Гипотензивное и кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа как физиологических доноров оксида азота

На протяжении десятилетий исследования свойств оксида азота (N0) показано, что это низкомолекулярное нестабильное соединение играет роль важного регулятора многих метаболических и физиологических процессов в организме. Выяснение биофизических и биохимических аспектов действия этого соединения является до сих пор актуальной и недостаточно исследованной проблемой.

Одним из важнейших вопросов остается роль N0 в работе и регуляции сердечно-сосудистой системы. Имеются многочисленные данные о проявлении вазодилататорной активности путем регуляции тонуса сосудов, а также уменьшения последствий ишемии органов и тканей, перехвата супероксидных радикалов, появляющихся во время реперфузии при насыщении ткани миокарда кислородом после продолжительного нарушения кровоснабжения.

Механизмы образования N0 (как ферментативные, так и неферментативные) в условиях нарушения и восстановления кровоснабжения органов активно исследуются в настоящее время. Кроме того, хорошо известно действие N0 на митохондриальную дыхательную цепь и на стенки сосудов. Имеются многочисленные доказательства дихотомического действия N0 при его различном содержании в ткани. В последнее время считается, что такие факторы, как продолжительность действия гипоксии, определяют — снижаются ли последствия ишемии после восстановления кровотока или произойдет стимуляция окислительного стресса.

В клинической практике дня лечения различных патологий сердечко-сосудистой системы используют препараты на основе доноров N0, которые быстро разлагаются в организме с выделением N0. В частности, к таким препаратам относятся широко известные лекарственные средства на основе органических нитратов, например, нитроглицерин и его аналоги. Однако в большинстве случаев при длительном использовании развивается привыкание и, как следствие, толерантность к определенной дозе, а вынужденное повышение дозы вводимого препарата может приводить к неблагоприятным последствиям.

Одновременно с тпироким использованием нитроглицерина в настоящее время изучаются свойства и возможности применения в клинической практике также других препаратов — доноров N0. К таким соединениям относятся динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с различными лигандами (цистеин, глутатион, тиосульфат). Эти соединения с тиол-содержащими лигандами, характеризующиеся в растворе ионнои формой {(К^РелЫО'Ы, могут формироваться в организме по Ь-аргинин-зависимому пути и накапливаться в клетках. Наряду с другой формой эндогенных соединений N0 — Б-нитрозотиолами — ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами обеспечивают защиту N0 в организме животных и человека от деструктивного действия на них анионов супероксида. Эта защита обеспечивает депонирование N0, а также его внутрии межклеточный транспорт в организме. Вместе с тем, ДНКЖ как доноры N0 способны воздействовать на разнообразные физиологические процессы, вызывая гипотензию, расслабление кровеносных сосудов, подавление тромбообразования и т. д. Кроме того, эти комплексы способны сказывать антиоксидантное действие, нейтрализуя токсичные вторичные продукты перекисного окисления липидов. В результате спонтанного или индуцированного распада ДНКЖ в организме происходит высвобождение N0, ионов двухвалентного железа и 8-нитрозотиолов. Однако остается неясной реакция организма на экзогенное введение ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами при нормальном кровоснабжении и его региональных нарушениях.

Эффективное терапевтическое действие таких соединений связано с их вызодилататорным и антиоксидантным эффектами, а также со способностью являться пролонгированным источником ионов железа. Комплексное исследование действия таких препаратов как в модельных системах, так и в организме, а также изучение механизмов транспорта, депонирования и распределения комплексов в ткани органов проводятся в данной диссертационной работе.

Цель исследования.

Выяснение механизмов вазодилататорного и антиоксидантного эффектов разных форм ДНКЖ в организме млекопитающих в условиях естественного кровоснабжения, а также при региональной ишемии миокарда.

Задачи исследования.

1. Изучение содержания N0 в ткани органов (сердце, лёгкое, печень, почка) крыс в условиях естественного кровоснабжения и его изменения в результате введения ДНКЖ и других доноров N0. Оценка интегрального гипотензивного эффекта ДНКЖ и его сравнение с действием других доноров N0.

2. Исследование фармакокинетики ДНКЖ в кровотоке крыс в условиях естественного кровоснабжения, перехода этих комплексов с низкона высокомолекулярные лиганды (альбумин, гемоглобин), а также процессов их спонтанного или индуцированного распада.

3. Изучение антиоксидантного и кардиопротекторного действия ДНКЖ на модели региональной ишемии миокарда крысы в условиях да л7/г/. Исследование влияния этих комплексов на уровни N0 и АФК в разных зонах миокарда в условиях окислительного стресса. Оценка накопления связанных с белками ДНКЖ в интактной и ишемизированной зонах миокарда.

Научно-практическая значимость работы.

1″ В диссертационной работе получены новые данные о влиянии ДНКЖ на уровни N0 в ткани миокарда в условиях нормального кровоснабжения и при его нарушениях, что может быть использовано при создании на основе этого вещества лекарственных препаратов, обладающих гипотензивным и кардиопротекторным действием.

2. Проведено сравнительное исследование влияния ДНКЖ на уровни N0 в различных органах животного, что позволяет делать оценки влияния этого комплекса на содержание N0 в интерстиции сердца, печени и почки на основании неинвазивной регистрации N0 в выдыхаемом воздухе.

Научная новизна диссертации.

Е диссертационной работе впервые проведено комплексное исследование уровня N0 в интерстиции ткани органов (сердце, печень, почка) с помощью метода микродиализа, а также в лёгких крыс в условиях т.

2. Установлено, что базальные уровни свободного N0 в интерстиции ткани сердца, печени и почки между собой достоверно не различаются. Впервые показано, что введение ДНКЖ вызывает длительное увеличение уровня N0 в ткани органов (сердце, легкое, печень и почка), при этом, специфичность действия этого препарата, как донора N0, на эти органы не обнаружена. Похожий эффект увеличения содержания N0 в интерстиции ткани органов был показан также в результате инфузии препарата Изокет (Изосорбитдинитрат), но наиболее заметный рост был установлен для сердца животного.

3. На модели региональной ишемии миокарда впервые показано, что ДНКЖ эффективно накапливаются в зоне риска ткани миокарда, что, вероятнее всего, отражает дополнительное образование этих комплексов в зоне окклюзии. Установлено, что в условиях постишемической реперфузии происходит существенное увеличение скорости распада связанных с белками ДНКЖ в миокарде в результате эффективного перехвата этими комплексами короткоживущих кислородных радикалов.

4. Впервые показано, что введение ДНКЖ в условиях региональной ишемии н реперфузии миокарда оказывает кардиопротекторное действие, подавляя гиперпродуцирование NO и высокотоксичных кислородных радикалов в окклюдируемой зоне.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на следующих конференциях: VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 25−26 октября 2006 г) — XV Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине., биологии, фармакологии и экологии», (Украина, Крым, Лгга-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2007 г) — 5-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск, 18−22 сентября 2007 г) — Vffih International Workshop on EPR (ESR) in biology and Medicine, (October 3−6, 2007, Krakow, Poland) — XVI Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая — 9 июня 2008 г) — 4-й Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», (Украина, Крым, Судак, 31 мая — 9 июня 2008 г) — Международной научной конференции и восьмом съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25−27 июня 2008 г) — 19th European Meeting on Hypertension (Milan, Italy, June 12−16,2009) — 6th National Scientific Practical Conference with International Participation «Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and human health» (Smolensk, September 14−18, 2009) — 5-ой Международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 21−30 сентября 2009 г.) — 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, June 18−21, 2010) — in Евразийское Конгрессе по Медицинской Физике и Инженерии «Медицинская физика-2010» (Москва, 21−26 июня 2010 г.) — 2nd International Conference RAHMS «Recent advances in health and medical sciences» (Paphos, Cyprus, 8−12 July, 2010).

выводы.

1. После внутривенного введения динитрозильных комплексов железа с низкомолекулярными лигандами происходит быстрый перенос Ре (Ж))г групп на белковые лиганды в крови и ткани органов. Последующий медленный распад этих комплексов происходит с выделением оксида азота, приводящего к появлению длительного гипотензивного эффекта.

2. Установлено, что базальные уровни свободного оксида азота в интерстиции ткани сердца, печени и почек между собой не различаются.

3.

Введение

динитрозильных комплексов железа вызывает длительное увеличение уровня N0 в ткани органов (сердца, легких, печени и почек). При этом специфичность действия препарата, как донора N0, на эти органы не проявляется.

4. На модели региональной ишемии миокарда показано, что ДНКЖ эффективно накапливаются в зоне риска. Это, вероятнее всего, отражает дополнительное образование этих комплексов в зоне окклюзии.

5. При реперфузии зоны окклюзии происходит существенное увеличение скорости распада динитрозильных комплексов железа в миокарде. Это может свидетельствовать об эффективном перехвате данными комплексами активных форм кислорода.

6. Установлено, что в результате введения динитрозильных комплексов железа происходит подавление вызванных ишемией гиперпродукции оксида азота и активных форм кислорода в окклюдируемой зоне.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА.

Статьи.

1. Тимошин А. А., Цкитишвили О. В., Дроботова Д. Ю., Студнева И. М., Серебрякова Л. И., Рууге Э. К., Писаренко О. И. Взаимосвязь образования оксида азота с повреждениями кардиомиоцитов при региональной ишемии и репер фузии сердца крысы. // Биофизика. 2008. — Т.53, № 4. — С. 679−683.

2. Timoshin А.А., Drobotova D.Yu., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Yanin A.F. Estimation of nitric oxide level in vivo by microdialysis with water-soluble iron-N-methyl-D-dithiocarbamate complexes as NO traps: A novel approach to nitric oxide spin trapping in animal tissues. //Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2008. — V. 19, No 4. — P. 338−344.

3. Тимошин A.A., Дроботова Д. Ю., Цкитишвили O.B., Серебрякова JI. EL, Писаренко О. И., Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Защитное действие динитрозильных комплексов железа с глутатионом в условиях региональной ишемии миокарда крыс: исследование методом микродиализа. // Доклады Академии Наук (Раздел «Биофизика»). 2010. -Т.432,№ 3.-С. 416−419.

4. АА. Тимопшн, О. И. Писаренко, О. В .Цкитишвили, Л. И. Серебрякова, И. М. Студнева, Д. Ю. Дроботова, Э. К. Рууге, А. Ф. Ванин Динитрозильные комплексы железа с глутатионом в ткани миокарда крысы в условиях регионального нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы. // Биофизика. 2010 — Т.55, № 6. -С. 1099−1107.

5. Тимошин А. А., Дроботова Д. Ю., Лакомкин В. Л., Рууге Э. К., Ванин АФ. Влияние экзогенных доноров на уровень оксида азота в органах животных in vivo: исследование методом микродиализа с использованием спиновых ловушек. // Сборник статей «Проблемы биологической физики» (Под ред. В.А.Твердислова). Издательство «УРСС», Москва. 2010. — С. 107 -124.

Тезисы докладов.

1. Тимошин A.A., Орлова Ц. Р., Дроботова Д. Ю., Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Изучение динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР. // Тезисы докладов VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2526 октября 2006 г). — С. 257 — 259.

2. Тимошин, А А, Орлова Ц. Р., Дроботова Д. Ю., Ванин А. Ф., Рууге Э. К. Содержание оксида азота в нормальных условиях и при региональной ишемии миокарда. // Материалы XV Международной конференции и дискуссионного научногоклуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая — 9 июня 2007 г). — С.401 — 403.

3. Тимошин A.A., Цкитишвили О. В., Дроботова ДЮ., Ванин А. Ф., Рууге Э. К. Исследование содержания оксида азота в ткани миокарда крысы в условиях региональной ишемии. // Сборник трудов 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (г. Смоленск, 18−22 сентября 2007 г.). — С. 189 -191.

4. Timoshin A.A., Drobotova D.Yu., Gubkina S.A., Vanin AF., Ruuge EJL Effect of NO donors and acute regional cardiac ischemia on NO level in rat organs: an EPR study. // Abstracts of Vllth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (October 3−6,2007, Krakow, Poland). — P.76.

5. Тимошин A.A., Дроботова Д. Ю., Губкина CA., Цкитишвили O.B., Серебрякова О. В., Лакомкин B. JL, Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Исследование динитрозильных комплексов железа в организме млекопитающих методом ЭПР. // Труды XVI Международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая — 9 июня 2008 г). — С.384 — 386.

6. Тимошин А. А., Дроботова Д. Ю., Губкина С. А., Орлова ДР., Цкитишвили О. В., Серебрякова Л. И., Лакомкин В. Л., Рууте Э. К., Ванин А. Ф. Динитрозильные комплексы железа — доноры NO и антиоксидангы в организме млекопитающих. // Тезисы докладов 4-й Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», (Украина, Крым, Судак, 31 мая — 9 июня 2008 г). С. 50.

7. Тимошин А. А., Дроботова Д. Ю., Губкина С. А., Орлова Ц. Р., Цкитишвили О. В., Серебрякова Л. И., Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Парамагнитные динитрозильные комплексы железа в организме млекопитающих. // Сборник статей Международной научной конференции и восьмого съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 25 — 27 июня 2008 г). — 4.2. — С. 143 — 145.

8. Timoshin А.А., Lakomkin V.L., Tskitishvili О.V., Serebiyakova L.I., Drobotova D.Yu., Vanin A.F. Hypotensive and cardioprotective actions of Dinitrosyl-Iron Complexes with thiol-containing ligands. // Abstracts of the 19th European Meeting on Hypertension (Milan, Italy, June 12−16,2009). — P. S295 — S296.

9. Timoshin A.A., Drobotova D.Yu., Tskitishvili O.V., Serebryakova L. L, Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Hypotensive and cardioprotective action of Dinitrosyl-Iron Complexes with thiol-containing ligands in animal organism. // Abstracts of the 6th National Scientific Practical Conference with International Participation «Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and human health» (Smolensk, September 14 — 18, 2009). -P.73 — 74.

10. Тимошин А. А., Дроботова Д. Ю., Цкитшпвили О .В., Серебрякова Л. И., Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии миокарда. // Тезисы докладов 5-й Международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 21 — 30 сентября 2009 г.). — С.62.

11. Timoshin A.A., Drobotova D.Yii., Lakomkin V.L., Tskitishvili O.V., Serebryakova L. L, Vanin A.F. Dinitrosyl-Iron Complexes as hypotensive and cardioprotective substances in mammalian organism. // Abstracts of the 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, June 18−21, 2010). / Journal of Hypertension. 2010 June. V.28 e-Supplement A. P. el96.

12. Тимошин A.A., Дроботова Д. Ю., Цкитшпвили О .В., Серебрякова Л. И., Рууге Э. К, Ванин А. Ф. Защитное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии и реперфузии миокарда крыс. Исследование методом ЭПР. // Материалы Ш Евразийского Конгресса по Медицинской Физике и Инженерии «Медицинская физика-2010» (Москва, 21 — 26 июня 2010 г.). — С. 365 — 367.

13. Дроботова Д. Ю., Тимошин А. А., Лакомкин В. Л., Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Динитрозильные комплексы железа, как природные физиологические формы оксида азота. Исследование методом ЭПР. // Материалы Ш Евразийского Конгресса по Медицинской Физике и Инженерии «Медицинская физика-2010» (Москва, 21—26 июня 2010 г.). — С. 229−230.

14. Timoshin А. А, Drobotova D.Yu., Tskitishvili O.V., Serebryakova L. L, Ruuge E.K., Vanin A.F. Cardioprotective action of Dinitrosyl-Iron Complexes with glutathione in mammalian organism. // Abstracts of 2nd International Conference RAHMS «Recent advances in health and medical sciences» (Paphos, Cyprus, 8−12 July, 2010). — P. 52.

15. Drobotova D. Yu, Timoshin A.A., Lakomkin V. L, Ruuge E. K-, Vanin A.F. Effect of DN1C injection on NO level in rat organs during native blood circulation. // Abstracts of 2nd International Conference RAH MS «Recent advances in health and medical sciences» (Paphos, Cyprus, 8−12 July, 2010). — P. 66.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

На основании полученных результатов представляется целесообразным оценить роль ДНКЖ, как природных форм депонирования N0 при различных физиологических состояниях организма.

Так, в условиях естественного кровоснабжения введение ДНКЖ приводит к увеличению уровня N0 в интерстиции ткани органов. Необходимо отметить, что степень увеличения уровня N0 в результате введения ДНКЖ была практически одинаковой для всех исследованных органов (сердце, лёгкое, печень, почка), что говорило в пользу того, что этот препарат, как донор N0, оказывает приблизительно одинаковое действие на эти органы. Величина эффекта увеличения содержания N0 в этих органах достаточно хорошо соответствовала данным, полученным ранее авторами работы (БегегЬепкоу е! а1., 2008) на основании анализа аддуктов N0 в моче животного с использованием спиновой ловушки Ре^-МГДг, не проникающей через клеточную мембрану. В то же время, при регистрации аналогичного эффекта ДНКЖ с помощью липофильной спиновой ловушки Ре2±ОЕТС2 был получен существенно больший эффект увеличения содержания аддукта в результате введения ДНКЖ (Лакомкин и др., 2009), что, вероятнее всего, говорит о том, что липофильная ловушка могла взаимодействовать в клетке не только с N0, но также с ДНКЖ. Таким образом, исходя из результатов оценки уровня N0 с помощью спиновых ловушек с применением трёх различных методик регистрации аддуктов, следует, что впервые использованная в диссертационной работе система регистрации N0 с помощью метода микродиализа — наиболее адекватная, позволяющая регистрировать именно уровень низкомолекулярного N0 в течении длительного времени при минимальном воздействии на организм. Кроме того, полученные в работе данные могут свидетельствовать о том, что в результате введения ДНКЖ эффект увеличения депонированных форм N0 существенно больше, чем рост свободного N0. Это означает, что после инъекции этого донора N0 происходит главным образом депонирование N0 в физиологических формах, позволяя избежать при этом токсичного действия на организм, вызванного гиперпродукцией свободного N0.

В другой части работы в результате исследования действия ДНКЖ в условиях регионального нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы, установлено, что ДНКЖ является уникальным природным соединением, способным оказывать защитное действие в условиях окислительного стресса, предохраняя ткань от избытка кислородных радикалов и N0. Кроме того, в условиях ишемии происходит эффективное накопление и/или образование новых ДНКЖ. Поэтому в результате таких процессов происходит увеличение содержания этих комплексов в зоне с нарушенным кровоснабжением, где они оказывают вазодилататорное и антиоксидантное действия, предохраняя ткань от повреждений, вызванных окислительным стрессом. Необходимо также отметить, что увеличение скорости распада этих комплексов во время реперфузии может являться маркёром генерации избытка активных форм кислорода и их перехватом молекулами ДНКЖ в данной области организм.

Полученные в работе данные позволяют рассматривать ДНКЖ, обладающие вазодилататорными и антиоксидантными свойствами, как эффективное средство для профилактики и лечения патологий, связанных с ишемическими нарушениями в организме.