Особенности структурно-функциональной организации эпифиза крыс в постнатальном онтогенезе

В настоящее время не вызывает сомнения то, что эпифиз или пинеальная железа, являясь церебральной железой внутренней секреции, занимает одно из центральных мест в эндокринной регуляции организма. В ходе эволюции эпифиз постепенно утрачивает фоторецепторную функцию, характерную для пинеального органа Апатта, и превращается у млекопитающих в настоящую нейроэндокрин-ную железу, секретирующую свои гормоны в кровь и/или ликвор. Эпифиз играет центральную роль в осуществлении приспособительных реакций организма к изменяющимся условиям внешней среды, в частности, устанавливает широкий спектр связей с периферическими эндокринными железами в процессе формирования четкого суточного и сезонного периодизма физиологических функций (Коваленко, 1993).

Активное исследование функций эпифиза началось лишь в 70-х годах XX века. В настоящее время известно, что гормоны эпифиза регулируют функции щитовидной железы, надпочечников, гонад, иммунной системы и гормонопоэз в гипоталамо-гипофизарной системе. Пинеальная железа играет важную роль в осуществлении стресс-организующих и стресс-лимитирующих механизмов, вовлекаясь в формирование множественных адаптационных ответов организма на стрес-сорное воздействие, главным образом, за счет влияний со стороны краниальных шейных симпатических ганглиев (КШГ) и ЦНС в 1-фазу и действия гормонов коры надпочечников во П-ю фазу общего адаптационного синдрома (МШп, 1981, 1984; Арушанян и др., 1993; Арушанян, 1996). При стрессе, когда активируется симпато-адреналовая система, гормоны эпифиза подтормаживают секрецию ингибирую-щих иммунокомпетентные клетки глюкокортикостероидов, оказывают онкоста-тический эффект и сонмогенное действие на структуры ЦНС.

Свои множественные модулирующие влияния на железы внутренней секреции и другие системы организма эпифиз осуществляет в основном посредством своих гормонов индольной и пептидной природы. Для мелатонина, долгое время считавшегося главным гормоном эпифиза, показана способность ослаблять негативное воздействие на организм окислительного, осмотического, психического и ряда других видов стресса (Слепушкин и др., 1982; Арушанян и др., 1993). Этот нейрогормон обладает также антигонадотропными, антиканцерогенными, антиок-сидантными и иммуномоделирующими свойствами (Морозов и др., 1996; Хавин-сон, 1996; Reiter et al., 1999; Аниеимов и др., 1999). Антигонадотропная активность других ивдоламинов эпифиза значительно меньше, чем у мелатонина, а остальные свойства этих метоксииндолов остаются малоизученными (Reiter, 1984,1988; Ebels et al., 1986). Для эпифизарных пептидов показаны сходные, а в некоторых случаях и превосходящие мелатонин эффекты. Пептидные препараты эпифиза повышают функциональную акшвность тимуса, нормализуют ряд нарушений углеводно-жирового обмена, обладают антиокислительными свойствами (Слепушкин и др., 1982; Галанцев и др., 1995; Cagnoli et al., 1995). Однако механизмы их секреции, физиологическая роль в организме и взаимоотношения с индоламинами требуют дальнейшего изучения.

Эпифиз является одним из важнейших компонентов гомеостаз-поддерживающей системы организма. Этот нейроэндокринный орган участвует в запуске стрессорной реакции, а также в ограничении ее последующего развития с предотвращением появления неблагоприятных для организма последствий. Динамика изменений структуры эпифиза при стрессе изучена недостаточно. Особенно это касается реакций пинеальной железы на гипоксические воздействия. Среди проблем физиологии эпифиза несомненный интерес представляет и возрастной аспект исследования морфофункциональных реакций этого органа на стрессорные воздействия, поскольку известно, что пинеальная железа претерпевает в процессе онтогенеза значительные и довольно рано начинающиеся перестройки инволютив-ного характера.

Огромный практический и теоретический интерес для клинической онкологии, фундаментальной биологии и физиологии представляет вопрос о влиянии эпифиза на опухолевый рост. В основе развития последнего лежат, с одной стороны, потеря контроля процессов пролиферации и дифференцировки и, с другой стороны, дефектность иммунологических механизмов противоопухолевой защиты. И так как эпифиз имеет прямое отношение к регуляции данных физиологических процессов, то его участие в онкогенезе сейчас не подвергается сомнению. Показано, что мелатонин и эпифизарные пептиды, стимулируя клетки иммунной системы организма, замедляют ее старение и предупреждают развитие спонтанных и индуцируемых различными химическими канцерогенами и ионизирующей радиацией новообразований (Анисимов, Reiter, 1990; Акисимов и др., 1993; Анисимов и др., 1997). Кроме того, мелатонин угнетает образование в организме агрессивных метаболитов канцерогенов, веществ, способных вызывать рак (Reiter et al., 1995). В последнее время большое число исследований направлено на изучение характера взаимодействий и взаимовлияний в системе опухоль — организм-опухоленоситеяь. В литературе, наряду с констатацией антионкогенных свойств эпифизарных гормонов, имеются прямые указания на нарушение функциональной активности пинеальной железы у раковых больных (Петров, 1984). Однако морфологическая и ультраструктурная основа этих функциональных нарушений, их динамика в процессе опухолеобразования, остается не изученной, а отдельные сообщения противоречивыми. Выяснение тонких механизмов взаимовлияния эпифиза и развивающейся опухоли помогут адекватно использовать лекарственные средства на основе эпифизарных экстрактов для лечения различных форм рака.

Еще одной приоритетной областью исследования эпифизарных функций является область геронтологии. В отношении эпифиза принято говорить о циркад-ных или сезонных часах старения (Pierpaoli et al., 1994; Анисимов, 1997). В целом, старение может быть определено как общая десинхронизация функций организма, снижение его адаптивных возможностей к изменениям условий среды, а также нарушение восстанавливающих возможностей гомеостаза. Среди многих предложенных теорий старения в последние годы наиболее плодотворно разрабатывается свободнорадикальная теория, объясняющая не только сам механизм процесса старения, но и ряд связанных с ним патологий — сердечно-сосудистых заболеваний, возрастных иммунодепрессий и дисфункций мозга, катаракту, рак (Cutler, 1991; Harman, 1994; Martin et al., 1996). Такие агрессивные агенты как супероксидный анион, пероксид водорода, гидроксильный радикал, и, возможно, синглетный кислород, продуцируемые главным образом в митохондриях, ускользая от ферментной защиты, повреждают клеточные макромолекулы — ДНК, белки, липиды. Полагают, что именно накопление в клетках организма свободнорадикапьных повреждений лежит в основе старения и связанных с ним заболеваний. Одной из наиболее активных структур, обеспечивающих продукцию эндогенных антиоксидантов, необходимых для защиты клеточных макромолекул, является эпифиз. Так показано, что мелатонин в опытах in vitro в 5−14 раз активнее связывает свободные радикалы, чем глютатион пероксидаза (Reiter et al., 1995), обладает антиокислительными свойствами in vivo (Reiter et al., 1995; Анисимов и др., 1996). У животных эпита-ламин — полипептидный препарат эпифиза — более эффективно, чем мелатонин, угнетает свободно-радикальные процессы, активируя супероксиддисмутазу, фермент, играющий ключевую роль в системе антиоксидантной защиты организма (Анисимов и др., 1998; Хавинсон и др., 1999).

Эпифиз является сложной полиморфной структурой, претерпевшей в ходе эволюции значительные структурно-функциональные перестройки. Для него характерны многотипность клеток, строгая упорядоченность в расположении клеточных тел и поляризация отростков, направляющихся к кровеносным капиллярам или Ш желудочку мозга. Особенности структуры эпифиза и дифферендировки его клеток, возрастных изменений его морфофункциональной организации до настоящего времени изучены недостаточно и требуют дальнейшего исследования. Очевидна и необход имость конкретизации механизмов влияния отдельных физиологически активных веществ на секреторные процессы в клетках эпифиза, что удобно изучать в условиях культуры ткани, где исключаются другие воздействия со стороны организма. Так, например, в эпифизе были обнаружены окситоцин-содержащие волокна и их окончания (Buiys et al., 1980), приходящие предположительно из паравен-трикулярных ядер гипоталамуса (Partington et al., 1987). Нельзя исключить и возможности того, что окситоцин синтезируется клетками самого эпифиза (Liu et al., 1987). Разработка данной гипотезы представляет несомненный интерес для изучения механизмов контроля деятельности эпифиза.

Эпифиз, будучи вовлеченным в столь широкий спектр организации приспособительных гомеостатических реакций организма, секретирующий гормоны с ге-ропротекторными, адаптогенными, иммунномоделирующими, антиоксидантными и онкостатическими свойствами, стал привлекательным объектом для исследования учеными разных специальностей — морфофизиологами, биохимиками, иммунологами, геронтологами, онкологами и т. д. Изучение функциональной активности секреторных клеток эпифиза, до сих пор остающихся мало исследованными, имеют бесспорную теоретическую ценность для фундаментальной физиологии, а также несомненную практическую значимость для медицины и фармакологии, так как 9 позволит более активно и адекватно применять препараты на основе эпифизарных экстрактов для лечения больных.

В связи с изложенным цель работы состояла в исследовании особенностей структурно-функциональной организации эпифиза крыс в ходе посшатального онтогенеза. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Изучение организации паренхимы эпифиза крыс в различные периоды постаа-тального онтогенеза;

2. Исследование характера морфофункциональных изменений в эпифизе крыс разного возраста в ответ на стрессорные воздействия, в частности, при индуцированном канцерогенезе;

3. Оценка интенсивности процессов перекисного окисления липидов в эпифизе крыс разного возраста, при индуцированном канцерогенезе и в условиях стресса;

4. Анализ реакций клеток культуры ткани эпифиза на воздействия гормональных препаратов, воспроизводящих регуляторные влияния в организме.

ВЫВОДЫ.

1. В процессе постнатального онтогенеза у крыс происход ит поэтапная смена клеточного состава паренхимы эпифиза. У молодых крыс, в период до полового созревания, преобладают высоко функционально активные «промежуточные» пинеалоциты. У половозрелых крыс присутствуют примерно в равном соотношении «светлые» активные и «темные» пинеалоциты с признаками угнетения секреторных процессов. У старых крыс «темные» пинеалоциты составляют 9,2%, «светлые» — 90,8%, среди которых 30% обнаруживают признаки дегенерации.

2. Комплексный стресс, шщуцированный принудительным погружением крыс разного возраста под воду, приводит к перераспределению кровотока (уменьшению просвета капилляров, возрастанию их количества) в эпифизе, а также к активации синтеза и выведения веществ белково-пептидной природы пинеалоцитами. У половозрелых крыс стресс вызывает преобразование «светлых» и «темных» пинеалоцитов в наиболее высокоактивный «промежуточный» тип, отсутствующий в контроле. Такие же клетки при стрессе появляются в небольшом количестве в эпифизе старых животных, свидетельствуя о гиперактивации сохранивших морфофункциональную целостность секреторных клеток.

3. Показано, что у половозрелых крыс на ранних стадиях индуцированного канцерогенеза, когда опухоли в толстой кишке еще отсутствуют, наблюдается значительная гиперфункция эпифиза, выражающаяся в преобладании «светлых» пинеалоцитов с повышенной биосинтетической и секреторной активностью. На более поздних стадиях канцерогенеза, когда в толстой кишке обнаруживаются оформленные опухоли, паренхима эпифиза претерпевает глубокие дегенеративные изменения, сходные с инволютавными старческими преобразованиями.

4. Дегенеративные изменения в эпифизе старых крыс и животных с индуцированным канцерогенезом сочетаются с накоплением в тканях железы продуктов перекисного окисления липидов. Достоверная активация свободноради-кального окисления при стрессе имела место в эпифизе только половозрелых крыс.

5. Гомогенная популяция пинеалоцитов эпифиза новорожденных крысят при культивировании в диффузионных камерах, имплантированных половозрелым крысам, дифференцируется на «светлые» и «темные» клетки. Окситоцин в концентрации, сопоставимой с содержанием этого гормона в крови крыс при стрессе, вызывает усиление биосинтетической активности, и угнетение экструзии веществ белково-пептидной природы пинеалоцитами, приводя к превращению «темных» клеток в «светлые». Данные экспериментов in vitro, а также закономерности структурно-функциональной организации паренхимы эпифиза в ходе постнатального онтогенеза свидетельствуют о том, что выявленные типы пинеалоцитов являются функциональными вариантами единой клеточной популяции.

ГЛАВА 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ результатов наших исследований, выполненных с применением световой и электронной микроскопии, морфометрии, а также биохимических методов, позволяет сделать заключение о следующем ходе морфофункцио-нальных преобразований основных гормонпродуцирующих клеток паренхимы эпифиза крыс — пинеалоцитов с возрастом. На ранних стадиях постнатального развития, по крайней мере в 1-месячном возрасте в наших экспериментах, паренхима эпифиза крыс состоит из мономорфной популяции ПЦ, представляющих собой «промежуточные» (по использованной нами терминологии) по своим структурным и ультраструктурным характеристикам клетки. Эти клетки обладают высокой функциональной активностью, о чем свидетельствуют самый большой показатель ядерно-ядрышкового коэффициента и прекрасно развитые цитоплазматические структуры. В связи с этим можно полагать, что в «промежуточных» клетках эпифиза молодых животных интенсивно протекают метаболические и биосинтетические процессы. Так, известно, что синтез МЛТ в пинеальной железе крыс имеет место уже с конца первой недели постнатального развития, а в плазме его определяют с 9 дня жизни (2Йоиш, 1995).

Выявленные нами «промежуточные» ПЦ многочисленны, обладают небольшими размерами и плотно прилежат друг к другу, к сосудам и соединительно-тканным трабекулам. С учетом данных о том, что ПЦ теряют способность к пролиферации ко второй неделе постнатального развития, а в эпифизе взрослых половозрелых крыс выявляются уже две четко различающиеся по своим структурным и ультраструктурным характеристикам популяции ПЦ -«темные» и «светлые», закономерно сделать предположение о переходе «промежуточных» ПЦ в О-стадию клеточного цикла и инициации процесса дальнейшей их дифференцировки, приводящей к формированию двух клеточных типов ПЦ. Возможно, в случае второй возрастной группы (5 месяцев), мы наблюдали уже конечный этап вышеописанного процесса дифференцировки, выявляя только «темные» и «светлые» ПЦ без каких-либо переходных форм, нередко отмечаемых другими исследователями (Колесникова, 1995).

Таким образом, при наибольшей функциональной активности эпифиза крыс в период, предшествующий половому созреванию, паренхиму органа составляют «промежуточные» ПЦ, обладающие высоким уровнем метаболической, биосинтетической и, вероятно, секреторной активности. У взрослых половозрелых крыс функционально более активны «светлые» ПЦ, тогда как биосинтетические и секреторные процессы в «темных» ПЦ существенно снижены. Вместе с тем, ультраструктурные исследования показывают, что внутриклеточные органеллы в «темных» ПЦ не подвержены деструктивным изменениям. Исходя из полученных данных, мы предполагаем, что «темные» ПЦ представляют собой некий «потенциал» («запас») и со временем или в связи с потребностями организма, как в случае сильного стрессорного воздействия, переходят в функционально активное состояние, занимая место деградирующих в силу длительной гиперфункции «светлых» ПЦ. Морфологически такой переход соответствует превращению «темной» клетки в «светлую».

Даже на очень поздних стадиях онтогенеза (22 месяца) в эпифизе крыс на фоне многочисленных «светлых» ПЦ, находящихся на разных стадиях деградации, часть паренхимы сохраняет свою структурную и функциональную целостность. В пинеальной железе старых крыс все еще выявляются, хотя и в крайне малом количестве, «темные» клетки.

Аналогичную ситуацию, связанную с возрастными преобразованиями эпифиза крыс, мы наблюдали и при индуцированном ДМГ канцерогенезе у половозрелых животных, у которых старческие деградационные изменения паренхимы сдвинуты на гораздо более ранние стадии онтогенеза. Подобный процесс, очевидно, имеет место в условиях воздействия канцерогена и формирования опухоли в следствие длительной функциональной гиперактивности органа, вызванной вовлечением железы в систему антионкогенной защиты организма.

Известно, что интенсификация процессов перекисного окисления липи-дов повышает вероятность образования агрессивных метаболитов кислорода (супероксид, пероксид водорода, синглетный кислород, гидроксильный радикал), способствующих повреждению клеточных макромолекул и, тем самым, накоплению клетками изменений деструктивного характера. В наших экспериментах активация процессов ПОЛ наблюдалась в эпифизе на поздних стадиях онтогенеза, а также в результате действия на организм стрессорных факторов, в частности — при индуцированном канцерогенезе. Следует отметить, что наиболее выраженная активация ПОЛ в эпифизе крыс имеет место именно в процессе опухолеобразования.

Существование двух типов ПЦ — «светлых» и «темных» — показано нами в культуре ткани эпифиза крыс, выращенной в диффузионных камерах. И хотя в данном эксперименте для получения культуры были использованы эпифизы новорожденных крысят, мы предполагаем, что организм половозрелой крысы-реципиента оказал на формирующуюся культуру влияния, послужившее толчком к процессу дифференцировки ПЦ с формированием в последствии двух клеточных типов, характерных для паренхимы пинеальной железы взрослых животных.

Необходимо отметить, что, несмотря на крайне скептические взгляды большинства исследователей, нам удалось показать с помощью метода Голь-джи существование нейроноподобных клеток в паренхиме эпифиза молодых крыс, а также в культуре ткани пинеальной железы, выращенной в диффузионных камерах. Эти клетки имеют овально-удлиненные тела и 2−3 длинных отростка с характерными для дендритов ветвлениями.

В культуре ткани, выращенной в диффузионных камерах, мы изучали эффекты воздействия ОТ на изменение объема разных типов ПЦ. Известно, что пусковым фактором увеличения синтеза и экзоцитоза ОТ являются осма-тические нагрузки, функциональные состояния организма, сопряженные с повышением осмотического давления плазмы крови или других жидкостных сред и иные стрессорные факторы. Подобные функциональные состояния, возможно, имели место в исследовавшихся нами процессах канцерогенеза, формировании опухоли, старении и в условиях острого стрессорного воздействия. В связи с этим представляло интерес изучить непосредственные влияния ОТ на функциональную активность изолированных клеток паренхимы эпифиза крыс — железы, вырабатывающей биологически активные вещества с антистрессорными, антионкогенными и иммуномоделирующими свойствами. Эффекты ОТ носили дозозависимый характер в отношении «светлых» ПЦ.

Только аппликации гормона в концентрации 1×10″ 9 г/мл, соответствующей его уровню в крови при стрессе, вызывали достоверное увеличение объема «светлых» клеток по сравнению с контролем. Полученные данные в определенной мере свидетельствуют об интенсификации секреторных процессов в «светлых» ПЦ под воздействием ОТ. На «темные» клетки ОТ в обеих исследованных концентрациях (1×10″ 9 г/мл и 1×10″ 11 г/мл) оказывал одинаковые влияния — клеточный объем возрастал в гораздо большей степени, чем в отношении «светлых» клеток. Результаты этих экспериментов подтверждают гипотезу о регулирующем влиянии ОТ на функциональную активность пине-альной железы.

Столь выраженную реакцию «темных» ПЦ на аппликации гормона можно объяснить интенсификацией под его влиянием биосинтетической и, вероятно, секреторной активности этих клеток. Подобная интенсификация может иметь место в целостном организме при сильных стрессорных воздействиях (например, при гипоксии). Стрессорные воздействия могут служить толчком к активации функционально малоактивных «темных» ПЦ и превращению их в «светлые» клетки. Аналогичный процесс мы наблюдали при исследовании эпифизов подвергнутых принудительному погружению под воду крыс второй возрастной группы. Паренхима эпифиза этих животных состояла из моно-морфной популяции высоко функционально-активных ПЦ, в отличие от соответствующего возрастного контроля, где выявлялись и «светлые» и функционально мало активные «темные» клетки.

Таким образом, представленные в настоящей работе экспериментальные результаты расширяют представления о структурно-функциональной организации эпифиза и ее преобразованиях в ходе постнатального онтогенеза. Они убедительно продемонстрировали единую направленность изменений функционирования клеток паренхимы эпифиза при старении организма, формировании опухолей и сильных стрессорных воздействиях. Выявленные особенности изменения соотношения популяций «светлых» и «темных» ПЦ представляется перспективным для оценки эффектов различных биологически активных веществ в качестве онкостатиков и геропротекторов.