Гормональная регуляция заключительных стадий оогенеза у низших позвоночных животных: Теоретические и практические аспекты

Содержание

• Актуальность темы

Гормональная регуляция оогенеза низших позвоночных животных на протяжении многих десятилетий остается в поле зрения многочисленных исследователей. Многие аспекты этой проблемы неоднократно освещались в обзорах, в том числе и в последнее время (Jalabert et а!., 1991- Redding, Patino, 1993- Nagahama, 1994- Specker, Sullivan, 1994- Nagahama et al., 1995- Tyler, Sumpter, 1996).

Несмотря на существенные успехи в исследовании механизмов гормональной регуляции двух заключительных этапов оогенеза — вителлогенеза и созревания ооцитов, малоизученным и малопонятным остается механизм, регулирующий переход от одного процесса к другому. Известно, что оба эти процесса происходят только при наличии в крови гонадотропного гормона (ГТГ). В период вителлогенеза ГТГ стимулирует образование стероидогенными клетками яичника эстрогенов, которые, в свою очередь, запускают и поддерживают синтез вителлогенина в печени. Вителлогенин поступает в яичник по кровеносной системе и поглощается ооцитом с помощью специфических рецепторов. Созревание ооцитов и овуляция у большинства видов запускается внешним стимулом, или стимулами, такими как фотопериод, температура, наличие нерестового субстрата, брачного партнера и т. д. Этот внешний стимул, воспринимаемый нервной системой через органы чувств, активирует деятельность отделов гипоталамуса, вырабатывающих и секретирующих гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ). Он стимулирует синтез и секрецию ГГГ, и концентрация ГТГ в крови за относительно короткий срок повышается в десятки п сотни раз. Этот выброс гормона и вызывает два сопряженных, но времени процесса -созревание ооцита и овуляцию.

Благодаря тому, что уже достаточно давно сначала для амфибий, а зачем и л ля рыб, созревание ооцитов научились воспроизводить in iiro. исследователям удалось выяснить механизм действия ГТГ в этот период. Было показано, что ГТГ действует не прямо на ооцит, а опосредованно, стимулируя образование и секрецию клетками ленки фолликула (ооцита, одетого оболочками) мейоз-индунирующего стероида, который запускает цепь теперь уже хорошо известных биохимических реакций. преобразующих ооцит в зрелую яйцеклетку (Nagahama et al., 1995). Показано, что у большинства изученных видов амфибий в этой роли выступает прогестерон, а у рыб 17а, 20р-дигидрокси-4-прегнен-3-он (17а, 20р-ДГП) (Jalabert et al., 1991).

Однако оставалось неясным, почему до определенного периода 1ТГ поддерживает процесс вителлогенеза, а в какой-то момент запускает процессы созревания и овуляции ооцитов. Теоретически можно было допустить существование четырех альтернативных механизмов перехода ооцитов от вителлогенеза к созреванию.

1. Каждый из этих процессов регулируется своим специфическим ГТТ, и в определенный момент оогенеза происходит смена индуктора.

2. ГГГ один. Характер же процесса, происходящего при его участии, определяется количеством гормона.

3. Гонадотропин или гонадотропины не вызывают переход от одного процесса к другому, а лишь регулируют скорость процессов. Сама же смена процессов происходит благодаря изменению ответа реагирующей системы, происходящему в результате самодифференцировки фолликула.

4. Роль ГТГ та же, что и в предыдущей модели, однако изменение ответа реагирующей системы происходит под влиянием какого-то (не относящегося к гонадотропинам) эндогенного, либо экзогенного фактора (например, температуры).

Для проверки этих гипотез необходимо было получить в очищенном виде и изучить свойства ГТГ.

Начиная с 60-х годов начали появляться работы по очистке ГТГ рыб, при этом авторы обнаруживали только один гормон, способный как поддерживать вителлогенез, так и индуцировать созревание и овуляцию ооцитов (Bursawa-Gerard, Fontaine, 1965- Yamazaki, Donaldson, 1968). Таким образом, казалось, что первая гипотеза может больше не приниматься в расчет. Однако позднее были получены неоспоримые доказательства существования у рыб двух ГТГ, различающихся как по структуре, так и по некоторым биологическим свойствам (см. Tyler, Sumpter, 1996). Тем не менее, их роль в регуляции вителлогенеза и созревания ооцитов остается пока не вполне выясненной. Два ГТГ, гомологичные фолликулостимулирующему (ФСГ) и лютеинизируюшему (ЛГ) гормонам млекопитающих и других высших позвоночных, были найдены и у амфибий еще раньше, однако их роль в регуляции гаметогенеза также остается малопонятной (Polzonettimagni et al., 1998).

Рассматриваемое направление исследований всегда было тесно связано с практикой разведения видов, используемых в народном хозяйстве, или в учебных и исследовательских целях. Неудачи, периодически возникающие при использовании методов гормональной стимуляции созревания половых продуктов, со всей очевидностью показывают несовершенство наших знаний в этой области.

Цели исследования

Целью нашего исследования было изучение гормональной регуляции заключительных этапов оогснеза у представителей двух классов низших позвоночных животных — амфибий и рыб, в частности, осетровых. Была поставлена задача выявить закономерности становления компетенции созревания и попытаться выяснить, какие эндогенные и экзогенные факторы влияют на этот процесс. Для изучения механизма действия ГТГ у осетровых рыб представлялось важным получить гормон в очищенном виде, изучить его физико-химические и биологические свойства и сравнить их со свойствами ГТГ карпа, как наиболее изученного ГТГ костистых рыб. Для проведения этих исследований необходимо было разработать высокочувствительный метод определения гонадотропной активности, а для изучения механизма действия ГТГ подобрать среду культивирования фолликулов осетровых рыб, которая позволяла бы in vitro получать индуцированное ГТГ созревание ооцитов.

Предполагалось также, опираясь на полученные результаты, разработать новые методические подходы, позволяющие повысить эффективность искусственного размножения низших позвоночных животных и, в частности, осетровых рыб

Научная новизна

При изучении становления способности фолликула в целом и ооцита в отдельности реагировать на соответствующие гормональные стимулы впервые обнаружено подавляющее действие гормонов гипофиза на созревание оонитон травяной лягушки, вызываемое in vitro прогестероном. Выяснено, что этот эффект воспроизводится и на других видах амфибий и на осетровых рыбах. Показано, что подавляющий эффект, так же как и стимулирующий, опосредован активностью клеток стенки фолликула. Получены данные, указывающие на то, что посредником подавляющего действия может быть цАМФ.

Впервые получен в высокоочищенном виде ГТГ представителя осетровых рыб -севрюги и изучены его физико-химические и биологические свойства. Обнаружено явление полиморфизма ГТГ севрюги. Получены фракции гормона, не содержащие общих изоформ, и показано, что в их действии есть качественные различия. Проведено сравнение ГТГ карпа и севрюги и показаны различия их физико-химических свойств и качественные различия к биологическом действии. Показано, что один и тот же ГТГ оказывает и подавляющее и стимулирующее действие на созревание ооцитов.

Впервые обнаружена высокая чувствительность осетровых рыб к структурному аналогу гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) млекопитающих.

Сформулированы представления, согласно которым основной механизм регуляции перехода ооцитов к созреванию сходен у позвоночных животных и связан с существованием более или менее выраженного периода компетенции созревания, во время которого ГТГ оказывает двойное (стимулирующее и подавляющее) действие, а созревание ооцита происходит, когда их соотношение меняется в пользу стимулирующего действия.

Практическая ценность

Разработан высокоточный и высокочувствительный метод сравнительного количественного определения гонадотропной активности гипофизов низших позвоночных, и, в частности, осетровых рыб. Предложен критерий отбора самок осетровых рыб, пригодных для получения качественных половых продуктов. Разработан и внедрен в практику промышленного осетроводства новый метод получения зрелых половых продуктов, основанный на применении суперактивного синтетического аналога ГнРГ. Разработаны методы гормональной стимуляции процессов размножения для ряда видов амфибий, в том числе редких и исчезающих.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Межлабораторном эмбриологическом семинаре ИБР, на Международных (Москва, 1969, Патрас, 1980) и Всесоюзных эмбриологических конференциях (Москва, 1981). на Всесоюзных совещаниях по осетроводству (Астрахань, 1969, 1979, 1984, 1986), на Всесоюзной конференции по раннему развитию рыб (Киев, 1978), на Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Вильнюс, 1985), на Международных конференциях и симпозиумах по сравнительной эндокринологии (Монпелье, 1971- Найроби, 1974- Левен, 1990- Руан, 1996), на Конференциях европейских герпетологов (Прага, 1985- Будапешт, 1991), на Всемирном конгрессе по герпетологии (Кентербери, 1989). на Международных симпозиумах по осетровым рыбам (Бордо, 1989- Москва, 1993- Пьяченца, 1997), на Всесоюзном совещании по зоокультуре (Москва, 1986), на Всесоюзном совещании по репродуктивной физиологии рыб (Минск, 1991), на Международной конференции по разнообразию и сохранению осетровых рыб (Нью-Йорк, 1994), а также в ряде отечественных и зарубежных научно-исследовательских институтов.

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д. П. Филатова Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН, в Лаборатории общей и сравнительной физиологии Музея естественной истории (Париж, Франция), в Лаборатории биологии размножения рыб Университета Бордо 1 (Франция) и в Национальном центре по совершенствованию управления сельским хозяйством, лесными и водными ресурсами (СЕМАОЯЕР), группа Бордо (Франция).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследования. Основные опыты, связанные с изучением механизма гормональной регуляции заключительных этапов оогенеза, выполнены на фолликулах осетровых рыб (севрюги Acipenser stellalus русского A. gueldenstaedti, сибирского A. baeri и персидского A. persicus осетров) и амфибий (травяной лягушки Rana temporaria и зеленой жабы Bufo viridis). Этих представителей разных классов позвоночных животных объединяет не только сходное строение ооцитов, но и четкая сезонность процесса размножения. Процессы вителлогенеза и созревания ооцитов у них разделены во времени. Достигшие дефинитивного размера ооциты долгое время (для амфибий — это большая часть периода зимовки, а для осетровых -период миграции на нерестилища) находятся в состоянии компетенции созревания, то есть способны реагировать созреванием на воздействие гормонов. Выбор этих объектов исследования был связан с тем, что путем сопоставления закономерностей и механизмов гормональной регуляции у достаточно удаленных в таксономическом плане видов можно выявлять общие и, следовательно, наиболее консервативные элементы системы, возможно, участвующие в регуляции этих процессов у более широкого круга позвоночных животных. С другой стороны, изучение видов, имеющих экономическую ценность, к которым несомненно относятся осетровые рыбы, могло дать результаты, полезные для практики их искусственного разведения.

В ходе исследований возникала необходимость проверки выявленных закономерностей или решения определенных задач на более широком круге объектов. В связи с этим некоторые работы были проведены и на нескольких видах костистых рыб. Особенно же круг объектов был расширен, когда возникла необходимость разработки универсального метода для индукции процессов размножения у редких, исчезающих и «проблемных» видов амфибий.

Культивирование фолликулов амфибий и осетровых рыб. При проведении опытов in vitro для культивирования фолликулов бесхвостых амфибий был использован раствор Рингера для холоднокровных (Rugh, 1962), а для осетровых рыб сначала среда, предложенная М. Н. Скоблиной (1971), а затем модификация раствора Рингера (Гончаров, 1978). Фолликулы осетровых рыб и амфибий культивировали в маленьких чашках Петри или стеклянных пузырьках в 7,5, 5, или 2 мл среды по возможности при постоянной температуре. Прогестерон вносили в сухие чашки в виде спиртового раствора и после испарения спирта заполняли чашки средой.

Прогестерон использовали в концентрации 5 или I мкг/мл. Экстракт гипофиза ('31) готовили из гомогенизированных гипофизов, либо непосредственно перед этим извлеченных, либо ацетонированных. Время экстракции составляло около 1 ч при комнатной температуре В случае амфибий культивировали небольшие фр-н менты яичника, содержащие от одного до шести фолликулов, а в случае осетровых рыб одиночные фолликулы. Критерием созревания служило разрушение оболочки зародышевого пузырька (ядра ооцита), которое регистрировали при разрезании под бпнокуляром фиксированных кипячением ооцитов. В некоторых случаях использовали дополнительные критерии созревания, такие как способность созревшего ооцита не повреждаться при помещении в воду и способность к активации уколом. Продолжительность процесса созревания ооцитов измеряли в астрономических единицах, если температура культивирования была постоянной, или в т&bdquo- (см. Ое11аП и а! 1993) при переменной температуре культивирования.

Определение продолжительности гормонозависимого периода (ГЗП) созревания ооцита. Сначала продолжительность ГЗП у осетровых рыб определяли путем двукратной отмывки фолликулов модифицированным раствором Рингера Однако после того, как были найдены условия, при которых П’Г не может осуществлять свое действие, а прогестерон способен это делать, был разработан метод (Гончаров, 1978- Гончаров и др., 1997), основанный на переносе фолликулов из модифицированного для осетровых рыб раствора Рингера, содержащего ГТГ, «обычный раствор Рингера для холоднокровных. Поскольку было показано, что продолжительность ГЗП зависит от дозы гормона (Гончаров, 1971а), а стандартных гонадотропных препаратов для низших позвоночных не существует, для получении сопоставимых результатов использовали маточный порошок ацетонированных гипофизов или препарат ГТГ севрюги (с-ГГГ).

Очистка гонадотропного гормона гипофиза севрюги. Для очистки с-ГТГ использовали обычные методы, используемые для очистки белков и, в частности", гликопротеинов. Так, были использованы: спиртовое просачивание, гель-фильтрация, хроматография на ионообменниках, препаративный электрофоре! и абсорбционная хрома roi рафия. Для определения гонадотропной активное m н ходе очистки использовали реакцию спермиации прудовой лягушки (Строганов и Алпатов, 1950- Fontaine, Cliauvel, 1961) и реакцию созревания ооцитов амфибий in vitro (Iornton, 1971- Гончаров, 1971а).

Характеристика физико-химических свойств гонадотроиного гормона гипофиза севрюги. Молекулярную массу очищенного с-ГТГ определяли методом электрофореза в присутствии додецил сульфата натрия (Fairbanks et ai., 1971). Электрофоретическую подвижность фракций с-ГТГ определяли при постановке диск-электрофореза в полиакриламидном геле (7,5%). Аминокислотный состав определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе. Изоэлектрические точки (р!) фракций с-ГТГ определяли с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ) (Winter et al., 1977). После кислотного гидролиза препарата определяли содержание гексоз (Tsugita, Akabori, 1959) и сиаловой кислоты (Warren, 1959). N-концевые аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии (Woods, Wang. 1967).

Статистический анализ. Для сравнения различных количественных характеристик использовали общепринятые статистические методы. Медианную эффективную дозу (Д50) и соотношение активности различных препаратов расчитывали с доверительными интервалами для Р=0,05 (Emmens, 1948). Продолжительность созревания 50% ооцитов (Т50) определяли после преобразование процентов в пробиты (Finney, 1971). Различия показателей альтернативной изменчивости оценивали с помощью теста Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Становление компетенции созревания. После того, как было выяснено, что у амфибий (Masui, 1967- Schuetz, 1967- Smith et al., 1968) и осетровых рыб (Детлаф, Скоблина, 1969) существует двухступенчатый механизм индукции созревания ооцитов, возник вопрос, появляется ли способность ооцитов реагировать созреванием на прогестерон раньше или одновременно со способностью фолликула реагировать созреванием оошгга на действие ГТГ. Попутно, начиная эту работу на травяной лягушке, виде с четко выраженной сезонностью размножения, мы хотели проверить, насколько важными для становления компетенции являются такие факторы как зимовка и достижение ооцитом дефинитивного размера. Самок отлавливали, начиная с июля, и проверяли in vitro способность их ооцитов и фолликулов реагировать на действие соответствующих гормонов. Было показано, что ооцит приобретает компетенцию созревания раньше, чем фолликул, но в обоих случаях до начала зимовки, в тот период, когда ооциты уже практически достигают дефинитивного размера.

Несмотря на то, что понижение температуры до 4 °C (температура зимовки) не является необходимым условием для становления компетенции созревания ооцитов у травяной лягушки, температурный фактор может принимать участие в регуляции гаметогенеза. Об этом свидетельствуют результаты опыта, в котором самки были помещены в температурные условия зимовки за 1,5 месяца до наступления среднего срока естественной зимовки. В этот момент вителлогенез у них не был закончен, и их фолликулы не реагировали ни на прогестерон, ни на гормоны гипофиза. Через три месяца искусственной зимовки ооциты не увеличились в объеме (он составлял 0.59 от дефинитивного объема), но при этом все ооциты приобрели способность реагировать созреванием in vitro на прогестерон, и от 34 до 100% фолликулов реагировали созреванием ооцита на действие гормонов гипофиза.

Таким образом, ни зимовка, ни достижение ооцитом дефинитивного размера у травяной лягушки не являются непременными условиями появления компетенции созревания, хотя понижение температуры и может существенно влиять на соотношение процессов вителлогенеза и созревания. Механизм этого влияния остается до сих пор не вполне ясным.

В опытах rio изучению времени появления чувствительности фолликула и ооцита к гормонам был также использован вариант совместного действия этих гормональных препаратов, поскольку было известно (Masni, 1967), что такое воздействие является более эффективным для индукции овуляции in vitro у самок леопардовой лягушки Rana pipiens, взятых из зимовки задолго до начала нереста. В опытах на фолликулах самок, отловленных до начала зимовки в тот момент, когда их ооциты уже приобрели способность реагировать на прогестерон, а гормоны гипофиза не оказывали стимулирующего действия, было обнаружено, что ЭГ частично или полностью подавляет созревание, вызываемое прогестероном. По мере приближения времени зимовки этот подавляющий эффект исчезал. На основании этих опытов было сделано заключение о том, что становление компетенции созревания у травяной лягушки проходит несколько стаций:

1) ооциты становятся чувствительными к прогестерону, но их реакция подавляется при воздействии на фолликул гормонами гипофиза-

2) то же, но гормоны гипофиза не оказывают ни подавляющего, ни стимулирующего действия-

3) ооциты реагируют созреванием и на прогестерон, и при воздействии на фолликул гормонами гипофиза.

Такие же стадии становления компетенции были найдены и у другого представителя бесхвостых амфибий — озерной лягушки (Rana ridibunda). Интересно, что если у травяной лягушки — вида с единовременным нерестом, в каждый данный момент в яичнике находились фолликулы на одной или двух соседних стадиях компетенции, то у порционно нерестящегося вида — озерной лягушки — на всех грех стадиях. И, наконец, прохождение фолликулами тех же стадий становления компетенции было показано на осетровых рыбах (Гончаров, 19 696).

При сравнении чувствительности фолликулов осетровых рыб к гормонам гипофиза in vitro и in vivo не всегда обнаруживалось соответствие полученных результатов. У некоторых самок фолликулы не отвечали на гормоны гипофиза in vitro, однако после инъекции им суспензии гипофизов происходило созревание ооцитов и овуляция. В связи с этим возник вопрос о том, является ли среда культивирования, которую мы использовали, оптимальной для выявления чувствительности фолликулов осетровых рыб к гормонам гипофиза.

Влияние состава среды культивирования на способность фолликулов осетровых рыб реагировать созреванием ооцитов на действие гонадотропных гормонов гипофиза и прогестерон. Первоначально мы использовали среду культивирования (Скоблина, 1971), рН которой доводили бикарбонатом натрия. Поскольку результаты варьировали от опыта к опыту, было решено перепроверить влияние pli л состава среды на способность фолликулов севрюги реагировать созреванием ооиита на действие гормонов гипофиза. Оказалось, что при увеличении в растворе Рингера концентрации NaHCOj до 500 мг/л (рН 8), на ГТГ реагируют фолликулы лишь очень немногих самок. При дальнейшем увеличении концентрации NaHCOj до 2 г/л рН практически не изменяется, однако процент самок, фолликулы которых реагируют на ГТГ, существенно увеличивается. Тот же результат был получен и при увеличении концентрации NaCI, а не NaHCOj. Из этого следует, что для получения реакции фолликулов осетровых рыб на ГТГ in vitro важным фактором является тоничность среды культивирования. Однако пороговое значение тоничности среды, при котором возможна реакция на ГТГ, не является универсальным дли всех самок и зависит от физиологического состояния фолликулов. Мы обнаружили также, что при определенных концентрациях NaHCOj среда сама начинает вызывать созревание ооцитов. При этом происходит не только разрушение оболочки зародышевого пузырька, но и преобразование цитоплазмы и кортекса, позволяющее зрелому яйцу не повреждаться в воде и активироваться под влиянием соответствующего стимула. Нижнее значение концентрации NaHCOj, при котором происходит негормональная индукция созревания, также зависит от физиологического состояния фолликулов и чаще всего находится в диапазоне 1,5 -3,5 г/л. При проведении опытов мы обычно использовали раствор Рингера, содержащий 1,5−2 г/л NaHC03, так как такая среда обеспечивает реакцию фолликулов большинства самок на ГТГ, но не вызывает созревания ооцитов Концентрация NaHCOj влияет не только на способность фолликулов отвечать на действие ГТГ, но и на их чувствительность к этим гормонам (Гончаров, 1978- Гончаров и др., 1997).

Влияние указанных выше параметров среды было изучено нами на трех видах осетровых рыб — севрюге, персидском и сибирском осетрах (Гончаров и др, 1997). При этом были получены сходные закономерности. Напротив, опыты с использованием различных сред, проведенные нами на фолликулах травяной лягушки и зеленой жабы, показали, что для первого вида оптимальной средой с точки зрения чувствительности фолликулов к гормонам гипофиза является классический раствор Рингера, а для второго вида — раствор Рингера, в котором концентрация №НСОз увеличена до 400 мг/л. Таким образом, оптимальный состав среды зависит не только от физиологического состояния фолликулов, но и, вероятно, является видоспецифичным.

Следует отметить, что параллельно с изучением влияния состава среды на способность фолликулов отвечать созреванием ооцитов на действие ГТГ мы исследовали влияние тех же сред на реакцию ооцитов на прогестерон. Практически во всех средах и для всех самок процент созревания был равен 100. Результаты опытов на осетровых рыбах позволили нам разработать новый метод определения продолжительности ГЗП.

Гормонозависимый период созревания ооцитов. При изучении влияния ГТГ на созревание ооцитов для получения сравнимых результатов важно знать, каково физиологическое состояние взятых в опыт фолликулов. Давно известно, что чувствительность фолликулов к ГТГ и продолжительность ГЗП претерпевают сезонные изменения. Тем не менее, для характеристики фолликулов в основном используется их размер. В ряде работ авторы указывают продолжительность ГЗП (Детлаф, Шмерлинг, 1968- Скоблина, 1968). При этом ГЗП определяли путем помещения фолликулов в среду, содержащую гормоны гипофиза, на определенный срок, после чего фолликулы отмывали в нескольких порциях среды, не содержащей гормоны, и затем оставляли в ней для завершения процесса созревания ооцитов.

Для работы с осетровыми рыбами нами был разработан новый более удобный и точный способ, основанный на перенесении фолликулов из среды, содержащей гормоны гипофиза и обеспечивающей их действие, в обычный раствор Рингера, в котором созревание ооцитов происходит только в присутствии прогестерона. Таким образом можно определить, за какое время под влиянием ГТГ фолликулярные клетки передают сигнал, способный вызвать созревание ооцита. Сопоставление двух методов определения продолжительности ГЗП (отмывка и перекладывание) показало, что при использовании отмывки продолжительность ГЗП всегда бывает меньше (Гончаров и др., 1997).

Возможность прерывания действия ГТГ переносом фолликулов в среду, обеспечивающую реакцию только на прогестерон, позволило установить важные для понимания механизма действия ГТГ закономерности. Оказалось, что действие ГТГ суммируется, если фолликулы обрабатывать гормоном не непрерывно, а в течение двух периодов, разделенных периодом пребывания их в среде, не содержащей ГТГ и прерывающей его действие. Другой опыт состоял в обработке фолликулов ГТГ в течение периода меньшего, чем продолжительность ГЗП. Вслед за этим проводились сравнение скорости созревания ооцитов, прошедших такую предобработку и контрольных ооцитов. У первых Т50 всегда оказывалось меньше. Результаты этих опытов показывают, что для образования сигнала, необходимого для созревания ооцита, действие ГТГ не обязательно должно быть непрерывным и сигнал, меняющий состояние ооцита, начинает действовать до завершения ГЗП.

Изучение физиологического состояния фолликулов севрюг сразу после вылова и после доставки рыб на рыбоводный завод показало, что продолжительность ГЗП коррелирует с продолжительностью индуцированного прогестероном созревания 50% ооцитов (Т50) (рис. 1).

18 16 И

5 7 9 II

Т50,Т"

Рис. 1. Взаимозависимость продолжительности ГЗП и Т50, определенных для фолликулов, взятых у самок севрюги сразу после отлова () и перед инъекцией гормонального препарата на рыбоводном заводе (О).

Следовательно, становление компетенции клеток стенки фолликула и ооцита происходит согласованно. Это наблюдение позволило разработать новый метод прижизненною определения пригодных для размножения самок осетровых рыб. (см. раздел «Критерий отбора самок осетровых рыб .»).

Очистка гонадотропного гормона гипофиза севрюги (с-ГТГ). К началу наших работ ГТГ был очищен из гипофизов только двух видов рыб — карпа (Cyprinus carpio) (Fontaine, Gerard, 1963) и чавычи (Oncorhynchus tshawytscha) (Yamasaki, Donaldson, 1968). При этом у обоих видов было найдено только по одному ГТГ.

Первая попытка использовать метод, разработанный для очистки ГТГ карпа, для очистки ГТГ севрюги оказалась неудачной. В ходе первичной экстракции белков было потеряно свыше 90% гонадотропной активности. Впоследствии нам удалось подобрать условия, которые позволили провести экстракцию, обеспечившую сохранение 84% гонадотропной активности. После гель-фильтрации на Сефадексе G-100 и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, концентрации, диализа, еще одной гель-фильтрации на Сефадексе G-100 и лиофилизации была получена фракция, которая согласно четырем тестам (спермиация у прудовой лягушки (Rana eseulenta), созревание in vitro ооцитов травяной лягушки, серой жабы (Bufo bufo) и севрюги) имела в 10−14 раз большую удельную активность, чем исходный порошок ацетонированных гипофизов севрюги, а выход активности составил 21%. Проанализировав потери на всех этапах, мы несколько изменили схему очистки, что позволило повысить выход гонадотропной активности до 37%. В табл. 1 приведены этапы очистки с-ГТГ и выход белка и активности на каждом из них (Burzawa-Gerard et al., 1975a).

Физико-химические свойства гонадотропного гормона севрюги. Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле (7.5%) показал присутствие в препаратах с-ГТГ (первая и вторая очистки) трех совпадающих фракций с коэффициентом относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) равным 0.27, 0.31 и

0.35. Первые две фракции были представлены примерно рапными количествами и проявляли согласно тесту спермиапии лягушки гонадотропную

Таблица 1. Характеристика основной гонадотропной фракции, полученной на каждом этапе очистки гонадотропного гормона гипофиза севрюги

Этап очистки Гонадотропная активность3 Масса (мг) Оптическая плотность

Порошок ацетонированных гипофизов

После спиртового просачивания 684

После диализа 726

После концентрации 756

После фильтрации на

Сефадексе в-100

После хроматографии на

ДЭАЭ-целлюлозе

После диализа под вакуумом 268

После фильтрации на

Сефадексе С-100

После лиофилизации 284 263 а Гонадотропная активность выражена в мг с-ГТГ, полученного в результате первой очистки. В качестве биотеста использовали реакцию созревания in vitro ооцитов серой жабы. Ошибка определения не превышала 20% при р=0.05- 6 Оптическую плотность определяли при длине волны 276 нм. активность, третья же фракция была менее выражена, а гормональная активность с помощью этого теста в ней не выявлялась. Дальнейшее разделение фракций было осуществлено с помощью препаративного электрофореза. В чистом виде была выделена первая фракция, и был определен ее аминокислотный состав. Он оказался сходным с аминокислотным составом ГТГ карпа, хотя и отличался от него по относительному содержанию ряда аминокислотных остатков (Burzawa-Gerard et а}., 1975b).

Известно, что ГТГ всех изученных до настоящего времени позвоночных являются гетеродимерами, то есть состоят из двух нековалентно связанных субъединиц (а и Р). Как показали наши исследования, с-ГТГ не является исключением. При воздействии на с-ГТГ диссоциирующими агентами, такими как мочевина, пропионовая кислота и низкий рН, происходит диссоциация гормона. Электрофорез выявляет в таких препаратах две полосы с коэффициентом ОЭП равным 0,53 и 0,59 или 0,59 и 0,65 в зависимости от того, какая из разделенных с помощью препаративного электрофореза фракций исследовалась. Обработанные диссоциирующими агентами препараты с-ГТГ теряют существенную часть своей гонадотропной активности (Burzawa-Gerard et al., 1975b). Было показано также, что очищенный с-ГТГ содержит 8,7% гексоз, то есть является гликопротеином, подобно ГТГ других позвоночных животных. Сходной с ГТГ других позвоночных животных оказалась и молекулярная масса с-ГТГ (30 — 32 кД) (Kuznetzov et al., 1983).

Выделенные субъединицы оказались способными к реассоциации и к ассоциации с субъсдиницами ГТГ карпа, что было продемонстрировано с помощью электрофореза и по восстановлению биологической активности (Burzawa-Gerard, Goncharov, 1980).

Полиморфизм гонадотропного гормона гипофиза севрюги. В литературе есть немало данных, указывающих на универсальность явления микрогстерогенности или полиморфизма гликопротеиновых гормонов гипофиза и плаценты (см. Wakabayashi, 1980). Несмотря на то, что существование различающихся по заряду молекул этих гормонов известно довольно давно (Jiilisz, Tertrin-Clary, 1974- Pierce, 1974- Sairam, Papkoff, 1974), многие вопросы, касающиеся природы этого явления и его роли в регуляции функции органов-мишеней, остаются не до конца выясненными. В литературе можно найти прямо противоположные мнения о значении этого явления. Одни авторы лишь вскользь упоминают о нем, как о чем-то само собой разумеющемся, но не играющем какой либо физиологической роли, тогда как другие приписывают изоформам статус разных гормонов полоспецифичных или выполняющих разные функции. Попытки понять природу этого явления долгое время не приводили к успеху (Courte et al., 1972- Та mura-Takaliashi, Ui,, 1977- Roos et al., 1975- Davy et al., 1977- Jacobson et al., 1977).

Впервые мы обнаружили полиморфизм с-ГТГ, когда попытались проверить методом электрофореза чистоту выделенного нами гормона. Как уже было сказано, в препарате были обнаружены три различающиеся по ОЭП фракции, две из которых обладали согласно гесту спермиации лягушки гонадотропной активностью. Позднее этот препарат был подвергнут изоэлсктрофокусированию (ИЭФ) в полиакриламидном геле с последующим анализом гонадотропной активности фракций с помощью более чувствительного теста — созревания in vitro ооцитов зеленой жабы. В результате ИЭФ с-ГТГ распадался на пять хорошо обособленных групп полос, общее число которых было не менее 10 (рис. 2, Т). 75 70 65 50 55 5.0 45 рН

Рис. 2. Изоэлектрофокусирование препаратов с-ГТГ, тотального (Т) и субфракций (А, Б, В, Г). На гель наносили по 100 мкг препарата.

Подробный анализ активности всех фракций, полученных в ходе очистки на каждом этапе, как использованных, так и не использованных для получения препарата с-ГТГ (вторая очистка), выявил этап, на котором происходила потеря существенной ее части. Наибольшие потери ее происходили при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, которая подобно электрофорезу разделяет молекулы по заряду. В связи с этим мы решили выделить субфракции с-ГТГ, включая те, которые раньте отбрасывали из-за их низкой активности и опасения загрязнения препарата другими белками. Для того, чтобы эффективнее разделить субфракции гормона, при элюции адсорбированных на ДЭАЭ-целлюлозе белков был использован более пологий градиент концентраций №ОН-глицинового буфера (рН 9,4). Были получены четыре субфракции с-ГТГ. Гель-фильтрация на Сефадексе О-ЮО показала, что субфракции Б и В практически гомогенны, а в субфракциях, А и Д есть небольшое количество примесей — веществ с большей молекулярной массой, не обладающих юнадотрошюй активностью. Фракции, входящие в основной пик белков с коэффициентом распределения (Кц) 0,29−0,32, были лиофилизированы. В результате было получено ощутимое количество (десятки миллиграммов) каждой из субфракций с-ГТГ, достаточное для проведения разнообразных исследований.

В дальнейшем мы попытались ответить на два вопроса: что определяет различие в зарядах молекул с-ГТГ и могут ли разные изоформы гормона играть разную роль в ре гул я ц и и га метоге н еза.

Анализ полученных нами субфракций показал, что они отличаются по ОЭП, причем эти значения соответствуют порядку элюции субфракций с ДЭАЭ-целлюлозы. Напротив, электрофорез в присутствии додецил сульфата натрия выявлял основной компонент с молекулярной массой 30 — 32 кД и небольшую примесь белков с молекулярной массой 17 и 60 кД. После прогревания образцов при 100 °C в течение 2 мин в присутствии % додецил сульфата натрия выявлялся только один компонент с молекулярной массой 17 кД, что хорошо укладывается в представление о субъединичном строении ГТГ и свидетельствует о том, что в наших препаратах находятся молекулы одинаковой молекулярной массы. Подтверждение этому было получено и при аналитическом ультрацентрифугировании. Все субфракции с-ГТГ (А, Б, В и Г), а также тотальный препарат из предыдущей (второй) очистки (с-ГТГ-Т) осаждались как практически гомогенные белки с коэффициентом седиментации равным 2. И, наконец, не было обнаружено никаких различий в иммунологических свойствах имеющихся в нашем распоряжении препаратов с-ГТГ. 15 опытах по иммунодиффузии все пять препаратов давали по одной полосе преципитации с поливалентной сывороткой, выработанной против с-ГГГ-Т и с-ГТГ-Г (Кпгпе17.0 у.е. (а!., 1983).

И ЭФ всех препаратом и последующее определение гонадотропной амшшости (рис. 3) показало, что белки всех ныявляемых полос обладают способностью индуцировать in vitro созревание ооцитов зеленой жабы. Хорошо видно также, чю каждый препарат имеет собственный спектр изофррм, причем соседние препараты имеют общие компоненты, и только крайние препараты (А и Г) практически не содержат общих полос. препаратов с-ГГТ (тотального -Т и субфракций А, В. 15, Г) и экстракта гипофиза (.ЭГ) смеси гипофизов обоих полов и индивидуальных жпофизов самцов и самок. На гель наносили по 25 мкг препаратов Т, А, Б, В и 50 мкг с ГТГ Г и экс тракт 500 мгк гипофизов. Гонадотропную активность определяли в 3 мм полосках ie.ni. помощью теста созревания in vitro ооцитов зеленой жабы. На каждую тчку использовали по 70−90 фолликулов.