) значительно усиливают васкуляризацию неокортикальных аллотрансплантатов крыс при их совместной трансплантации, а также стимулируют рост аллотрансплантата. Вероятно, GDNF может влиять на развитие сосудов и способствовать их усиленному росту. Можно предполагать, что стимуляция роста аллотрансплантата может быть отражением нейропротективной функции GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы в результате генетически прогамированной гибели-апоптоза.

Показать весь текст

Список литературы

Гилберт С., Биология развития.// Москва. Мир. 1995. т.З.
Гловер Д., Клонирование ДНК. Методы.// Москва. Мир. 1988.
Корчкин Л.И., Михайлов А. Т., Введение в нейрогенетику.// Москва. Наука. 2000.
Корочкин Л.И., Новые подходы в генетике развития и генотерапии: ксенотрансплантацияэмбриональных нервных клеток дрозофилы в мозг позвоночных животных.// Генетика.2000. 36(11). 1436−1442.
Красильников М.А., Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит-3-киназой и их значение для роста, выживаемости и злокачественной трансформации клеток.// Биохимия. 2000. 65(1). 68−78.
Пирротта В., Проблемы трансформации клеток млекопитающих.// Москва. Мир. 1987.
Потеряев Д.А., Саарма М., Семейство GDNF: от нейротрофических факторов к онкогенезу.
Молекулярная биология. 2001. 35(2). 309−320.
Сингер М., Берг П., Гены и геномы.// Москва. Мир. 1998. т.2.
Степанов В.М., Молекулярная биология.// Москва. Высшая школа. 1996.
Татосян А.Г., Мизенина О. А., Киназы семейства Srs: структура и функции.// Биохимия.2000. 65(1). 57−67.
Alessi DR., Saito Y., Campbell DG., Cohen P., Sithanandam G., et al., Identification of the sites in MAP kinase kinase-1 phosphorylated by p74raf-l.// EMBOJ. 1994. 13. 1610−1619.
Bannor M. J., Goedert M., Williamas В., The possible relationship of glutathione, melanin and l-Methyl-4-Phenyl-l, 2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) to Parkinson’s Disease.// Biochem.
Pharmacol. 1984. 33. 2697−2698.
Bar-Sagi D., Feramisco JR., Microinjection of the ras oncogene protein into PC12 induces morphologic differentiation.// Cell .1985. 42. 841−848.
Beck KD" Valverde J., Alexi Т., Poulsen K., Moffar В., Vandlen R. A., Rosenthal A., Hefti F., Mesencefalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotonomy-induced degeneration in the adult brain.// Nature. 1995. 373. 339−341.
Bonni A., Ginty D., Dudek H., Greenberg M., Serine 133-phosphorylated CREB induces transcription via a cooperative mechanism that may confer specificity to neurotrophin signals.// Mol. Cell Neurosci. 1995. 6. 168−183.
Boydston W.R., Sohal G. S., Grafting of additional periphery reduces embryonic loss of neurons.// Brain Research. 1979. 178. 403−410.
Chen RH., Sarnecki C., Blenis J., Nuclear localization and regulation of erk and rsk-encoded protein kinases.// Mol. Cell.Biol. 1992. 12. 915−927.
Choi-Lundberg D.L., Lin Q., Chang Y.-N., Chiang Y.L., Hay C.M., Mohajeri H., Davidson B. L., Bohn M. C., Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy.// Science. 1997. 275. 838−841.
Cohen G., Ren R., Baltimore D., Modular binding domains in signal transduction proteins.// Cell 1995. 80. 237−248.
Cohen G., The pathobiology of Parkinson’s Disease: biochemical aspects of dopamine neuron senescence.// J. Neural. Transm. Suppl. 1983. 19. 89−103.
Copeland N.G., Zelenetz A.D., Cooper G. M., Transformation ofNIH/ЗТЗ cells by DNA of Raus sarcoma virus.// Cell. 1979. 17. 993−1002.
Cowley S., Paterson H., Kemp P., Marshall C., Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells.// Cell. 1994. 77. 841 852.
Dexter D. Т., Carter C. J., Wells F. R., Javoy-Agid P., Lees A. J., Jenner P., Marsden C.D., Basal lipid peroxidation in substantia nigra is increased in Parkinson’s Disease.// J. Neurochem. 1989. 52. 381−389.
Dexter D. Т., Carayon A., Vidailhet M., Ruberg M., Agid P., Agid Y., Less A., Wells F. R., Marsden C. D., Decreased ferritin levels in brain in Parkinson’s Disease.// J. Neurochem. 1990. 55. 16−20.
Diederich RJ., Matsuno K., Hing H., Artavanis-Tsakonas S., Cytosolic interaction between deltex and Notch ankyrin repeats implicates deltex in the Notch signaling pathway.// Development. 1994. 120. 473−481.
Ret/ptc2.// Mol Cell Biol. 1998. 18.2298−2308.
Ernfors P., Kucera J., Lee K., Loring J., Jaeniseh R., Studies on the physiolodical role of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 in knockout mice.// J.Dev.Biol. 1995. 39. 799 807.
Ferrante R.J., Hantraye P., Brouillet E., Beal M. F., Increased nitrotyrosine immunoreactivity substantia nigra neurons in MPTP treated baboons is blocked by inhibition of neuronal nitric oxide synthase.// Brain Research. 1999. 823. 177−182.
Ginty DD., Bonni A., Greenberg ME., Nerve growth factor activates a ras-dependent protein kinase that stimulates c-fos transcription via phosphorylation of CREB.// Cell. 1994. 77. 713 725.
Goldberg D., Posakony J., Maniatis Т., Correct developmental expression of a cloned alcoholdehydrogenase gene transducted into Drosophila germ line cells.// Cell. 1983. 34. 59−73.
Graham D. G., Oxidation pathways for catecholamines in the genesis of neuromelanin andcytotoxic quinones.// Mol. Pharmacol. 1978. 14. 633−643.
Greene L., Tischler A., PC 12 pheochromocytoma cultures in neurobiologicalresearch.// Adv. Cell. Neurobiol. 1982. 3. 373−414.
Hiwasa Т., Kondo K., Hishiki Т., Koshizawa S., Umezawa K., Nakagawara A., GDNF-induced neurite formation was stimulated by protein kinase inhibitors and supressed by Ras inhibitors.// Neurosci Lett. 1997. 238.115−118.
Hoffer В .J., Hoffman A., Bowenkamp K., Huettl P., Hudson J., Martin D., Lin L.F., Gerhardt G.A., Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.//Neurosci Lett. 1994. 182. 107−111.
Jenner P., Schapira A. H. V., Marsnden C. D., New insights into the cause of Parkinson’s Disease.// J. Neurochem. 1992. 42. 2241−2250.
Jing S., Tapley P., Barbacid M., Nerve growth factor mediates signal transduction through trk homodimer receptors.// Neuron. 1992. 9.1067−1079.
Johnston SH., Rauskolb C., Wilson R., Prabhakaran В., Irvine KD., Vogt TF., A family of mammalian Fringe genes implicated in boundary determination and the Notch pathway.// Development. 1997. 124. 2245−2254.
Kawamoto Y., Nakamura S., Kawamato Т., Akiguchi I., Kimura J., Cellular localization of brain-derived neurotrophic factor-like immunoreactivity in adult monkey brain.// Brain re seach. 1999. 381. 341−349.
Kearns С. M., Gash D. M., GDNF protects nigral dopamine neurons against 6- hydroxydopamine in vivo.// Brain Res. 1995. 672. 104−111.
Kolch W., Heidecker G., Kochs G., Hummel R., Vahidi H., Mischak H., Finkenzeller G., Marme D., Rapp U.R., Protein kinase Ca activates RAF-1 by direct phosphorylation.// Nature. 1993. 364. 249- 252.
Mann D. M. A., Yates P. 0., Possible role of neuromelanin in the pathogenesis of Parkinson’s Disease.//Mech. Ageing Deu. 1983.21. 193−203.
March HN., Scholz WK., Lamballe F., Klein R., Nanduri V., et al., Signal transduction events mediated by the BDNF receptor gpl45(trkB) in primary hippocampal pyramidal cell culture.// J. Neurosci. 1993. 13. 4281−4292.
Maxwell G.D., Reid K., Elefanty A., Bartlett P.F., Murphy M., Glial cell line derived neurotrophic factor promotes the development of adrenergic neurons in mouse neural crest cultures.// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 93.13 274−13 279.
Middlemas DS., Meisenhelder J., Hunter Т., Identification of TrkB autophosphorylation sites and evidence that phospholipase C-gamma 1 is a substrate of the TrkB receptor.// J. Biol. Chem. 1994. 269. 5458−5466.
Panin VM., Papayannopoulos V., Wilson R., Irvine KD., Fringe modulates Notch-ligand interactions.// Nature. 1997. 387. 908−912.
Payne D., Rossamondo A., Martino P., Erickson A., Her J., et al., Identification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/Mitogen-activated protein kinase (MAP Kinase).// EMBO J. 1991. 10. 885−892.
Perry T. L., Godin D. A., Hansen S., Parkinson’s Disease: A disorder due to nigral glutathione deficiency?// Neurosci. Lett. 1982. 33. 305−310.
Price M.L., Hoffer В .J., Granholm A.C., Effects of GDNF on fetal septal forebrain transplants in oculo. fi Exptl Neurol. 1996. 141(2). 181−189.
Rabizadeh S., Oh J., Zhong LT., Yang J., Bitler СМ., et al., Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor.// Science. 1993. 261. 345−348.
Rodgers A. D., Curzon G., Melanin formation by human brain in vitro.// J. Neurochem. 1975. 24. 1123−1129.
Rosengren E., Linder-Eliasson E., Carlsson A., Detection of 5-S-cysteinyldopamine in human brain.// J. Neural Transm. 1985. 63.247−261.
Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Gotz R., Barde YA., Binding of neurotrophin-3 to its neuronal receptors and interactions with nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor.// EMBO J. 1992.11. 917−922.
Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Barde YA., Binding of brain-derived neurotrophic factor hin-3 to nerve growth factor receptor.// Neuron. 1990. 4. 487−492.
Rubin G. M., Spradling A. C., Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.// Science. 1982. 218. 348−353.
Saveliev S., Lebedev V., Voronov K., Korochkin L., Histological analysis of autopsy after transplantation of xenogenic and fetal neural tissue.// 8th Internat. Congress of the Czech and Slovak Neurochemical Soc. Martin. 1996. 140−141.
Saveliev S., Evgenev M., Lebedev V., Korochkin L., Drosophila nerve cells survive and differentiate in amphibian and mammals brain // Internat. J. Development. Biol. 1997. 41. 801 808.
Sengstock G. J., Olanow C. W., Dunn A. J., Arendash G. W., Iron induces degeneration of nigrostriatal neurons.// Brain Res. Bull. 1992. 28. 645−649.
Smith C., Farrah Т., Goodwin R., The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation and death.// Cell. 1994. 76. 959−962.
Sofic E., Riederer P., Heisen H., Bechmann H., Reynolds G.P., Habenstreit G., Youdim, M. B. H., Increased iron (Ш) and total iron content in postmortem substantia nigra in parkinsonian brains.// J. Neural Transm. 1988. 74. 199−205.
Stephens RD., Loeb D., Copeland Т., Pawson Т., Greene L., Kaplan D., Trk receptors use redundant signal transduction pathways involving SHC and PLC gamma 1 to mediate NGF responses. // Neuron. 1994. 12. 691−705.
Treisman R., The serum response element. // Trends Biochem. Sci. 1992. 17. 423−426. Treisman R., Ternary complex factors: growth regulated transcriptional activators.// Curr. Opin. GenetDev. 1994. 4. 694−701.
Wu JY., Wen L., Zhang W-J., Rao Y., The secreted product of Xenopus gene lunatic Fringe, a vertebrate signaling molecule.// Science. 1996. 273. 355−358.
Yamasoba Т., Schacht J., Shoji F., Miller J.M., Attenuation of cochlear damage from noise trauma by an iron chelator, a free radical scavenger and glial cell line-derived neurotrophic factor in vivo.// Brain Res. 1999. 815. 317−325.
Yan Q., Matheson C.,'Lopez O.T., In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nature. 1995. 373. 341−344.
Youdim M. В. H., Ben-Shachar D., Riederer P., Is Parkinson’s Disease a progressive siderosis of substantia nigra resulting in iron and melanin induced neurodegeneration?// Acta Neurol. Scand. 1989. 126. 47−55.
Yong V.W., Perry T. L., Krisman A. A., Depletion of glutathione in brainstem of mice caused by N-methyl-4-phenyl-l, 2,3,6-tetrahydropyridine is prevented by antioxidant pretreatment.// Neurosci. Lett. 1986. 63. 56−60.

Заполнить форму текущей работой