Биотехнология бактериальной целлюлозы с использованием штамма — продуцента Gluconacetobacter hansenii GH — 1/2008

Целлюлоза — природный полимер — синтезируется не только растениями, но и грибами, водорослями и бактериями. В структурах клеток бактерий она очень редко встречается, а является основным компонентом клеточных стенок растений и содержится в древесине, оболочках семян. Макромолекулы целлюлозы построены из элементарных звеньев D-глюкозы, соединённых 1,4-р-гликозидными связями в линейные неразветвлённые цепи. Полимерные цепи клетчатки соединены в более крупные структурымикрофибриллы. Длина полимерных цепей у целлюлозы различается и зависит от природы продуцентов. Особого внимания заслуживает бактериальная целлюлоза, отличающаяся рядом уникальных свойств, благодаря которым она уже используется в различных отраслях народного хозяйства в мировой практике.

В пищевой промышленности бактериальная целлюлоза уже широко используется в виде порошка как общепринятая безопасная добавка (GRASGenerally Regarded As Safe) — пищевой ингредиент. Добавление небольшого количества бактериальной целлюлозы в продукты придает хорошую стабильность дисперсии и суспензии, а также при употреблении продукта, благодаря хорошему сохранению формы, короткое ощущение наполненности во рту [1]. Однако возможности использования свойств бактериальной целлюлозы еще не исчерпаны.

В последние годы были выделены продуценты внеклеточной бактериальной целлюлозы, большинство из которых относятся к семейству Acetobacteriaceae. Бактерии этого семейства синтезируют внеклеточную целлюлозу, что позволяет легко её отделять от клеток и использовать в различных направлениях. В семействе Acetobacteraceae особого внимания заслуживают продуценты рода Gluconacetobacter: Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter hansenii, Gluconacetobacter kombuchae, Gluconacetobacter intermedius и др.

Многие авторы рекомендуют для промышленного получения бактериальной целлюлозы штаммы вида аисопасеЮЬаМег хуИпт [2, 41]. Характеристика морфолого-культуральных свойств, биохимия и генетики, условий культивирования продуцентов этого вида достаточно хорошо изучены. Разработан состав питательных сред для их культивирования. Однако сведений по исследованию и использованию штаммов других видов рода аисопасе^ЬаЫег, как продуцентов бактериальной целлюлозы, в мировой литературе мало, а в России такие данные отсутствуют. Кроме этого, в мировой литературе мало информации о виде С1исопасе (оЬа&ег катепи, штаммы которого синтезируют не только бактериальную целлюлозу, но и олигомер глюкуроновой кислоты.

С развитием науки, такие штаммы будут играть очень важную роль в развитии различных современных отраслей, в получении новых полимеров для применения в том числе и в нанотехнологии и для создания новых материалов.

Бактериальная целлюлоза, синтезируемая штаммами вида & катепи, не изучена по химическому составу, структуре связей и типу целлюлозы, физико-химическим свойствам. Свойства бактериальной целлюлозы, синтезируемой представителями различных видов, могут отличаться, поэтому их исследование у продуцентов необходимы для оценки возможности их использования в практике.

Цель работы: выделение продуцента бактериальной целлюлозы 01исопасе1оЪас1ег Иатепи и исследование закономерностей его роста при культивированииисследование свойств бактериальной целлюлозы и оценка возможности её использования.

В задачи исследований диссертационной работы входило: выделение нового штамма С1исопасеюЬас (ег ярр.: ^ изучение его микро и макроморфологических, физиологических, культуральных свойств, проведение молекулярно-генетической идентификацииизучение продуктивности бактериальной целлюлозы у штамма аисопасе^Ьа^ег катепи в поверхностных и глубинных условиях культивир ованияразработка оптимальных условий для роста и биосинтеза полимера бактериальной целлюлозы штамма С1исопасе1оЪас1ег катепп ОН-1/2008 в поверхностных и глубинных условиях культивирования- ^ изучение влияния концентрации растворенного кислорода и этанола на биосинтез бактериальной целлюлозы в условиях поверхностного культивирования продуцента аисопасе^Ьа^ег катету, ^ исследование наноструктуры, биохимического состава и физико-химических свойств пленок бактериальной целлюлозы, полученных при культивировании штамма в поверхностных условиях- ^ разработка способа получения порошка бактериальной целлюлозы. ^ оценка возможности использования бактериальной целлюлозы как пищевой добавки в технологии вареных колбас- ^ исследование способности пленок бактериальной целлюлозы адсорбировать антимикробные соединения — антибиотики и нано серебро, и оценка их антимикробных свойств.

Научная новизна работы.

Методом многоступенчатого скрининга выделен новый продуцент бактериальной целлюлозы ОН-1/2008. На основании исследований микроморфологических, культуральных, физиологических свойств и молекулярно-генетического анализа установлена его принадлежность к виду Ыисопасе1оЬас1ег катепи.

При исследовании твёрдотельных спектров методом ядерного магнитного резонанса КП ВМУ 13С впервые показано, что полимер, синтезируемой продуцентом 01исопасе1оЪас1ег катепи, содержит в основном целлюлозу 1а и значительно меньше 10. В основной цепи молекулы мономер в полимере имеет (3−1,4 связь. Нативный полимер содержит 97% влаги, 2,85% целлюлозы, белка, липидов и нуклеиновых кислот — 0,15%. 6.

Методом атомно-силовой микроскопии показано, что бактериальная целлюлоза, синтезируемая штаммом С1исопасе^Ьас1ег казепи, имеет сеть микробрилл с диаметром от 15−20 нм и макрофибрилл с диаметром 50 — 100 нм, и длиной от 1 — 9 цм, высокую степень кристалличности, которая обеспечивает её влагоудерживающую способность, эластичность и прочность.

Показано, что при поверхностном культивировании в оптимальных условиях (рН и состав среды) продуктивность бактериальной целлюлозы штамма вН-1/2008 составляет 28,8 г/л, что превышает этот показатель у других штаммов С1исопасе1оЬа^ег Иатепп, синтезирующих целлюлозу.

Установлено, что количество растворенного кислорода в питательной среде от 1,5 до 3,0 мг/л является оптимальным для роста и инициации биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммом & катепп ОН-1/2008.

Практическая значимость работы.

Выделенный штамм 01исопасе1оЪас1ег катепп вН-1/2008 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов с коллекционным номером ВКПМ В-10 547 как продуцент для получения бактериальной целлюлозы в промышленных масштабах.

Подобрана оптимальная питательная среда для культивирования штамма 01исопасе1оЬас1ег катепп вН-1/2008 следующего состава, %: сахарозы — 7, густого кокосового молока — 0,1, дрожжевого экстракта — 0,5, № 2НР04 — 0,27, К2НР04 — 0,2, (МН4)2804 — 0,3, моногидрата лимонной кислоты — 0,115, спирта — 0,5, рН = 4,0.

Экспресс-метод оценки количества растворенного кислорода может быть использован для разработки состава питательной среды для биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммами аисопасе^Ьааег каьепи.

Разработан способ получения порошка бактериальной целлюлозы с хорошими технологическими и функциональными свойствами. Наработаны партии препарата бактериальной целлюлозы и проведены испытания её в технологии продукта вареной колбасы, которые показали преимущество 7 использования бактериальной целлюлозы в сравнении с растительной целлюлозой.

Доказано, что пленки бактериальной целлюлозы & катепп ОН-1/2008 с абсорбированными антибиотиками и наносеребром обладают антимикробными свойствами и могут быть рекомендованы для разработки покровных материалов для лечения раневых инфекций.

Апробация работы.

Основные положения работы и результаты исследований представлены на конкурсах и конференциях: 10-ой юбилейной Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ (Москва, 2010) — V фестивале науки (Москва, 2010) — конкурсе молодых ученых VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011) — X Международной научно-практической конференции с международным участием «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012) — IX международной научнопрактической конференции «Технологии и продукты здорового питания, Москва, 2012, II Международной научно-практической Интернетконференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы». Казань, 2013.

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов: АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009;2010 годы)" — проектов № 4209 и № 9353 «Коллекция культур бактерий, бактериофагов, дрожжевых и мицелиальных грибов как база образовательного процесса, сохранения биоразнообразия и создания новых биотехнологий" — госконтракта П175 в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009;2013 гггранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школтема № 16.120.11.3245.-НШ.

выводы.

1. В результате многоступенчатого скрининга выделен новый штамм GH-1/2008, способный к синтезу полимера на различных источниках углерода. На основании исследований микро-морфологических, культуральных, физиологических свойств и молекулярно-генетического анализа установлена принадлежность штамма к виду Gluconacetobacter hansenii.

2. Методом CP/MAS 13С ЯМР установлено, что полимер, синтезируемый продуцентом Gluconacetobacter hansenii, содержит в большем количестве целлюлозу типа 1а, чем целлюлозу 1(3. В основной цепи молекулы мономерглюкоза — в полимере имеет [3−1,4 связь. Пленки бактериальной целлюлозы, синтезируемые штаммом Gluconacetobacter hasenii, имеют прочную сеть микрои макрофибрилл с диаметром поперечного сечения в пределах 15−20 нм и 50−100 нм, длиной макрофибрилл около 1−9 цм. Показатели прочности пленки бактериальной целлюлозы сопоставимы гидроцеллюлозной пленкой.

Пленки бактериальной целлюлозы имеют хорошую влагоудерживающую способность, которая при влагосодержании до 30% повышает её эластичность (удлинение), что имеет значение при использовании её в качестве покрытия пищевых продуктов и создании медицинских перевязочных и других материалов.

3. Проведена оптимизация условий поверхностного и глубинного культивирования штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, при которых продуктивность бактериальной целлюлозы превышает показатель в сравнении с другими штаммами Gluconacetobacter hansenii. Максимальный выход целевого продукта бактериальной целлюлозы 28,78 г/л достигается в условиях поверхностного культивирования при температуре 30 °C на оптимизированной среде. В глубинных условиях культивировании продуцента продуктивность полимера ниже, чем в поверхностных и составляет не более 8,83 г/л.

4. Пленки бактериальной целлюлозы, полученные в условиях поверхностного культивирования штамма & казепи ОН-1/2008 содержат 97% влаги, 2,85% целлюлозы, белка, липидов и нуклеиновых кислот не более 0.15%.

5. Инициация биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммом & кавепи вН-1/2008 зависит от количества растворенного кислорода в питательной среде, источника углерода и этанола. Концентрация растворенного кислорода в среде менее 0,5 мг/л, ингибирует рост штамма, а в количестве от 1,5 до 3 мг/л инициирует синтез полимера.

6. При поверхностном культивировании штамм синтезирует пленки двух типов: прозрачные или непрозрачные, что определяется составом питательной среды.

7. Для получения порошка бактериальной целлюлозы необходимо измельчение до однородной массы, удаление иммобилизованных клеток, прессование до состояния тонкого листа, сушка и дальнейшее измельчение до размеров порошка. Использование бактериальной целлюлозы в количестве 1,0% улучшает органолептические свойства и структуру мясопродукта вареной колбасы.

8. Пленки бактериальной целлюлозы хорошо абсорбируют антибиотики, наносеребро и пчелиный воск, при этом они обладают необходимыми свойствами для создания антимикробных покрытий в медицине, в том числе искусственной кожи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящее время бактериальная целлюлоза все больше привлекает внимание специалистов различных областей как уникальный природный материал. Благодаря сверх упорядоченной сетевой структуре с зонами кристалличности (высоко ориентированными участками), включающими отдельные аморфные (неориентированные) участки, бактериальная целлюлоза имеет большую механическую прочность. Диаметр фибрилл бактериальной целлюлозы составляет 72−175 нм (Bohn и др., 2000) или 70 130 нм (Jonas и Farah, 1998; Yamanaka и др., 2000). Поскольку бактериальная целлюлоза состоит из нано размерных волокон, и структура нановолокон определяет её свойства, поэтому её описывают как наноцеллюлозу (Klemm и др., 2006).

По своим свойствам бактериальная целлюлоза отличается от растительной, так как в своем составе не содержит лигнина, гемицеллюлзы, пектина и восков. Степень полимеризации бактериальной целлюлозы составляет 2000;6000, тогда как растительной — 13 000−14 000 остатков глюкозы. Бактериальная целлюлоза имеет высокую способность к абсорбции воды, химическую стабильность, высокую механическую прочность (когда полимер влажный), сохраняет превосходную форму. Кроме этого, бактериальная целлюлоза нетоксичная, является биоразлагаемым полимером, инертным для метаболизма человека (Bielecki, 2005).

Все эти положительные свойства бактериальной целлюлозы позволили получить уже широкое её применение в ряде отраслей народного хозяйства в мировой практике. Чаше всего бактериальная целлюлоза используется как альтернатива растительной целлюлозе, однако новые области применения её ещё не исчерпаны.

Согласно сведений о штаммах-продуцентах, бактериальную целлюлозу способно синтезировать небольшое число прокариот как внеклеточный полимер, выполняющий для них в основном функцию иммобилизации клеток в его матриксе. Это представители родов Acetobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Sarcina, Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Aerobacter, Azotobacter, Zooglea (Kunihiko Watanabe, 2004), Gluconacetobacter. kombuchae, G. intermedius, G. swingsii, G. rhaeticus, G. nataicola (Debasree Dutta, 2007), G. oboediens, G. europaeus, G. hansenii, G. entanii (Franco Dellaglio, 2005) и цианобактерии (Brown, 2008).

До настоящего времени наибольшее внимание для практического использования привлекает к себе вид А. xylinum, который в 1998 г. был реклассифицирован как вид Gluconacetobacter xylinus. Анализ результатов, полученных рядом авторов, показал, что вид G. hansenii, синтезирующий бактериальную целлюлозу, способен синтезировать еще и другой олигомер глюкуроновой кислоты, на что указали авторы Joong Kon Part и Taous Khan, (2006). Однако, сведения об использовании этого вида малочисленны. В России имеются немногочисленные исследования, посвященные получению бактериальной целлюлозы с использованием штаммов А. xylinum (Хрипунов, Ткаченко, 1999). Кроме того, в России до сих пор не налажено производство бактериальной целлюлозы, а в коллекциях отсутствуют штаммы-продуценты бля получения бактериальной целлюлозы в промышленных масштабах.

Это обстоятельство послужило основанием для предпринятого исследования, в задачи которого входило выделение и идентификация продуцента, оценка его продуктивности, проведение оптимизации условий для получения полимера, исследование биохимического состава и свойств бактериальной целлюлозы и разработка технологической схемы её получения в поверхностных и глубинных условиях культивирования.

В период с 2006 по 2008 гг. методом многоступенчатого скрининга из культуры «чайного кваса» был выделен штамм GH-1/2008, который синтезировал внеклеточный полимер на полужидких и жидких селективных для уксуснокислых бактерий питательных средах. Исследования микроморфологических и культуральных свойств показали высокое сходство.

122 штамма с представителями рода Gluconacetobacter. Для подтверждения видовой принадлежности штамм был исследован молекулярно-генетическими методами, показавшими его сходство с видом G. hansenii на 99%. Таким образом, этот штамм был использован как объект для дальнейших исследований его в качестве продуцента бактериальной целлюлозы.

На наш взгляд, важным аспектом является исследование у штамма культуральных особенности в различных условиях культивирования. Оценка продуктивности штамма позволяет дать объективную оценку возможности их использования в биотехнологии как продуцента бактериальной целлюлозы. С этой целью была изучена продуктивность бактериальной целлюлозы при культивировании в условиях поверхностного культиврования штамма на рекомендованных авторами S. Hestrin и М. Schramm (1985) и разработанных нами 12 питательных средах.

Согласно полученным данным, было установлено, что штамм растет на различных источниках углерода, при этом продуктивность целлюлозы была наибольшей на разработанной нами среде Н5−2. Продуктивность биосинтеза полимера штамма GH-1/2008 сравнивали с таковой у типового штамма G. hansenii (ВКПМ В-11 239), которая была ниже на всех средах в 2−5 раз.

Для дальнейших исследований для культивирования продуцента бактериальной целлюлозы целесообразно было использовать среду Н5−2.

Следующий этап исследований был посвящен оптимизации состава питательной среды и условий поверхностного и глубинного культивирования штамма. При оптимизации по показателю продуктивности бактериальной целлюлозы штамма в поверхностных условиях культивирования в качестве факторов варьирования использовали: концентрацию кокосового молока, концентрацию спирта, рН среды, концентрацию сахарозы и температуру. Для оптимизации показателя продуктивности штамма в глубинных условиях культивирования в качестве факторов варьирования использовали: концентрацию кокосового молока, концентрацию спирта, рН среды, концентрацию сахарозы и число оборотов в минуту.

В результате оптимизации показано, что в условиях поверхностного культивирования продуктивность биомассы полимера выше (13,5 г/л), чем в условиях глубинного (8,83 г/л, рисунок 5), в связи с чем, для получения максимальной массы полимера штамм целесообразно культивировать в поверхностных условиях. На следующем этапе оптимизации, проведенном по плану Уилсона-Бокса, продуктивность штамма G. hansenii GH-1/2008 на 7 сут в условиях поверхностного культивирования была увеличена до 28,78 г/л на среде, содержащей, %: сахароза — 7, кокосовое молоко — 0,1, дрожжевой экстракт — 0,5, Na2HP04 — 0,27, К2НР04 — 0,2, (NH4)2S04 — 0,3, моногидрат лимонной кислоты — 0,115, спирта — 0,5, рН = 4,0.

Учитывая, что продуцент бактериальной целлюлозы G. hansenii GH-1/2008 является облигатным аэробом, то концентрация растворенного кислорода в питательной среде является очень важным фактором, влияющим на биосинтез целлюлозы. Основываясь на концепции авторов R.E. Cannon (1989), J.W. Cosieron (1999) и W.S. Wiliams (1989), что в культурах продуцентов бактериальной целлюлозы одновременно существуют две популяции клеток: целлюлозоположительные (Се11+) и целлюлозоотрицательные (Cell-), подбирали среды с различным начальным количеством растворенного кислорода, для того, чтобы индуцировать биосинтез полимера у целлюлозоположительных клеток и элиминировать целлюлозонегативные клетки на начальных этапах культивирования.

Для такой цели штамм G. hansenii GH-1/2008 культивировали на шести питательных средах, в которых была различная начальная растворимость кислорода. В результате проведенных исследований было показано, что при концентрации растворенного кислорода ниже критической для данной культуры, рост тормозится, т. е. кислород становится лимитирующим фактором. Это означает, что в системе с критической концентрацией растворенного кислорода, но с более подходящим для метаболизма.

124 источником углерода происходит индукция синтеза целлюлозы тогда, когда рост активно начинается в первые часы. Количество растворенного кислорода для С. Натепи ОН-1/2008 является фактором, инициирующим биосинтез полимера, при этом критическое количество растворенного кислорода в среде должно составлять не менее 2,5 и не более 3,0 мг/л. Контроль концентрации растворенного кислорода в среде может быть использован для оценки продуктивности бактериальной целлюлозы штаммами на различных питательных средах и в различных условиях культивирования.

В результате исследований было показано, что добавление этанола в среду увеличивает продуктивность бактериальной целлюлозы штаммом, оказывая ингибирующее действие на рост целлюлозонегативных клеток, которые не синтезируют целлюлозу, но потребляют субстрат и кислород. Использование этанола в среде в количестве не более 0,5% также целесообразно для элиминации целлюлозонегативных клеток в культуре.

В результате исследований было показано, что при культивировании штамма в поверхностных условиях бактериальная целлюлоза синтезируется в виде пленок различной прозрачности, а в глубинных условиях — в виде глобул. Продуктивность бактериальной целлюлозы зависит от состава питательной среды и количества растворенного кислорода. При этом ведущими факторами являются концентрация сахарозы и кислорода.

Исследован биохимический состав пленок, тип связи, наноструктура и прочность пленок. Полученные результаты позволяют утверждать, что бактериальная целлюлоза, синтезируемая продуцентом (г. капяепи ОН-1/2008 идентична синтезируемой штаммом А. хуИпит, описанной в работе автора Ннгоуикл Копо и др. (2002; 2003), является в основном целлюлозой 1а-типа, а [3-тип целлюлозы составляет не более 30−35%.

На основании результатов оценки прочности и адсорбционных свойств целесообразно рекомендовать получение полимера в виде пленок при культивировании штамма в поверхностных условиях. Биотехнология.

125 Б.

Рисунок 40 — Технологическая схема биотехнологии бактериальной целлюлозы в условиях поверхностного (А) и глубинного (Б) культивирования.

Очищенный воздух А.

1- исходная культура продуцента (х ИатепИ ОН-1/2008 в пробирках- 2- культура в колбе- 3 — культура в банке Протодьяконова- 4- емкость для подогрева воды- 5 — стерилизатор- 6- емкость для хранения сухих питательных сред- 7 — дозатор- 8- бикс с питательной средой- 9 -автоклав- 10 — бикс со стерильной средой- 11 — стеганная ватно-марлевая салфетка- 12 — крышка для кюветы- 13 — кювета на загрузке- 14 -стол- 15 — загруженная кювета- 16-камера- 17-стеллажи- 18-сброс воздуха из калорифера в атмосферу- 19 — фильтры для воздуха- 20-вентилятор- 21 — калорифер- 22 — отбойники- 23 — ручной манипулятор для разгрузки кювет- 24 — сырая пленка бактериальной целлюлозы- 25 — стерильный флакон или пакет- 26 — грязная кювета- 27 — ванны для мойки кювет- 28 — подсушка кювет- 29 — шкаф для стерилизации кювет- 30 — стерильная кювета- 31 — холодная комната- 32 — емкость для стерилизация и охлаждения воды- 33 — емкость для вещества, используемые для нейтрализации- 34 — дозатор- 35 — емкость для промывания и стерилизации- 36 — насосБ.

1,2- дозатор- 3,4- емкости для приготовления питательной среды- 5 — стерилизатор- 6 — исходная культура продуцента бактериальной целлюлозы- 7-теплообменник- 8-инкубатор- 9-ферментер- 10 — компрессорная установка с фильтрами- 11, 13 — сепараторы — 12-емкости для нейтрализации- 14 — сборник ЖК и избыток воды- 15 — распылительная сушилка.

Рисунок 41 — Принципиальная технологическая схема поверхностного культивирования, А (по И. М. Грачевой, 2000) и глубинного культивирования Б.

Описание технологической схемы получения препарата на основе штамма аисопасеЮЪаМег катепи ОН-1/2008 при поверхностном культивировании.

Исходную культуру продуцента О. Натепи ОН-1/2008 на жидкой питательной среде, содержащей, %: сахарозы — 7, кокосового молока — 0,1, дрожжевого экстракта — 0,5, Ка2НР04 — 0,27, К2НР04 — 0,2, (Ш4)2804 — 0,3, моногидрата лимонной кислоты — 0,115, спирта — 0,5, рН = 4,0 пересевают для обновления в пробирки, затем в колбы вместимостью 0,75 — 1л, содержащие 0,25 — 0,5л питательной среды. Пробирки и колбы помещают в термостат и продуцент культивируют при 28 ± 2 °C до появления на поверхности пленок с толщиной 2−3см. Подготовленный в колбах в достаточном количестве посевной материал используют для засева питательной среды, которую предварительно стерилизуют в биксах при 119 °C в течение 30 мин. Спирт и уксусную кислоту для регулирования рН добавляют после стерилизации.

Засеянная среда в соотношении 1:10 наливается в стерильные прямоугольные кюветы, которые выполняются из оцинкованного неперфорированного железа и снабжены крышками, имеющими два отверстия, закрывающиеся ватно-марлевыми салфетками. В каждую кювету наливают 1л засеянной среды. Закрытые кюветы со средой помещают в специальные растильные камеры для культивирования на стеллажи или этажерки. В камере поддерживают определенную влажность (80%) и температурный режим (28 ± 2 °С) оптимальные для роста штамма и синтеза бактериальной целлюлозы. Воздухообмен в такой камере осуществляют в о о диапазоне 1−2,5 м / (м .ч).

Полученные пленки снимают с кювет после 7 — 10 суток культивирования при помощи ручного манипулятора и во влажном состоянии помещают в стерильные пакеты, которые помещают на хранение в камере с температурой не выше 4 °C до окончания его микробиологической и биохимической проверки. Длительность хранения пленок не должна.

130 превышать 5−6 суток. Пленки не должны содержать посторонней микрофлоры.

Если пленки удовлетворяют всем требованиям, их хранят в холодном помещении в отделение обработки. Плёнки нейтрализуют 0.5Н ИаОН и отмывают холодной водой в специальной ёмкости, затем стерилизуют при 137 °C в течение 4 с и упаковывают. Срок хранения препаратов пленок не более 12 месяцев.

Описание технологической схемы получения препарата поверхностным культивированием.

Технологическая схема получения мицелия методом глубинного культивирвования в ферментере с аэрацией среды стерильным воздухом показана на рисунке 416 .

Сухие питательные вещества приготовленной среды, содержащей %: сахарозы — 7, густого кокосового молока — 0,2, дрожжевого экстракта — 0,5, Ыа2НР04 — 0,27, К2НР04 — 0,2, (МН4)2804 — 0,3, моногидрата лимонной кислоты — 0,115 поступают в емкости 3 и 4 для приготовления среды, затем полученная среда поступает на стерилизацию паром в стерилизатор 5. После охлаждения на теплообменниках 7 подается в инкубатор 8. Спирт (0,5%) и уксусную кислоту добавяют в инкубатор вместе с посевным материалом. Температура среды в инкубаторе не должна превышать (28±1) °С.

Посевной материал доставляется из лаборатории 6. Активация и масштабирование посевного материала ведется в инокуляторе 8 в течении 14 суток. После масштабирования инокулят поступает в ферментер 9, куда подается среда и стерильный воздух для аэрации с компрессорной установки 10 (концентрация растворенного кислорода контролируется в диапазоне 1,5 -3,0 мг/л). Контроль доступного воздуха в ферментер проводят путем измерения концентрации растворенного кислорода, а питательной среде. Воздух поступает в ферментер, когда концентрация растворенного кислорода в питательной среде снижается до 1,5 мг/л и контролируется до достижения растворенного кислорода в среде не более 3 мг/л.

Ферментер снабжен рубашкой для обогрева, поддерживающей постоянную температуру ферментации. Процесс культивирования идет в течении 7−10 суток. После достижения стационарной фазы роста культуры, культуральная жидкость выводится из нижней части ферментера и поступает в сепаратор для удаления культуралной жидкости. Суспензия концентрируется до содержания батериальной целлюлозы 9−10 г/л, из нижней части сепаратора выходит отработанная культуральная жидкость и поступает в бак для ее сбора 14.

Из сепаратора концентрированная суспензия поступает в емкость 12 для нейтрализации и отмывки клеток. Полученная жидкость с бактериальной целлюлозы поступают на 2-ой сепаратор ступени 13, после центрифуги, полученная суспензия бактериальной целлюлозы подается на распылительную сушку 15. При распылительной сушке происходит испарение воды из высушиваемой бактериальной целлюлозы, в результате получают сухой порошкообразный или гранулированный продукт. Сушку проводят воздухом, нагретым до температуры не более (85±5) °С. Аппарат так же имеет систему отвода воздуха и выгрузки готового продукта.

Затем полученный препарат поступает на упаковку и хранение. Упакованный препарат хранится в сухом виде, без прямого попадания солнечных лучей помещении при комнатной температуре. Срок хранения препарата не более 6 месяцев.