Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На основании анализа эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным. Это связано, прежде всего, с существующей реальной возможностью завоза инфекции из эндемичных по холере стран. Уникальная вариабельность генома Vibrio cholerae позволяет говорить также о дальнейшей эволюции патогенности возбудителя, что способствует возникновению новых высоковирулентных штаммов, которые будут представлять особую опасность для человечества [91- 112- 129- 160- 168- 205- 235- 237- 223- 274- 276- 278- 291].

Кроме этого не исключается возможность эпидемического распространения холеры при биотерроризме. На основании критериев, использованных при отборе биологических агентов, V. cholerae относится к категории В — высокоприоритетных патогенов, которые должны быть учтены при стратегическом планировании готовности к вспышкам, вызванным биотеррористичесими актами [93].

Для своевременного предотвращения возникновения эпидемических вспышек холерой большое значение отводится проведению эпидемиологического надзора на всех этапах выявления заболевших, или подозрительных на заболевание, а также постоянному контролю за объектами окружающей среды. Для прогнозирования эпидемического процесса важным является проведение мониторинга фенотипических и генотипических свойств выделяемых штаммов [7- 83- 92- 143- 173- 214- 224- 240].

Проведение противоэпидемических мероприятий во многом определяется своевременной диагностикой, соответственно, чувствительностью и специфичностью лабораторных методов исследования. Из-за неодинаковой информативности существующих методов и препаратов до настоящего времени остается проблемой определения эпидемической значимости холерных вибрионов.

За последние годы для диагностики холеры в практическое здравоохранение недостаточно активно внедряются высокочувствительные препараты и тест-системы с использованием новых технологий для выявления возбудителя холеры [69- 85- 152]. Исходя из вышеизложенного, актуальным и своевременным является совершенствование диагностики холеры, направленной на внедрение в практику новых специфичных и высокочувствительных препаратов и тест-систем [33- 54- 60- 81- 103- 126- 154].

В последние годы взамен традиционных пробирочных биохимических тестов широко применяются экономичные и чувствительные наборы микротестов разных конструкций, которые значительно облегчают и упрощают процесс дифференциации бактерий [101- 1]. В дополнение к традиционным методам определения биохимической активности микроорганизмов с помощью бумажных индикаторных систем (СИБ), сред Гисса и Меллера лабораторного приготовления, в филиале ФГУП «НПО Микроген» НПО «Питательные среды» в г. Махачкала разработаны микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) [99] .

С момента открытия д' Эреллем холерного бактериофага, фагодиагностика остается ценным специфическим тестом при идентификации холерных вибрионов. Поэтому разработка и усовершенствование препаратов фагодиагностики является важной задачей [5- 9- 24- 76- 93- 136- 163- 199- 203- 266- 285]. Одним из аспектов ее решения является совершенствование методов определения эпидемической значимости холерных вибрионов [8- 23- 51- 75- 77- 137- 158- 197- 226- 238- 287- 294]. В связи с этим специалистами ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработаны бактериофаги диагностические холерные эльтор с1х+ и с1х" жидкие для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных с1х+ и эпидемически неопасных с! х" холерных вибрионов биовара эльтор [136].

Для индикации штаммов, выделяемых из биологического материала и объектов окружающей среды, в последние годы широко используют молекулярно-генетические методы, основанные на выявлении генов, ответственных за синтез основных факторов патогенности, в том числе с помощью ПЦР [14- 28- 41- 79- 84- 126- 249].

ПЦР позволяет выявлять в выделенных штаммах V. cholerae генетические маркеры токсигенности и эпидемической значимости, прежде всего ctxA гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного энтеротоксина. Это дает возможность одновременно с индикацией холерных вибрионов определять их токсигенность [14- 42- 46- 94- 139- 157- 176- 225- 261- 281- 288- 295].

Важная роль в патогенезе холеры и появлении новых токсигенных штаммов принадлежит токсин-корегулируемым пилям адгезии, которые являются рецептором для нитевидного фага СТХф, детерминирующего продукцию холерного токсина [63- 155- 210- 211- 219- 242- 269- 297]. Показано, что наличие генов tcp кластера напрямую связано с эпидемической значимостью штаммов холерных вибрионов [221- 241]. Учитывая вышеизложенное для повышения информативности генной диагностики холеры специалисты ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров) разработали тест-систему, для выявления ДНК Vibrio cholerae основанную на одновременной амплификации двух генетических детерминант — ctxA и tcpA генов, отвечающих за синтез холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, соотвественно [139].

Таким образом, затронутые некоторые актуальные вопросы по совершенствованию лабораторной диагностики холеры, указывают на значимость проблемы для обеспечения эпидемиологического благополучия населения страны. В связи с этим дальнейшие исследования, направленные на изучение диагностической ценности новых препаратов для диагностики холеры с целью внедрения их практическое здравоохранение, несомненно, является своевременными.

Необходимым условием внедрения в практику здравоохранения новых медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) является проведение контролируемых испытаний, а для их выполнения наличие адекватных и стандартных методов контроля, а также требований к их качеству. К началу исследований методы оценки качества препаратов для диагностики холеры, являлись неизученными. Чтобы определить диагностическую ценность новых МИБП для выявления и идентификации возбудителя холеры необходимо было всесторонне изучить их с использованием унифицированных схем аттестации, включающих разработку и стандартизацию методов оценки их качества, выбор препаратов сравненияподбора необходимого количества микроорганизмов для определения специфической активности препаратовпровести стандартизацию и аттестацию методов контролясистему регистрации оценки результатов испытанийопределение области применения новых МИБП, уточнение Инструкций по применению, требований к качеству при их масштабированном выпуске [12- 16- 17- 103- 153].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ — оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Сравнительное изучение диагностической ценности новых микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У,) и ускоренного определения их групп по Хейбергу (МТС-Х).

2. Оценка эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор с1х+ и сХк" жидких, предназначенных для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx" холерных вибрионов биовара эльтор.

3. Изучение качества диагностической тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции в экспериментальных исследованиях.

4. Анализ результатов приемочных испытаний для определения диагностической ценности новых препаратов и решения вопроса о целесообразности их внедрения в практику здравоохранения, а также совершенствование контроля их качества и уточнение ФСП и Инструкций по их применению.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработаны научные принципы аттестации и оценки качества новых диагностических препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры в медицинских приемочных испытаниях с использованием препаратов сравнения аналогичного назначения. Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.

Впервые на представленном материале установлена диагностическая эффективность и обосновано внедрение в практику здравоохранения микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х). Новыми являются данные изучения биохимической активности большого набора музейных штаммов микроорганизмов V cholerae 01, V. cholerae не 01 и Vibrio других видов с помощью микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (MTC-Xj в сравнении с системами индикаторными бумажными, средами Гисса и Меллера лабораторного приготовления. Идентифицировано 12 видов вибрионов рода Vibrio и подтверждено соответствие их классификации по Берджи [18]. Разработана таблица идентификации по биохимической активности 12 видов рода Vibrio: V. cholerae OI и не 01, V parahaemolyticus, V. alginolyticus,.

V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V. furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae.

Впервые научно обоснованы принципы оценки диагностической эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор СТХ+ и СТХ" жидких для лабораторной практики. Предложена усовершенствованная схема определения эпидемической значимости вибрионов эльтор. Разработаны требования к методам контроля специфической активности и специфичности фагов и требования к контрольным штаммам.

Разработаны методы и критерии оценки качества новой тест-системы диагностической для выявления ДНК Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену ctxA+, ответственного за ведущий фактор вирулентности — токсинообразование и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA+, кодирующего основную субъединицу токсинкорегулируемых пилей адгезии. Показано, что тест-система обнаруживала V. cholerae (ctxA+ tcpA+) в дозе 1 -103 м.к. и 1Т04м.к. в пробе, то есть в 100−1000 раз была чувствительнее многих, используемых в лабораторной практике, сертифицированных диагностических препаратов.

Использованные нами в работе критерии качества испытуемой тест-системы позволили доказать возможность одновременного выявления возбудителя холеры, определения его эпидемической значимости и дифференцирования по биовару.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЯ. Работа имеет практическую направленность и посвящена усовершенствованию методов контроля, определяющих качество новых препаратов для диагностики холеры.

Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.

На основании проведенных исследований новые иммунобиологические препараты одобрены Комитетом МИБП и внедрены в практику здравоохранения:

1. Микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V), ФСП 42−0504−7631−06 и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) производства филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО «Питательные среды» в г. Махачкала, ФСП 42−0504−7632−06, протокол Комитета МИБП № 8 от 26.12.97 г.

2. Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов), ФСП 42−0020−2038;01, протокол Комитета МИБП № 7 от 05.07.00 г.;

3. Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae {ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции производства ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров), составлен проект ФСП, протокол Комитета МИБП № 7 от 19.12.02 г.

4. Усовершенствованные требования к основным показателям качества новых препаратов для диагностики холеры внесены в утвержденные нормативные документы (ФСП и Инструкции по применению).

По результатам проведенных испытаний в ФСП и Инструкцию по применению на микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) внесены изменения, касающиеся методики постановки реакции, дополнительно введены штаммы для контроля чувствительности, включена таблица биохимической характеристики 12 видов, относящихся к роду Vibrio-. V. cholerae OI и не OI, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae. Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) утвержден начальником Управления регистрации и обеспечения качества лекарственных средств ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ 23.10.2007 г.

В ФСП на Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие уточнены требования к «Специфической активности и специфичности» фагов и требования к штаммам для контроля. В Инструкцию по применению на бактериофаги — для более четкой оценки результатов в схему оценки эпидемиологической значимости вибрионов эльтор рекомендовано внести изменения в схему оцениваемых штаммов — помимо разделения на варианты, обобщить в группы. Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) утвержден директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 11.02.2008 г.

В проект ФСП на тест-систему для выявления ДНК Vibrio cholerae {ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции, внесены изменения, касающиеся определения ее специфической активности и специфичности. Определен порог чувствительности тест-системы для штаммов V cholerae (ctxA+) — в концентрации Г103 м.к./мл, для штаммов V. cholerae (tcpA+) — в концентрации 1−104 м.к./мл. Подобраны тест-штаммы, используемые для контроля чувствительности и специфичности препарата. Для повышения чувствительности тест-системы в течение срока годности рекомендовано разделение праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гена ctxA и гена tcpA. Акт внедрения рекомендаций в НД (проект ФСП и Инструкции по применению) утвержден начальником ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» 07.11.2007 г.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Внедрение в практику новых микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) позволит расширить диапазон идентификации видов рода Vibrio семейства Vibrionaceae.

2. Новые микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) имеют преимущества по экономической эффективности и простоте постановки перед средами Гисса и Меллера и системами индикаторными бумажными (СИБ).

3. Сравнительная оценка в приемочных испытаниях чувствительности, специфичности и воспроизводимости новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показала их преимущество перед монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ, 5 при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов.

4. Обоснована целесообразность внедрения в практику здравоохранения тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции, предназначенной одновременно выявлять возбудителя холеры и определять его эпидемическую значимость по наличию гена ctxA, ответственного за токсинообразование и по наличию гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин корегулируемых пилей адгезии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000 г., 2003 г.) — научных конференциях и Ученых Советах ГИСК им. Л. А. Тарасевича (Москва, 1999 г., 2000 г., 2003 г.) — Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства питательных сред в решении задач по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения России» (Оболенск, 1999) — Первой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000 г.) — VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003 г.) — Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004 г.).

Материалы диссертации вошли в научные отчеты по законченным медицинским приемочным испытаниям, которые были проведены в период с 1997 по 2003 годы. Результаты наших исследований были использованы при составлении и утверждении 6 нормативных документов.

ГТУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации отражены в 13 публикациях, в том числе в 2 — рекомендованных ВАК Российской Федерации научно-практических изданиях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 302 источника литературы, в том числе 184 отечественных и 118 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 2 рисунками.

выводы.

1. В лабораторных и полевых испытаниях по разработанным программам медицинских приемочных испытаний изучены и рекомендованы в практику здравоохранения 4 новых диагностических препарата, предназначенных для индикации и идентификации возбудителя холеры: микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-Y), микротестсистемы для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х), бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие, тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции.

2. В сравнительных испытаниях новых микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) показано, что по диагностической ценности они равноценны традиционным методам биохимического тестирования микроорганизмов, но имеют преимущества по скорости получения результатов и экономичности.

3. Изучение диагностической ценности микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) позволили расширить диапазон биохимической идентификации холерных вибрионов до 12 видов рода Vibrio: V. cholerae Ol и не Ol, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V anguillarum, V furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae.

4. Лабораторные и полевые исследования новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показало их высокую диагностическую эффективность при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов по сравнению с монофагами холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5.

5. По усовершенствованной схеме оценки эпидемической значимости V. cholerae eltor по чувствительности к бактериофагам ctx+ и ctx" и гемолитической активности отнесены 100% эпидемически опасных штаммов вибрионов эльтор. По чувствительности к монофагам ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности из числа эпидемически опасных правильно идентифицировано 65,5% штаммов. По результатам тестирования эпидемически неопасных штаммов V cholerae eltor (ctxA') испытуемые и коммерческие бактериофаги равноценны.

6. Доказано, что новая тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом ПЦР на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности генам ctx/V и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA+ позволяет одновременно выявлять биовар возбудителя холеры и определять его эпидзначимость. Определен порог чувствительности тест-системы для.

Ь Я штаммов V cholerae (ctxA) — в концентрации 110 м.к./мл, для штаммов V cholerae (tcpA+) — 1 -104 м.к./мл.

7. Впервые экспериментально обоснованы и введены в нормативные документы (ФСП, ЭПР, Инструкции по применению) стандартизованные и усовершенствованные методы контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Холера продолжает оставаться одной из актуальных социально-значимых опасных инфекций, единичные вспышки которой рассматриваются с возможностью эпидемического распространения [90- 128- 172- 186- 223- 229- 245- 262- 263- 275- 286- 291]. Прогноз по холере для России, в связи с продолжающимися масштабными эпидемиями в странах Африки и Азии, возможностью завозов инфекции, остается неблагоприятным [44- 112]. Имевшие место в последнее десятилетие вспышки холеры в Приморском крае (1999), Республике Татарстан (2001) и Ростовской области (2005) были завозного происхождения [116- 120- 127]. Также эпидемиологическая ситуация в России определяется ежегодным выделением холерных вибрионов, в том числе токсигенных, из водных объктов внешней среды [15- 93- 95- 117]. Все это диктует необходимость осуществления регламентированного объема мероприятий, предусмотренных системой эпидемиологического надзора при холере, обеспечения готовности медицинских учреждений специального назначения, в том числе микробиологических лабораторий для проведения исследований на холеру и индикации возбудителя [84- 92- 102- 169].

В соответствии с концепцией развития Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека приобретают особую значимость разработка и внедрение в практику Федеральной службы Роспотребнадзора современных методов и средств лабораторной диагностики, профилактики и борьбы с инфекционными болезнями [85- 93- 129].

В связи с этим совершенствование методов лабораторной диагностики возбудителя холеры и разработка новых препаратов на их основе является актуальной задачей [31- 77- 92- 136- 130- 152- 158- 167- 181- 249- 298]. Для внедрения препаратов в практику Федеральной службы Роспотребнадзора необходима разработка соответствующей нормативной базы, стандартных схем отбора, проведение объективных испытаний и как следствие разрешение к применению в практических целях сертифицированных препаратов [12- 16- 17- 103- 105- 152- 153].

В наших исследованиях была проведена оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры: микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х), бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких и тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции для последующей рекомендации их к регистрации в Российской Федерации.

Система оценки качества диагностических препаратов включала в себя показатели чувствительности — процент обнаружения положительных проб, процент выявления возбудителей при клинических или полевых испытаниях, специфичности, воспроизводимости и экономичности. Наиболее важными из них являются показатели чувствительности и специфичности. Именно они определяют способность препарата объективно обеспечивать определение эпидемического потенциала территорий, оценивать эпидемиологическую обстановку, осуществлять эпидемиологический надзор и своевременно проводить мероприятия по санитарно-эпидемиологической охране территории России.

Испытания диагностической ценности препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры проводили по разработанным нами Программам испытаний на базах научно-исследовательских институтов соответствующего профиля и противочумных станциях. Число опытных баз определяли в зависимости от общего объема запланированных исследований, но не менее двух. Этапы испытаний с соблюдением принципов полевых контролируемых экспериментов распределялись между базами.

Испытания образцов новых диагностических препаратов по всем показателям на всех стадиях проводили в сравнительных опытах с коммерческим препаратом аналогичного назначения. Выбор аналога сравнения проводился конкретно для каждого испытуемого препарата.

Чувствительность и специфичность препаратов оценивали на штаммах, полученных от людей и из объектов внешней среды. При этом оценивали способность и надежность методов контроля, изложенных в проектах ФСП, обеспечивать необходимый уровень качества препаратов в соответствии с их назначением.

Для проведения исследований в лабораторных, клинических и полевых испытаниях определяли объем работы. Для этого в опыт брали те объекты и клинический материал, при исследовании которых, регистрируется наибольшая частота выявления возбудителя.

Информативность лабораторных методов контроля определяли по соответствию результатов лабораторных и полевых опытов. Для этого устанавливали критерии оценки диагностических препаратов, результаты вносили в разработанные определенные формы документации, в том числе таблицы шифрования, протоколы результатов исследований. По окончании испытаний проводили статистическую обработку результатов с определение средних величин, достоверности различий между опытными и контрольными диагностическими препаратами. Полученные в ходе лабораторных и анализе полевых испытаний данные были использованы при составлении окончательного варианта ФСП и Инструкций по применению.

Диагностическую ценность микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) производства филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО «Питательные среды» в г. Махачкала изучали по проценту совпадения результатов определения биохимических свойств микроорганизмов с препаратами сравнения, количеству правильно идентифицированных штаммов, по совпадению результатов при определении 10 положительных и 10 отрицательных пробах. Кроме этого нами оценивались технологичность, доступность постановки метода и скорость получения результатов.

При изучении музейных штаммов (п=151) представителей семейства УЛпопасеае и других микроорганизмов было доказано, что микротестсистемы МТС-У и МТС-Х по своей специфической активности соответствуют коммерческим системам индикаторным бумажным (СИБ) и средам Гисса и Меллера. Анализ биохимической активности холерных вибрионов по 11 тестам для микротестсистемы МТС-У показал, что совпадения результатов, полученных с помощью испытуемой микротестсистемы и коммерческой системы СИБ, для разных реагентов составили от 76,0 до 100,0%, средние данные по 11 тестам — 93,0±2,0%. Частота совпадений реакций с помощью МТС-У со средами Гисса и Меллера для отдельных тестов отмечалась от 78,0% до 100,0%, среднее по 11 тестам — 93,0±3,0%. Анализ биохимической активности микроорганизмов по 3 тестам для микротестсистемы МТС-Х показал, что совпадения результатов, полученных с помощью испытуемой микротестсистемы и коммерческой системы СИБ, для разных реагентов составили от 57,0 до 100,0%, средние данные по 3 тестам — 88,0±3,0%. Частота совпадений реакций с помощью МТС-Х со средами Гисса и Меллера для отдельных тестов отмечалась от 85,0% до 100,0%, среднее по 11 тестам -91,0±2,0%. При этом статистически достоверных различий (р>0,10) между методами исследования не обнаружено. Предварительный учет результатов биохимической активности штаммов с помощью микротестсистемы МТС-У проводили через 2−3 ч, окончательный — через 18−20 ч. С помощью микротестсистемы МТС-Х окончательный учет результатов биохимической активности микроорганизмов проводился через 2−3 ч. При изучении воспроизводимости получено 100% совпадение результатов положительных и отрицательных реакций биохимической активности микроорганизмов с помощью МТС-У и МТС-Х.

Полученные нами результаты свидетельствовали о высокой диагностической ценности микротестсистем MTC-V и МТС-Х. Показано преимущество микротестсистем MTC-V и МТС-Х перед СИБ, средами Гисса и Меллера по возможности одновременного испытания на одном планшете несколько подозрительных колоний, исключению необходимости проведения большого объема подготовительных работ и сокращения времени постановки и получения результатов, технологичности, так как не требуют приготовления дорогостоящих питательных сред с аминокислотами и сахарами, возможности проведения анализа в полевых условиях без сред Гисса или Меллера на месте или транспортировки сред, приготовленных ранее в стационарных условиях.

Результаты наших исследований явились основанием для внесения изменений в ФСП и Инструкцию по применению на микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (МТСV) и определения их по группам Хейберга (МТС-Х).

Усовершенствование контроля качества микротестсистем MTC-V и МТС-Х состояло в оптимизации методики постановки реакции, заключающейся в изменении, вносимых в ячейки объема взвеси микроорганизмовдополнение среды, используемой для приготовления взвеси микроорганизмов (пептонная и дистиллированная вода) — в подборе тест-штаммов для контроля специфической активности, обеспечивающих проверку каждого реагента, в расширении диапазона биохимической идентификации вида Vibrio cholerae и дифференциации их от других видов Vibrio и близкородственных микроорганизмов.

В результате проведенных нами исследований установлено, что тест на сероводород в микротестсистеме MTC-V не работал. Учитывая, что образование сероводорода для холерных вибрионов является не постоянным признаком, рекомендовано исключить данный тест из состава микротестсистемы MTC-V.

В Инструкцию по применению на микротестсистему для биохимической идентификации вибрионов MTC-V включена таблица биохимической характеристики 12 видов, относящихся к роду Vibrio: V. cholerae 01 и не 01, V. parachaemolyticus, V alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnikovii, V. vulnificus, V anguillarum, V furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, К carchariae.

Таким образом, на основании результатов, полученных при проведении приемочных испытаний, микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их по группам Хейберга (МТС-Х) внедрены в лабораторную практику.

Диагностическую ценность бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов) определяли в сравнении с монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4 и ХДФ-5. Испытания проводили по схеме определения эпидемической значимости холерных вибрионов эльтор, состоящей из 8 вариантов — эпидемически опасныеэпидемически неопасные и штаммы, для определения эпидемической значимости которых, необходимо привлечение дополнительных методов исследования. Эпидемическую значимость испытуемых штаммов определяли по 3-м признакам — чувствительности к фагам ctx+ и ctx" и гемолитической активности.

Проведенные исследования позволили установить, что с помощью испытуемых бактериофагов ctx+ и ctx" и гемолитической активности идентифицировано 100% эпидемически опасных штаммов (п=116), в том числе 108 штаммов (93,1%) (вариант 1 — гемолиз, ctx+ - «+», ctx" - «-») к числу эпидемически опасных отнесены без дополнительных исследований, а 8 штаммов (6,9%) были отнесены при дополнительных исследованиях (метод ПЦР) на наличие ctxAB также к числу эпидемически значимых. С помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности идентифицировано только 65,5% эпидемически опасных штаммов.

Тестирование эпидемически неопасных штаммов V. сНоЫгае еНог (с (хА~) (п=87) с помощью бактериофагов диагностических холерных эльтор с1х+ и с1х" жидких и контрольных коммерческих монофагов диагностических холерных ХДФ-3,4,5 показало, что используемые препараты по диагностической ценности равнозначны. С помощью испытуемых бактериофагов холерных эльтор с! х+ и с1х" и гемолитической активности правильно идентифицировано 87% штаммов, с помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности — 85%.

С целью сравнительной оценки диагностической эффективности указанных бактериофагов была изучена их специфичность. Установлено, что специфичность бактериофага холерного эльтор с1х+ составила 81,6%, специфичность бактериофага холерного эльтор с1х" - 98%. Бактериофаг холерный эльтор йх+ был недостаточно специфичен, поскольку лизировал эпидемически неопасные холерные вибрионы. У данных штаммов выявлены гены биосинтеза токсинкорегулируемых пилей адгезии (7срА) — ведущего фактора колонизации холерных вибрионов, поэтому штаммы с таким генотипом считаются потенциально эпидемически опасными, способными вызывать спорадические единичные и множественные случаи диарей. Выделение штаммов холерных вибрионов с генотипом сЬс" £ср+ из объектов внешней среды и от людей, свидетельствует о заносе на территорию эпидемически опасного возбудителя холеры, который утратил отдельные гены или блок вирулентности под воздействием факторов внешней среды [Костромитина Е.А., 2004]. В связи с этим идентификация и дополнительное изучение таких культур является важной задачей лабораторной диагностики.

Анализ данных по 5 базам испытаний показал, что по предложенной схеме с учетом гемолитической активности идентифицировано 100% из 350 музейных и свежевыделенных штаммов V. сксЯегае еЬог (с (хА+). В том числе 95,1% отнесены к числу эпидемически опасных без дополнительных исследований, т. е. к варианту 1, а 17 штаммов (4,9%), выделенные от больных, носителей и сточных вод, были отнесены при дополнительных исследованиях на наличие генов с? хАВ методом ПЦР также к числу эпидемически значимых (варианты 3, 4, 5). В то время, с помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности правильно идентифицировано из числа эпидемически опасных только 157 штаммов из 350 исследованных, что составило 55%.

Нами была проанализирована частота совпадений эпидемической значимости штаммов V. ско1егае еНог с помощью бактериофагов и паспортных данных по ПЦР — тестированию на наличие генов ОхАВ по всем 5 — ти базам испытаний (таблица 4.4.). Из этой таблицы видно, что из 570 изученных штаммов V. ско1егае еНог, имеющих и не имеющих структурные гены МхАВ, результаты тестирования по ПЦР совпали с определением эпидемической значимости по фагам и с! х" в 92,8% (529 штаммов), по фагам ХДФ — в 66,6% (380 штаммов). Данные определений с помощью испытуемых и контрольных фагов совпали в 64,4% (367 из 570 штаммов). Изучение воспроизводимости испытуемых и ^х" бактериофагов показало 100% совпадение результатов в 10 положительных и 10 отрицательных параллельных определениях.

Полученные результаты исследований свидетельствовали о достаточно высокой активности и специфичности, диагностической ценности и информативности, простоте использования (применяются в цельном виде) испытуемых бактериофагов диагностических холерных эльтор йх+ и с1х" по сравнению с контрольными монофагами холерными ХДФ-3,4,5.

Результаты сравнительного изучения бактериофагов позволили разработать требования, способствующие повышению их качества, и внести изменения в Нормативную документацию. Предложенная авторами и специалистами Ростовского-на-Дону НИПЧИ схема оценки эпидемической значимости вибрионов эльтор по чувствительности к бактериофагам диагностическим холерным эльтор с1х+ и с1х" была усовершенствована нами с учетом результатов приемочных испытаний бактериофагов. Оценку эпидемиологической значимости холерных вибрионов было рекомендовано проводить по 3 признакам — чувствительности к фагам ctx+, ctx" и гемолитической активности в соответствии со схемой, состоящей из 8 вариантов, обобщенных в 3 группы: эпидемически опасные (I группа) — штаммы, для определения эпидемической значимости которых, необходимо привлечение дополнительных методов исследования, таких как определение токсигенности на модели кроликов-сосунков и метода полимеразной цепной реакции (II группа) и эпидемически неопасные (III группа). Для каждой группы определены и уточнены варианты. Усовершенствованная нами схема была внесена в Инструкцию по применению на препарат и в Методические указания МУ 4.2.1097−02. 2002 «Лабораторная диагностика холеры».

В ФСП уточнены требования к «Специфической активности и специфичности фагов, а также требования к тест-штаммам для контроля». Рекомендовано для контроля активности бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и специфичности бактериофагов ctx" использовать 5 штаммов заведомо эпидемически опасных, относящихся к 1 вариантудля контроля специфической активности бактериофагов ctx" и специфичности бактериофагов ctx+ использовать по 2 эпидемически неопасных из 3 группы (варианты 6,7, 8).

Для сохранения стабильности препарата и увеличения срока его действия авторам рекомендовано в последующем разработать лиофилизированную форму выпуска бактериофагов ctx+ и ctx" .

Благодаря простоте метод идентификации с помощью бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" доступен для лабораторий любого уровня оснащения и может быть использован в комплексе с определением гемолитической активности в пробе Грейга и с другими методами для предварительной оценки эпидемической значимости холерных вибрионов биовара эльтор.

Нами было проведено сравнительное испытание диагностической эффективности сконструированной специалистами ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции и контрольной тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Тест-системы оценивали по чувствительности (определению минимального количества, выявленных в ПЦР, микробных клеток холерного вибриона), по проценту выявленных штаммов V. cholerae (ctxA+tcpA+) к числу исследованных, по проценту выявленных положительных проб биологического материала и объектов внешней среды к числу искусственно инфицированных V. cholerae (ctxA+tcpA+) проб, взятых на исследование. При изучении специфичности определяли процент неспецифических реакций при исследовании проб, инфицированных V cholerae не OI (ctxA*) и гетерологичными микроорганизмами.

На этапах изучения чувствительности и специфической активности тест-системы всего было исследовано 54 штамма микроорганизмов. В результате проведенных исследований показано, что обе тест-системы равнозначны по способности определять эпидемическую значимость выделенных холерных вибрионов, имеющих ген ctxA, ответственного за токсинообразование. Обе о тест-системы выявляли в концентрации 1Т0 м.к./мл одинаковое количество штаммов V cholerae (ctxA+) (испытуемая — 33, контрольная — 32 из 37 исследованных штаммов). Также обе тест-системы характеризуются высокой специфичностью: специфичность испытуемой тест-системы составила 95%, контрольной — 97%. Воспроизводимость оценивали в процентах совпадений результатов исследования 10 положительных проб V. cholerae (ctxA+tcpA+) и 10 отрицательных проб V. cholerae не 01 {ctxA~ tcpA') при постановке анализа разными исполнителями в разные сроки исследования. При учете результатов установлена 100% воспроизводимость положительных и отрицательных результатов. Продолжительность анализа от начала исследования до получения заключительного ответа для обеих тест-систем составила 8 ч.

В сравнительных испытаниях доказано преимущество испытуемой тест-системы перед контрольной по способности выявлять дополнительную детерминанту патогенности холерных штаммов — ген 1срА, ответственный за синтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилейдифференцировать холерные вибрионы на классический и эльтор биовары, выявлять штаммы 0139 серовара, а также по способности обнаруживать дополнительно штаммы V. ско1егае по наличию гена^рА при отсутствии гена с1хА. Идентификация штаммов с генотипом сгхА~1срАл очень важна, так как они считаются потенциально эпидемически опасными и способными вызывать спорадические случаи диареи [61]. Штаммы V. сИо! егае с характеристикой (с?хА~ 1срА+) обусловили локальные вспышки холеры в Узбекистане (1961, 1963, 1980;1990 годы), Азербайджане (с 1970 по 1993 г. г.), Туркмении, в Ростовской области в 2005 г. [93].

На основании проведенных исследований по нашей рекомендации в проект ФСП включены дополнительные критерии оценки качества препарата: подобраны контрольные штаммы, определены требования к этим штаммам, обоснованы их дозы, используемые при контроле тест-систем, уточнены показатели чувствительности тест-системы. Авторами была заявлена о чувствительность тест-системы 110 м.к./мл. В результате наших исследований было показано, что тест-система выявляла 89,2% штаммов V. ско1егае (с (хА+) и только 43,2% штаммов V. с! ю1егае (/срА) в концентрации, НО м.к./мл. Штаммы V. ско1егае (/срА+) в концентрации 1−104 м.к./мл испытуемая тест-система выявляла 94,6% случаев. Учитывая полученные результаты, нами было рекомендовано внести в нормативную документацию чувствительность тест-системы для штаммов V. ско1егае (с (хА+) равную НО3 м.к./мл, для штаммов V. скоегае {1срА- 1 ТО4 м.к./мл.

Кроме этого нами было рекомендовано внести изменения в комплектацию тест-системы. Авторами была предложена смесь праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагмента ДНК размером 302 п. н, комплементарных нуклеотидной последовательности структурного гена ctxA и праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагментов ДНК размером 455 п.н. (для возбудителя холеры биовара эльтор и серогруппы 0139) и 264 п.н. (для возбудителя холеры классического биовара), соответствующего нуклеотидным последовательностям структурного гена tcpA. В ходе проведения сравнительных испытаний нами показано, что это влияет на чувствительность тест-системы. В связи с этим для сохранения чувствительности тест-системы в течение срока годности нами было рекомендовано разделение праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности структурным генам ctxA и tcpA, на отдельные компоненты.

Таким образом, в результате проведенных испытаний получены новые данные о преимуществе испытуемой тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) перед контрольной по диагностической эффективности. Разработанные нами в процессе исследований требования оценки основных показателей качества диагностической тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) введены в утвержденную нормативную документацию. Проведенная аттестация позволила внедрить в практику отечественный препарат нового поколения для усовершенствования лабораторной диагностики холеры.

Вышеизложенное обеспечило условия для внедрения в практику новых отечественных препаратов для индикации и идентификации возбудителя холеры и осуществление надзора за качеством препаратов при последующих их серийных выпусках. Это позволит усовершенствовать диагностику холеры в лабораторной практике, своевременно и объективно изучать вопросы распространения и сохранения в природных условиях холерного вибриона и прогнозировать эпидемическую ситуацию по холере.