Иммунофенотипическая и морфоцитохимическая характеристика острых миелоидных лейкозов с экспрессией антигена стволовых клеток CD34

Диагностика острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) традиционно основывается на сравнительных морфологическом, цитохимическом и иммунофенотипическом принципах. Властные клетки гранулоцитарных лейкозов имеют сходство с нормальными клетками гранулоцитарной линии по наличию зернистости и активности фермента миелопероксидазы (МПО). Монобластные лейкозы сходны с нормальными клетками этой линии по морфологии клеток, форме ядра и активности фермента неспецифической эстеразы. На основании степени выраженности морфоцитохимических признаков выделяют варианты ОМЛ, различающиеся по степени дифференцированности бластов (МО-МЗ, М5а, М5б и т. д.). При отсутствии четких морфоцитохимических характеристик бластов важную роль в диагнозе имеет иммунофенотип, подтверждающий миелоидную природу лейкоза и степень зрелости бластных клеток. Особенно важную роль иммунофенотипирование играет при эритробластных (Мб), мегакариобластных (М7) и i.

ОМЛ с минимальной дифференцировкой (МО).

Важно подчеркнуть, что морфологические и цитохимические признаки позволяют идентифицировать наиболее зрелую фракцию бластных клеток, имеющих четкие признаки той или иной гемопоэтической линии. Вместе с тем, установление линейной принадлежности бластов не дает информации относительно уровня злокачественной трансформации и структуры лейкозного клона.

При современной интенсивной полихимиотерапии ОМЛ прогностическая роль большинства традиционных клинических, гематологических и морфоцитохимических (ФАБ-вариант) признаков в прогнозе ОМЛ нивелируется [Маркина И.Г. и др., 2001]. Все это диктует необходимость поиска новых молекулярных критериев диагностики и прогноза ОМЛ.

В современной классификации ВОЗ 2001 г. наряду с традиционными морфоцитохимическими и иммунофенотипическими признаками бластных клеток учитываются молекулярные и цитогенетические характеристики, такие как наличие повторяющихся хромосомных аберраций и специфических изменений (дисплазии) клеток остаточного миелопоэза.

Наряду с этим в литературе широко освещаются вопросы изучения возможностей использования в диагностике показателей наименее зрелой фракции OMJI. Современные методы позволяют идентифицировать ранние CD34+ предшественники и проводить их детальный иммунофенотипический и функциональный анализ. Перспективность изучения фракций стволовых клеток в лейкемическом клоне определяется следующими положениями:

1. Во фракции CD34+ бластных клеток при OMJI находятся лейкозные стволовые клетки. Существуют данные [Hassan Н.Т. et al., 1996, Costello R.T. et al., 2000] о том, что от уровня их представительства в лейкозном клоне и степени их эрадикации в ходе терапии зависят результаты лечения в целом.

2. С фракцией CD34+ клеток в лейкозном клоне достоверно часто ассоциируется аберрантный иммунофенотип злокачественных клеток и экспрессия линейно не свойственных антигенов, что может служить основой для мониторинга минимальной резидуальной болезни (МРБ) [Macedo A. et al., 1995, Bahia D.M. et al., 2001].

3. Многочисленными работами показана ассоциация резистентности бластов с наличием фракции CD34+ лейкозных клеток, что может определять неудовлетворительные результаты лечения этих больных [Legrand О. et а1., 2004].

4. Одним из методов лечения больных OMJI является высокодозная химиотерапия с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Это требует четкой характеристики CD34+ стволовых клеток с целью разграничения нормального и лейкозного клонов [Burnett А.К. et al., 1998, Harousseau J.L. et al., 1997, Cassileth P.A. et al., 1998].

Проведение анализа, направленного на характеристику наиболее «ранней» фракции бластных клеток, стало возможным с открытием специфического маркера стволовых клеток — антигена CD34 — в середине 80-х годов.

Относительно влияния на прогноз данные по экспрессии CD34 противоречивы: одни авторы указывают на неблагоприятный прогноз СВ34-позитивных случаев [Wells S.J. et al., 1996, Hassan H.T. et al., 1996], обратную корреляцию с частотой полных ремиссий [Solary Е. et al., 1992], другие не отмечают связи с прогнозом [Ciolli S. et al., 1993]. Определенную роль играет не только процентное содержание CD34+ бластов в лейкозном клоне, но и уровни экспрессии антигена [Rigolin G.M. et al., 1995].

Многочисленные работы показали неблагоприятную прогностическую роль экспрессии CD34 при ОМЛ [Raspadori D. et al., 1997, Costello R. et al., 1999]. Эти данные подтверждены исследованиями, проводимыми в клинике ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН [Маркина И.Г., 2000, Баранова О. Ю., 2003].

Следует отметить, что возможности исследования наименее зрелого компонента бластных клеток при ОМЛ весьма ограничены, однако, помимо CD34, в последние годы к маркерам бластных клеток добавились такие как АС 133, CD 117 (в сопоставлении с другими общемиелоидными маркерами), а также целый ряд линейно не рестриктированных антигенов — HLA-DR, CD71, CD3 8 и т. д.

Таким образом, исследование наиболее ранней фракции бластных клеток ОМЛ, экспрессирующих антиген CD34, представляется в настоящее время актуальным.

Цель работы.

Целью работы является установление морфоцитохимических и иммунофенотипических особенностей острых миелоидных лейкозов с экспрессией антигена стволовых клеток CD34.

Задачи исследования.

1. Дать подробную сравнительную морфоцитохимическую и иммунофенотипическую характеристику бластов при С034-позитивном и CD34-негативном OMJ1.

2. Оценить частоту и уровни экспрессии антигена CD34 при разных вариантах OMJ1.

3. Определить взаимосвязь экспрессии антигена CD34 с морфоцитохимическими и иммунофенотипическими характеристиками бластов различных линий (гранулоцитарных, монобластных, эритроидных, мегакариобластных).

4. Исследовать частоту встречаемости бластов с фенотипом лейкемических стволовых клеток (JICK) CD34+CD3 8″ при различных ФАБ-вариантах OMJL.

5. Оценить дисплазию клеток гранулоцитарного, эритроидного и мегакариоцитарного ростков при СВ34-позитивном и СБ34-негативном OMJ1.

Научная новизна.

На основе проведенных исследований показана значимость определения стволовоклеточного антигена CD34 на бластах при OMJI. Дана морфоцитохимическая и иммунофенотипическая характеристика ранних лейкемических предшественников в пределах каждой гемопоэтической линии (гранулоцитарной, монобластной, эритроидной). Оценка вовлеченности стволовоклеточного компартмента в лейкозный клон и его пропорции среди бластных клеток дает дополнительную научную информацию к пониманию мишеней злокачественной трансформации и уровней блока дифференцировки бластных клеток при острых миелоидных лейкозах. Установлена взаимосвязь между экспрессией стволовоклеточного антигена CD34 и наличием отдельных признаков миелодисплазии.

Научно-практическая значимость.

Выявлена и охарактеризована ранняя субпопуляция лейкемических бластов с фенотипом CD34+CD38~. Установлены иммунофенотипические и морфоцитохимические особенности бластов с аберрантным фенотипом, в том числе с асинхронной экспрессией стволовоклеточного антигена и наличием миелопероксидазы (CD34+MIIO+). Полученные данные имеют практическое значение при установлении характеристики бластов, используемой в первичной диагностике ОМЛ, при определении остаточной болезни в период ремиссии и при рецидиве заболевания. Детальная характеристика лейкемических стволовых клеток позволит в будущем выявить их отличия от нормальных стволовых клеток, что может явиться основанием для последующих разработок таргентной терапии ОМЛ.

Выводы.

1. На основе мембранного антигена стволовых клеток CD34 бластные клетки при ОМЛ могут быть разделены на 2 типа — менее зрелые (CD34+) и более зрелые (CD34-) по большинству морфоцитохимических и иммунофенотипических признаков.

2. СВ34-позитивные ОМЛ характеризуются достоверно более низким содержанием в лейкозном клоне морфологически дифференцированных миелобластов с зернистостью (р=0,000) и монобластов с типичной моноцитоидной формой ядер (р=0,001) по сравнению с С034-негативными.

3. Отличительными цитохимическими признаками СБ34-позитивных ОМЛ являются низкая активность миелопероксидазы при МО-МЗ ОМЛ (р=0,003) и ингибируемой а-нафтилацетат эстеразы при М4-М5 (р=0,006), а также сниженное содержание липидов (р=0,005) и PAS-положительного вещества в диффузной форме (р=0,000).

4. Иммунофенотипической особенностью CD34+ по сравнению с CD34- ОМЛ являются более высокие уровни экспрессии маркеров ранних этапов гранулоцитарной дифференцировки — HLA-DR (р=0,000) и CD38 (р=0,000).

5. Примерно в четверти случаев (23,4%) ОМЛ обнаруживаются бласты с фенотипом стволовых лейкозных клеток CD34+CD38″. Эта фракция наиболее выражена при МО (33,3%) и М2 (35,3%), отсутствует при МЗ и присутствует с промежуточной частотой (14,3−25,0%) при остальных вариантах ОМЛ.

6. Установлена прямая корреляционная зависимость экспрессии антигена CD34 с молекулой CD13 (р=0,01) и обратная с CD33 (р=0,000). Это позволило выявить новый иммуноподвариант ОМЛ — CD34 CD13 CD33', характерный для незрелых миелоидных лейкозов МО и Ml.

7. Для СВ34-позитивного ОМЛ более характерен, в сравнении с С034-негативным, аберрантный иммунофенотип бластов:

• с коэкспрессией лимфоидных антигенов CD7 и CD 19,.

• с коэкспрессией эритроидных и мегакариоцитарных маркеров при гранулоцитарных и монобластных лейкозах,.

• отсутствием FcyRI (CD64) при монобластных вариантах,.

• с коэкспрессией CD34 и МПО в 11,1% случаев ОМЛ.

Эти признаки могут использоваться для моноторинга минимальной остаточной болезни.

8. Для ОМЛ с экспрессией антигена стволовых клеток CD34 характерна дисплазия клеток гранулоцитарного ростка, выявляемая почти вдвое чаще, чем в CD34-негативном. Установлена достоверная прямая корреляция пропорции CD34+ бластов с наличием пельгероидных форм нейтрофилов (р=0,002).