Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth

В последние годы внимание исследователей все в большей мере привлекают культивируемые растительные клетки и ткани. Это связано, с одной стороны, с перспективностью их использования в качестве продуцентов ценных биологически активных веществ, а с другой — в качестве модели для изучения молекулярных механизмов протекания тех или иных процессов в растительных клетках.

Изолированные клетки растений находят все большее применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов. Кроме того, исследование механизмов клеточного метаболизма в дедифферепцировапых т. е. находящихся в стрессовых условиях клетках создает условия для более эффективного развития биотехнологии клеточных культур [65].

Растения рода Rauwolfia известны как перспективный источник получения многих алкалоидов, применяемых в медицинской практике. В Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии в результате многолетней селекции культуры ткани Raiiwofia serpentina получен высокоэффективный штамм — суперпродуцент антиаритмических алкалоидов. В процессе селекции использованы различные мутагены и иные стрессовые факторы, что привело к существенному изменению биохимических процессов, протекающих в культивируемых клетках Rauwofia serpentina. В рамках осуществления биохимического контроля за состоянием клеточных культур анализировали пероксидазу — один из основных ферментов метаболизма кислорода. Этот фермент принимает участие в каталитическом окислении различных субстратов, таких как фенолы, ароматические амины и др. Факт, что пероксидаза присутствует в микробных, растительных и животных клетках дает основание считать его жизненно важным соединением. Что касается растительной перокеидазы, то одной из основных ее функций является защита растения от различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Имеется много работ, посвященных биологической активности этого фермента, однако анализ синтеза и стабильности пероксидазы ранее ни кем не изучался. Мы полагаем, что такого рода исследования могут быть весьма актуальными, т.к. они дают весьма важную информацию не только об активности, но и о синтезе и распаде пероксидазы в динамике роста клеток. Задачи исследования: В работе были поставлены следующие задачи: Изучить динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусной культуры Rauvvolfia serpentina.

Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани Rauvvolfia serpentina, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.

Оценить скорость синтеза, распада и время функционирования в клетках ткани Rauvvolfia serpentina.

Исследовать влияние температурного шока на содержание и свойства пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность в культивируемых растительных клетках.

Научная новизна. В работе впервые была изучена динамика изменения пероксидазной активности растущей культуры клеток Rauvvolfia serpentina. Также впервые были изучены такие параметры, как молекулярная гетерогенность, синтез и стабильность пероксидазы. Разработай способ ее выделения и очистки до гомогенного состояния, изучены физико-химические свойства пероксидазиого белка.

В работе изучено влияние низко и высокотемпературного стресса на состояние пероксидазы и общего белка в каллусной культуре ткани Rauvvolfia serpentina. Установлено, что как при низкотак и при высокотемпературном шоке активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активность отдельных изоформ. Показано более выраженное повреждающее действие низкотемпературного шока.

Теоретическая и практическая значимость Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в каллусиой культуре ткани Rauwolfia serpentina позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культуре растительных клеток.

Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительных клеток, а также о протекторном действии пероксидазы, защищающей клетку от повреждения различными токсическими продуктами, возникающими в результате температурного воздействия.

Учитывая тот факт, что работа проводилась с промышленным штаммом Rauwolfia serpentina, знание белкового обмена этого штамма может оказать весьма существенную помощь при дальнейших селекционных работах. Кроме того культура ткани Rauwolfia serpentina может быть использована в качестве источника для получения пероксидазы.

Структура и объем диссертации

Работа изложена па 111 страницах машинописи, содержит 19 таблиц и 24 рисунка. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя наименований.