Изучение нейропротективной активности рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в полимерные носители

Актуальностьтемы. Заболевания, сопровождающиеся нейродегенеративными процессами, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, различные деменции, травматические и токсические поражения головного мозга, инсульты являются одной из ведущих причин инвалидицации и смерти пациентов. Несмотря на наличие значительного количества лекарственных средств для лечения этих состояний, проводимая в настоящее время* терапия недостаточно эффективна и требуются новые подходы к разработке препаратов с нейропротективной активностью. Один из современных подходов к поиску эффективных нейропротекторов основан на использовании патогенетических механизмов нейродегенерации и эндогенных защитных реакций организма.

В настоящее время накоплены обширные сведения о цитокинахмолекулах, которые: являются" посредниками межклеточных: взаимодействийрегулируют кроветворениеиммунный ответ, клеточный цикл в различных тканях, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Широко/известным и применяемым является гемопоэтический ростовой фактор

— эритропоэтин (ЭПО). В медицинской: практике для лечения анемий: различного генеза используется рекомбинантный эрйтропоэтин человека (РЭЧ). Помимо регуляции эритропоэза, ЭПО проявляет широкий спектр защитных функций в организме, участвует в защите мозга от повреждения. ЭПО и рецептор к нему (РЭПО) экспрессируются в центральной и периферической нервной системе, принимая активное участие в эмбриональном развитии млекопитающих и человека^и Н., 1999]. Показано, что при периферическом введении РЭЧ оказывает выраженные протекторные эффекты на поврежденную различными факторами церебральную ткань через активацию антиапоптотических генов, запуская антиоксидантные и противовоспалительные механизмы в нейронах, глиальных и цереброваскулярных эндотелиальных клетках, стимулирует ангиои нейрогенез [Siren A.L., 2001, Leist M., 2004, Belayev L., 2005]. Вместе с тем, в связи с низким проникновением РЭЧ через гематоэнцефалический барьер эти свойства препарата выявляются только в высоких дозах, в 20−100 раз превышающих терапевтические, что часто приводит к развитию побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы (повышение артериального давления), повышается риск тромбообразования [Ehrenreich H., 2009, Krapf R., 2009, Vaziri N.D., 2001].

В последнее время все большее внимание уделяется исследованиям, направленным на разработку т ранспортных систем для адресной доставки лекарственных препаратов в различные органы и ткани. Одним из таких способов является включение веществ в полимерные с истемы доставки [Аляутдин Р.Н., 2001, Воронина Т. А., 2008., Гельперина С. Э., Швец В. И., 2009], в частности, использование поли (бутил)цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА) покрытых сурфактантами (полисорбатом-80) и наночастиц «на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА) [Kim H.R., 2007, Гельперина С. Э., 2011]. На основе ПБЦА наночастиц в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг разрабатываются такие препараты, как ванкамицин, ампициллин [Kreuter J., 1994], мет-энкефалин [Ramge, Kreuter,.

2000], лей-энкефалин [Ramge, 2001] и доксорубицин [Gelperina., 2003], который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США и Европе. ПЛГА были использованы для доставки в мозг доксорубицина и лоперамида [Tosi G., 2007].

Показано, что при введении веществ в полимерные наночастицы (ПБЦА, ПЛГА) повышается биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия-лекарственных препаратов, а также снижаются их побочные эффекты и токсичность [Kreuter J., 2003, Воронина Т. А., 2008]. В НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН в течение многих лет проводятся исследования по созданию препаратов, обладающих нейропротективной активностью, разработана методология поиска нейропротективной активности у новых веществ и известных препаратов [Середенин С.Б., 2007, Гарибова Т .Л., 2008, Островская Р. У., Гудашева Т. А., 2009, Ковалев Г. И., 2009, Мирзоян P.C., 2010, Воронина Т. А., 2010]. В связи с этим представляется актуальным изучение нейропротективного действия РЭЧ и его наносомальных форм.

Целью исследования явилось экспериментальное изучение нейропсихофармакологической активности РЭЧ, включенного в наночастицы на основе ПБЦА и ПЛГА.

Задачи исследования.

1. Разработать методику включения РЭЧ в наночастицы на основе поли (бутил)цианоакрилата и*сополимеров молочной и гликолевой кислот.

2. Разработать подходы к стандартизации наносомальных форм РЭЧ на основе поли (бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и? гликолевой кислот. '.

3. Изучить возможность проникновения ПБЦА и ПЛГА наночастиц с включенным в их состав РЭЧ через гематоэнцефалический барьер, используя метод имму, но ферментного анализа.

4. Исследовать противогипоксический эффект РЭЧ, включенного' в ПБЦА и ПЛГА наночастицы, в сравнении с нативным РЭЧ.

5. Изучить нейропротективные свойства РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) в сравнении с нативным РЭЧ.

6. Изучить влияние РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, на уровень экспрессии мРНК нейротрофических факторов BDNF и NGF.

Научная* новизна. Впервые разработаны методики включения РЭЧ в носители на основе ПБЦА и ПЛГА наночастицпроведена стандартизация полученных наносомальных форм РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы. Показана возможность доставки РЭЧ в мозг. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) установлено, что концентрация РЭЧ в головном мозге мышей при использовании наносомальной формы на основе ПБЦА наночастиц значительно превышает концентрацию нативного РЭЧ.

Впервые выявлены нейропсихофармакологические свойства наносомальных форм РЭЧ. Показано, что РЭЧ, включенный/в ПБЦА наночастицы, покрытые полисорбатом-80, как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном введении обладает противогипоксическим эффектом и нейропротективными свойствами. На модели геморрагического инс ульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой1 выявлена способность наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц предотвращать гибель животных, у меныиать неврологические дефициты, улучшать ориентировочно-исследовательское поведение и память.

Выявлен один из механизмов нейропротективного действия новой наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. С помощью метода полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции показано, — что наносомальная форма РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц в опытах in vivo значительно увеличивают экспрессию' генов&rsquoнейротрофинов BDNF и NGF в фронтальной коре и гиппокампе крыс. ,.

Научно-практическая^ значимость. Разработанные методики включения' ч.

РЭЧ в полимерные наночастицы и подходы к стандартизации могут, быть в дальнейшем использованы для создания' новой формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. Результаты эффективности эритропоэтина, включенного в ПБЦА наночастицы, как нейропротектора, открывают перспективу для исследований по разработке и внедрению новой наносомальной формы эритропоэтина в качестве препарата для лечения заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией. •.

Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные формы нанокапсулированного эритропоэтина и проведено их фармакологическое изучение, разработана и апробирована методика определения концентрации эритропоэтина в тканях головного мозга, изучены потенциальные механизмы нейропротективного действия РЭЧ, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

На втором международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2009) Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург 2010).

VII Международной научно-практической конференции «Наука и современность» (Новосибирск 2010) ‘.

11th European, college of neuropsychopharmacology Regional Meeting (St. Petersburg 2010) ' ,.

III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград 2011) •.

Публикации ,.

По материалам диссертации опубликовано 3- статьи и. 5 тезисовв материалах российских и международных конференций.

Объемьи структура диссертации.

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающий 26 отечественных и 303 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 3 схемами и 21 рисунками. ю.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные методики включения РЭЧ в наночастицы на основе поли (бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот позволяют получить новые формы РЭЧ, проникающие через ГЭБ.

2. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, обладает противогипоксическим действием на моделях гипоксии с гиперкапнией, гипобарической гипоксии и противоинсультным действием на модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

3. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, при внутривенном введении способен стимулировать экспрессию нейротрофических факторов КОБ и ВОКБ во фронтальной коре и гиппокампе мозга крыс.