Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Исследование дискриминации ионообразования в электроспрее и Maldi методах ионизации для количественного анализа белков

Диссертация: Исследование дискриминации ионообразования в электроспрее и Maldi методах ионизации для количественного анализа белков
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинарах в ИАнП РАН, на 6-й Пущинской школе-конференции «БИОЛОГИЯ — НАУКА XXI ВЕКА» (г. Пущино, 2002 г.), на III съезде биофизиков России (г. Воронеж, 2004), а так же на Desorption 2004. (S.- Petersburg). Целью работы является изучение дискриминации новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI, и использование полученных данных для создания… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ВВЕДЕНИЕ
  • 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
    • 2. 1. Исследование белка с помощью масс-спектрометрии
    • 2. 2. Основные методы ионообразования термолабильных веществ
      • 2. 2. 1. Образование ионов при электрораспылении
  • Electrospray Ionization, ESI)
    • 2. 2. 2. Ионизация лазерной десорбции в присутствии матрицы
  • Matrix assisted laser Desorbtion / Ionization, MALDI)
    • 2. 3. Масс-анализатор ы
    • 2. 3. 1. Магнитные секторные масс-анализаторы
    • 2. 3. 2. Времяпролетные масс-анализаторы
    • 2. 4. Методики определения количества белка с использованием f масс-спектрометрии
  • 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Получение аминокислотных стандартов
    • 3. 2. Количественный анализ аминокислот
      • 3. 2. 1. Количественный анализ аминокислот с использованием
  • ESI-MS.'
    • 3. 2. 2. Количественное определение аминокислот с использованием MALDI-MS
    • 3. 3. Определение количества белков
    • 3. 3. 1. Определение количества белка с помощью ESI-MS
    • 3. 3. 2. Определение количества белков с помощью MALDI-MS
    • 3. 3. 3. Использование масс-спектрометрии при изучении функциональных свойств протеиназ
  • 4. Материалы и методы
  • ВЫВОДЫ

Исследование дискриминации ионообразования в электроспрее и Maldi методах ионизации для количественного анализа белков (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

В настоящее время масс-спектрометрия является ключевым инструментом в исследованиях в области химии белка. Особенно это относится к идентификации различных пептидов и белков, аминокислотная последовательность которых может быть взята из различных баз данных, либо предсказана наосновании генома. Однако для понимания физиологических процессов на молекулярном уровне важным является не только идентифицировать отдельные белки, но и количественно оценить их содержание в биологических средах. Это вызвано, прежде всего, тем, что изменение концентраций отдельных белков определяет состояние живых организмов. Для анализа теромолабильных и труднолетучих соединений, к которым и относятся белки, наиболее часто используют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (Electrospray Ionization Mass-Spectrometry, ESI-MS) и ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix-Assisted Laser Desorptioiyionization Mass-Spectrometry, MALDI-MS). Оба этих масс-спектрометрических метода, по причине дискриминации ионообразования и конкуренции за протон между отдельными компонентами смеси веществ, не позволяют определять количественные параметры. Работы в этом направлении с использованием именно масс-спектрометрии интенсивно развиваются, однако все предлагаемые к настоящему времени подходы связанны с необходимостью дополнительных химических модификаций и созданием в каждом отдельном случае соответствующих стандартов. В связи с этим изучение дискриминации в ионообразовании и ее преодоления в мягких ионизационных методах, таких как ESI и MALDI с целью их адаптации к количественному анализу белков, имеет как теоретическую, так и практическую ценность.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение дискриминации новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI, и использование полученных данных для создания универсальной масс-спектрометрической методики количественного анализа белков и пептидов.

1. Изучить дискриминацию новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.

2. Разработать метод определения количества белков с помощью ESI-MS и MALDI-MS.

3. Апробировать разработанный подход на примере модельных белков в растворе и в геле. '.

Научная новизна работы. Изучена дискриминация новообразования в мягких методах ионизации, таких как ESI и MALDI.

Предложена методика позволяющая обойти проблему дискриминации ионообразования и определить количество белков.

Практическая значимость работы. На основании полученных результатов была разработана методика, позволяющая количественно проанализировать белки на уровне 5 фмоль, без существенной доработки масс-спектрометрических приборов. Кроме того, продемонстрирована возможность определения количественных характеристик пептидов белков, не только предварительно выделенных, но и в смеси содержащей 2−3 компонента.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинарах в ИАнП РАН, на 6-й Пущинской школе-конференции «БИОЛОГИЯ — НАУКА XXI ВЕКА» (г. Пущино, 2002 г.), на III съезде биофизиков России (г. Воронеж, 2004), а так же на Desorption 2004. (S.- Petersburg).

Публикации. По теме диссертации опубликованы две статьи в журнале «Научное приборостроение», статья в журнале Analytical chemistry и материалы трех докладов на конференциях.

ВЫВОДЫ.

1. Изучена дискриминация новообразования в электроспрее (ESI) и MALDI.

2. Разработана и апробирована масс-спектрометрическая методика количественного анализа белков, позволяющая обойти проблему дискриминации ионообразования для мягких методов ионизации (ESI и MALDI).

3. Разработанные методики позволяют использовать стандартные масс-спектрометрические системы (ESI и MALDI) для проведения количественного диализа белков.

4. Предложенная методика количественного определения белков для масс-спектрометрических методов ESI и MALDI позволяет проводить измерение с точностью 5−10%. На уровне от 5 фмоль.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Л.Л. Геном человека и биология XXI века. Вестник академии наук. 2000, том 70, № 5, с.412−424.
  2. Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты. Пептиды. Белки. Под ред. Проф. Ю. В. Митина., М.: Мир, 1983, с. 621.
  3. А. Дарбре. Практическая химия белка. М.: Мир, 1985, с. 456.
  4. J. //Genotypes and phenotypes. Electrophoresis, 1999, v.20, p. 643 652.
  5. Corthals G.L., Wasinger V.C., Hochstrasser D.F. and Sanchez J.C. The dynamic range of protein expression: a challenge, for proteomic research // Electrophoresis. 2000. N 21. P. 1104−1115.
  6. Dunham I., Shimizu N., Roe B.A. et al. The DNA sequence of human chromosome 22 // Nature. 1999. V. 402. P. 489−495.
  7. Venter J.C., Adamd M.D., Myers E. W et al. The sequence of the human genome // Science. 2001. V. 291. P. 1304−1351.
  8. William S. Hancock, Shiaw-Lin Wu, Paul Shieh. The challenges of developing a sound proteomics strategy. Proteomics 2002, v.2, p. 352 -359.
  9. Jasminka Godovac-Zimmermann and Larry R. Brown. Perspectives for mass spectrometry and functional proteomics. Mass Spectrometry Reviews, 2001,20,1−57
  10. Aebersold R. and Mann M. Mass spectrometry-based proteomics // Nature. 2003. V. 422. P. 198−207.
  11. M. Mann, R. C. Hendrickson, A. Pandey. Analysis of proteins and proteoms by mass spectrometry. Annu. Rev. Biochem. 2001. v. 70, p. 437−473.
  12. С. Dass. Principles and practice of biological mass spectrometry. Wiley-interscience. New-York, USA, 2001,416 p.
  13. Edmond de Hoffman and Vincent Stroobant. Mass spectrometry. Principles and Applications. Wiley- interscience. New-York, USA, 2003, 407 p.
  14. J. Qin, B. Chait. Identification and characterization of posttranslational modification of proteins by MALDI ion trap mass spectrometry. — Anal.
  15. Chem. 1997, v.69, p. 4002−4009.
  16. Spengler В., Kirsch D., Kaufmann R. and Jaeger E. Peptide sequencing by matrix-assisted laser-desorption mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992. N 6. P. 105−108.
  17. Mann M., Hojrup P. and Roepstorff P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases // Biol. Mass Spectrom. 1993. V. 22. P. 338−345.
  18. Jensen O.N., Podtelejnikov A.V. and Mann M. Identification of the components of simple protein mixtures by high-accuracy peptide mass mapping and database searching // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 4741−4750.
  19. Zhang W., Chait B.T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 2482−2489.
  20. Krutchinski A.N., Zhang W. and Chait B.T. Rapidly switchable matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray quadrupoletime- of-flight mass spectrometry for protein identification // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000. N 11. P. 493−504.
  21. P. R. Graves, T. A. J. Haystead. Molecular Biologist’s Guide to Proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, v. 66, № 1 p. 39−63.
  22. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O. and Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 850−858.
  23. Shevchenko A., Jensen O.N., Podtelejnikov A.V. et al. Linking genome andproteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. V. 93. P. 14 440−14 445.
  24. Hanno Steen. Mass Spectrometric Analysis of Protein Modifications. PhD Thesis, University of Southern Denmark, Odense, Denmark, 2001.
  25. Gottfried J. Feistner, Kym F. Faull, Douglas F. Barofsky, Peter Roepstorff. Mass Spectrometric Peptide and Protein Charting. J. Mass Spectrom., 1995, v.30, p. 519−530.
  26. S. D. Patterson, R. Aebersold. Mass spectrometric approaches for the identification gel-separated proteins. Electrophoresis, 1995, v. 16, p. 17 911 814.
  27. E.P., Mirgorodskaya O.A., Dobretsov S.V., Shevchenko A.A., Dodonov A.F., Kozlovskiy V.I., Raznikov V.V. // Electrospray mass-spectrometric study of melittin trypsinolysis by a kinetic approach. Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 2864−2869.
  28. Mirgorodskaya O., Kazanina G., Roepstorf P., Mirgorodskaya E.,
  29. Т., Vorotyntseva Т., Miroshnikov A., Alexandrov S. // Acomparative study of the specificity of proinsulin hydrolysis by duodenase, trypsin and plasmin. Prot. and Peptide Letters. 1998. V. 5. P. 27−32. i
  30. K. Gevaert, J. Vandekerckhove. Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis 2000, v. 21, p. 1145−1154.
  31. William S. Hancock, Shiaw-Lin Wu, Paul Shieh. The challenges of developing a sound proteomics strategy. Proteomics 2002, v.2, p. 352 -359.
  32. Electrospray Ionization Mass Spectronmetry: Fundamentals, Instrumentation and Applications / Ed. Cole R.B. NY.: Willey, 1997.
  33. N. B. Cech, C. G. Enke. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals. Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 362−387.
  34. Renato Zenobi, Richard Knochenmuss. Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Reviews, 17, 337−366, 1998.
  35. Dole. M., Mack, L.L., Hines, R.L. Molecular Beams of Macroions. Journal of Chemical Physics, 49, 1968, pp2240−2249.
  36. С.И.Шевченко, А. И. Григорьев, C.O. Ширяева. Электродинамическое распыление жидкости. Научное приборостроение. 1991, Том1, № 4, стр 3−21.
  37. L.D.Ferguson, iM.B.Alice, M. Dole, L.L.Mack, R.L.Hines, L.D.Mobley Molecular Beams of Macroions.- J.Chem.Phys. v.52, 1970, № 10, p.4977−4986.
  38. M.Dole, H.L.Cox, J. Gienic Electrospray Mass Spectrometry -Adv.Chem. Ser.1255, 1975, p.73−84.
  39. L.L.Mack, K. Nakamae, C. Guptu Electrospray Mass Spectrometry of Macromolecules, Application of an Ion Drift Spectrometer. -Biomed. Mass Spectrom., vl 1,1984, p.259−269.
  40. J.V.Iribarne, B.A.Thomson On the Evaporation of Small Ions Irom Charged Droplets.- J.Chem.Phys. v.64, 1976, № 8, p.2287.
  41. B.A.Thomson, J.V.Iribarne Field Induced Ion Evaporation from Liquid Surfaces at Atmospheric Pressure — J.Chem.Phys, v.7, 1979, & 1, p.4451−4463.
  42. B.A.Thomson, J.V.Iriburne, P. Dziedzic Liquid Ion Evaporation /Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry for Detection of Polar Labile Molecules.- Anal.Chem. v.54, 1982, Jfc 13, p.2219−2224.
  43. B.A.Thomson, J.V.Iribarne, P.J.Dziedzic Atmospheric Pressure1. n Evaporation Mass Spectrometry.- Int.J.Mass Spectrom.Ion., v.50, 983, № 3,p.331−347.
  44. Iribarne J.V., Dziedic P.J. and Thomson B.A. Atmospheric Pressure Ion Evaporation Mass Spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1983. V. 50. P. 331−347.
  45. Александров M. JL, Галль Л. Н., Краснов H.B., Николаев В. И., Шкуровi
  46. B.A. и Павленко B.A. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый способ масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ. // ДАН, 1984, т. 277, № 2, с. 379−383.
  47. М. Л., Галль Л. Н., Краснов Н. В., Николаев В.И. иI
  48. В.А. Метод масс-спектрометрического анализа труднолетучих термически нестабильных веществ основанный на экстракции ионов из раствора при атмосферном давлении// ЖАХ, 1985, т. 40, № 6, с. 160 172.
  49. М.Л. Александров, Л. Н. Галль, А. Н. Веренчиков, Н. В. Краснов, В. А. Шкуров. Исследование механизма образования катионов в масс-спектрометрии ЭРИАД. Научное приборостроение. 1991, том 1., № 2, стр. 3−36.
  50. Н.В. Краснов, М. З. Мурадымов, С. И. Шевченко. Комплексные исследования характеристик ЭГД распыления жидкости. Научное приборостроение. 1991, том 1, № 1, стр 42−52.
  51. J. В. Fenn, М. Mann, С.К. Meng, С. М. Whitehouse. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science, 1989, v.246, p.64−71.
  52. Дж. Чепмен. Практическая органическая масс-спектрометрия. М.: Мир, 1988, стр. 216.
  53. J.R. Chapman. Practical organic Mass Spectrometry. John Wiley & Sons. Chichester. 1995. p.338.
  54. F. Hillenkamp, M. Karas. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biopolymers. Anal. Chem. 63, 1193A-1202A, 1991
  55. Michael Karas, Matthias Gliickmann and Jurgen Schefer. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky surviv/ors. J. Mass Spectrom. 35, 1−12, 2000.
  56. R. Knochenmuss, A. Stortelder, K. Breuker and R. Zenobi. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization, J. Mass Spectrom., v. 35, 1237−1245 (2000).
  57. Scott E., Van Bramer. An introduction to Mass Spectrometry. Review 1998.
  58. Д. Физическая биохимия. Пер с англ. М.: Мир 1980, 581с.
  59. Э., Йенсен Э. Хатиб С., Левин С., Миллер Г. Р., Оган К., Пул К.Ф., Риз Ч. Е., Скотт Р.П.У., Уден П. К. Количественный анализ хроматографическимим методами. Пер. с англ. М.: Мир, 1990, 320с.
  60. Г. Инструментальные методы химического анализа. М. Мир, 1989, 608с.
  61. С. L. Nilsson, P. Davidsson. New separation tools for comprehensive studies of protein expression by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2000, v.19, p.390−397.
  62. Boyd, R. K., J. D. Henion, M. Alexander, W. L. Budde, J. D. Gilbert, S. M. Musser, C. Palmer, and E. K. Zurek. «Mass spectrometry and good laboratory practices». J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1996- 7:211−218.
  63. X. Zhu, and D.M. Desiderio,. Peptide quantification by tandem mass spectrometry. Mass, Spectrometry Reviews 15:213−240, 1996
  64. D.M. Desiderio, X. Zhu. Quantitative analysis of methionine enkephalin and beta-endorphin in the pituitary by liquid secondary ion massspectrometry and tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 794, 85−96. Review. (1998).i
  65. Mann M. Quantitative proteomics? Natural biotechnology, 1999, v. 17- 954−955.
  66. Gygi S. P, B. Rist, Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat. Biotechnol. 1999, v. 17, p.994−999.
  67. Smolka M.B., Zhou H., Purkayastha S. and Aebersold R. Optimization of the isotope-coded affinity tag-labeling procedure for quantitative proteome analysis // Anal. Biochem. 2001. V. 297. P. 25−31.
  68. Mahmoud Hamdan and Pier Giorgio Righetti. Modern strategies for protein quantification in proteome analysis: advantages and limitations. Mass Spectrometry Reviews, 2002, v.21, p. 287−302.
  69. Oda Y., Huang K., Croos F.R., Cowburn D., Chait B.T. Accurate quantitation of protein expression and site specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, v. 96, p.6591−6596.
  70. O.A., Козьмин Ю. П., Титов М. И., Савельева Н. В., Кернер Р., Сонксэн К., Мирошников А. И., Ройпсторфф П. // Использование MALDI-MS для количественного анализа пептидов и белков. Биоорганическая химия, Москва 2000. Т. 26. С. 662−671.
  71. Yao X., Freas A., J. Ramirez P., Demirev P.A., Fenselau C. // Proteolitic1Я
  72. О Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 2001. V73. P 2836−2842
  73. Wilm M. and Mann M. Analytical properties of the nanoelectrospray ion source//Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 1−8.i
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!