Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Ферменты биосинтеза, протеидизация и механизмы транспорта фосфорных эфиров тиамина

Диссертация: Ферменты биосинтеза, протеидизация и механизмы транспорта фосфорных эфиров тиамина
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В изучении тиамина в последние 45 лет со времени установления его структуры и последующего успешного синтеза достигнуты существенные успехи. Имеется огромное количество данных, полученных в опытах на животных и в клинике при лечебном применении тиамина и тиаминпирофосфата, а также при изучении специфических функций отдельных атомов или группировок в молекуле тиамина, что нашло отражение в ряде… Читать ещё >

Содержание

  • ГЛАВА I. БИОСИНТЕЗ, ТРАНСПОРТ, ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ И РОЛЬ ТИАМИНА В ОБМЕНЕ ВЕЩЕСТВ (обзор литературы)
    • 1. Биосинтез тиамина
    • 2. Механизмы всасывания и транспорта тиамина
    • 3. Транспорт тиамина через цитоплазматические мембраны
    • 4. Тиаминсвязывающие белки и их роль в трансмембранном переносе
    • 5. Каталитические функции ТРР
    • 6. Биосинтез ТРР в животном, растительном и микробном организмах тиаминпирофосфокиназой
    • 7. Биосинтез и значение тиаминтри|юсфата
    • 8. Дефицит тиамина у животных
    • 9. Дефицит тиамина у людей
  • Постановка задачи
  • ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
  • ГЛАВА III. ШДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ТИАМИНПИ РОФОСФОКИНАЗЫ ИЗ ПИВШХ ДРОЖЕй
    • 1. Выделение, очистка и некоторые оптимальные параметры для тиаминпирофосфокиназной реакции
    • 2. Получение высокоочиценной Т-киназы из пивных дрожжей
    • 3. Изучение гомогенности очищенных препаратов
  • Т-киназы.Ц
    • 4. Иммобилизация Т-киназы в полиакриламидном геле
    • 5. Очистка дрожжевой Т-киназы на аффинных адсорбентах
    • 6. Изучение кинетических параметров тиаминпирофос-фокиназы из пивных дрожжей *
    • 7. Структурные особенности Т-киназы из пивных дрожжей
    • 8. Субстратная специфичность дрожжевой Т-киназы
    • 9. Идентификация функциональных групп дрожжевой тиаминпирофосфокиназы
    • 10. Механизм действия дрожжевой тиаминпирофосфокиназы
  • ГЛАВА 1. У. ПОЛУЧЕНИЕ ШС0К00ЧИЩЕНН0Й Т-КИНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС И ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ
    • 1. Очистка фермента
    • 2. Кинетические параметры Т-киназы из печени крыс
    • 3. Четвертичная структура и аллостерическая регуляция Т-киназы из печени крыс
    • 4. Изучение механизма ферментативной реакции Т-киназы из печени крыс
    • 5. Функциональная значимость некоторых аминокислот в активном центре Т-киназы I© печени крыс
  • ГЛАВА V. ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ТИАМИНА В ОПЫТАХ 1П УиО
    • 1. Оптимальные дозы вводимого тиамина для фосфори-лирования в тканях
    • 2. Свободный и связанный тиаминпирофосфат в гиало-плазме печени крыс при различных В^ авитаминозных состояниях
    • 3. Содержание свободного и связанного тиаминпиро-фосфата в митохондриях печени крыс при различной обеспеченности организма тиамином
    • 4. ДепонированиеС-тиамина в субклеточных фракциях белых крыс
    • 5. Очистка транскетолазы путем маркирования меченым тиамином и изучение прочности связывания кофермента с белком в транскетолазе из печени свиньи
    • 6. Активность транскетолазы крови и ТРР-эффект как показатели обеспеченности организма тиамином
    • 7. Механизмы транспорта и депонирования тиамина и вго фосфорных эфиров
    • 8. Выделение и радиометрический метод определения активности АТР: тиаминдгфосфатфосфотрансферазы из печени крыс

Ферменты биосинтеза, протеидизация и механизмы транспорта фосфорных эфиров тиамина (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

В изучении тиамина в последние 45 лет со времени установления его структуры и последующего успешного синтеза достигнуты существенные успехи. Имеется огромное количество данных, полученных в опытах на животных и в клинике при лечебном применении тиамина и тиаминпирофосфата, а также при изучении специфических функций отдельных атомов или группировок в молекуле тиамина, что нашло отражение в ряде последних монографий Островского (34, 36). И все же до настоящего времени мы не располагаем достаточной информацией, которая позволила бы установить тождественность между функционированием тиаминзависимых ферментов in vitro и in vivo. Современные достижения в области эн-зимологии позволяют охарактеризовать свойства определенных ферментов или мультиферментных комплексов точными количественными параметрами. Имеющиеся на этом основании представления о наиболее вероятных критериях, и в ряде случаев, механизмах функционирования ферментов получены, как правило, в искусственных условиях модельных систем. Однако, вероятность сдвигов молекуляр-но-кинетических параметров отдельных ферментов в результате их выделения и очистки, обнаружение сложных белок-белковых взаимодействий и наличие специфических природных активаторов или ингибиторов, присутствующих в интактной клетке, но не в системе in vitro, всегда вызывают сомнения в отношении правомерности и эффективности перенесения результатов эксперимента в изолированных условиях модельных опытов на ситуации in vivo. По-видимому, окончательное решение о правомерности перенесения тех или иных результатов возможно лишь после тщательного сравнительного анализа всех данных по каждому ферменту в условиях изолированной системы и целого организма, в последнем случае с учетом, конечно, ряда физиологических факторов — всасывание, транспорт и т. д. Попытка провести такой анализ в отношении тиаминпирофосфо-киназы и других тиаминдифосфатзависимых ферментов явилась страг-тегическим направлением при постановке задачи исследований. Одним из доминирующих направлений в изучении функциональной значимости витамина Bj является исследование механизмов его транспорта, метаболизма, депонирования и включения в соответствующие ферментные системы. Являясь коферментом дегидрогеназ об-кетоки-слот, транскетолазы, декарбоксилазы, фосфокетолазы, сульфоацет-альдегвдсульфолиазы пирофосфорный эф! ф тиамина участвует в обмене углеводов, липидов, белков, нуклеиновых кислот (36). Изучение закономерностей метаболизма ТРР, игращего ключевую роль в обмене веществ, в этой связи мало/эффективно без детального исследования ферментной системы, осуществляющей его биосинтез. Необходимость изучения данного вопроса, в первую очередь, диктуется потребностями медицины, поскольку информация о путях регуляции этого фермента позволит проводить коррекцию уровня ТРР в тканях при различных патологических состояниях, сопровождающихся угнетением фосфорилирования тиамина. В настоящее время проводятся исследования в отношении возможного применения ОТ при онкологических заболеваниях (5- II-12- 14). Более стратегический подход в этой области не исключает использования и других производных тиамина. Последние могут найти новое, более широкое применение и в лабораторной практике при моделировании В| авитаминозных состояний. Свою биологическую активность такие соединения могут проявлять на этапах транспорта, ингибиро-вания Т-киназы, и главным образом, после превращения их Ln vivo в Т-киназной реакции в соответствующие пирофосфаты, с последующим включением в ТРР-зависимые ферменты. Использование определенных доз антивитаминов без знания механизмов их транспорта и соответствующих кинетических параметров Т-киназы, в этой связи, не совсем оправдано. Исходя из вшпе изложенного, изучение ре гулят орных свойств, молекулярно-кинет ических параметров, структуры м механизма реащии, фунедиональных груш активного центра этого фермента шеет кардинальное значение, не только с точки зрения энзимологии, но и практической медицины. Следует заметить, что ТРР (кокарбоксилаза) достаточно широко жршеняется в медицинской практике при лечении выраженных невралгических расстройств, сахарного диабета, сердечно-сосудистых заболеваний и т. д. (36), исходя из коферментных, фармокологических и регуля-торных свойств. Жри этом допускается, что кокарбоксилаза легко проходит через гистогематические барьеры и оказывает в тканях свое специфическое действие, нормализуя активность транскетола-зы и дегидрогеназкетокислот. Однако, вопрос о трансмембранном транспорте ТРР оставался совершенно не выясненным и, кроме того, широкое применение в последнее время этого препарат та в клинике не давало терапевтического эффекта. Проблеме транспорта тиамина в дрожжевых (146) и бактериальных (127) клетках с участием белков-переносчиков уделяется достаточно много внимания и все же до настоящего времени мы не располагаем информацией, которая позволила бы представить механизм транспорта тиамина в клетки млекопитающих. Более того, нет четкого представления, каким образом осуществляется поступление ТРР в ипохондрии, где биосинтез кокарбокеилазж отсутствует. Не решен также вопрос о том, происходит ли накопление соответствующих ТРР-за-виеимых ферментов в в вде апоформы при тиаминовой недостаточности. Полагают, что такое явление шеет место, и поэтому определение активности эритроцит арной транскетолазы, а также активацию этого фермента внесением экзогенного ТРР (ТРР-эффект) считает достаточно удобным тестом для определения тиаминового етаг-туса у людей. Тем не менее, удаление до 85% ТРР из митохондрий печени (161−162) и до 91% из эритроцитов не вызывает заметного уменьшения скорости окислительного декарбоксилирования о^-кето-кислот и снижения активности транскетолазы (298). Имеются также сведения, что как у здоровых людей, так и у ряда больных с выраженной недостаточностью тиамина ТРР-эффект был одинаковым (165), а у обследованных контрольной группы он достигал 27%, что как правило, уже считается признаком В^ авитаминоза. Таким образом, изучение данного вопроса с привлечением новых методических подходов представляется достаточно обоснованным.

Кроме коферментных функций тиамин обладает и некофермент-ными свойствами: карциотропным и нейротропным действиями. В этой связи в последнее десятилетие резко возрос интерес к ферментным системам, осуществляющим биосинтез тиаминтрнфосфата, поскольку установлено, что недостаток данного соединения в мозге приводит к заболеванию (болезнь Лея) с летальным исходом. Немногочисленные работы по этому вопросу очень противоречивы. Утверждается даже, что одним из субстратов в реакции биосинтеза тиаминтрнфосфата служит какой-то белок, прочно связанный с ТРР, присутствующий в гомогенатах гепатоцитов. В этой связи считают, что очистка фермента невозможна (259). Роль ТТР в организме млекопитающих совершенно не выяснена, указывают лишь на определенное значение данного ингредиента при проведении нервного импульса (209). Не совсем корректными кажутся данные и по ковалентному (56) связыванию ТРР с транскетолазой в печени свиней, поскольну связь кокарбоксилазы с соответствующими ферментными системами должна быть, в известной степени, лабильной. По этой причине экспериментальное исследование по указанным выше вопросам имеет существенное значение для решения проблемы, связанной с метаболизмом тиамина на молекулярном и органном уровнях.

В настоящей работе впервые осуществлена очистка Т-киназы из пивных дрожжей и печени крыс до электрофоретически гомогенного состояния и детально проведено исследование кинетических параметров фермента. Выяснена роль функционально активных радикалов в молекуле витамина, ответственных за связывание и фосфорилиро-вание в Т-киназной реакции, а также функциональная значимость определенных аминокислот активного центра в ферментативном катализе.

На основании кинетического анализа Т-киназы даны практические рекомендации по методике применения окситиамина в опытах на животных для преимущественного блокирования ЦЦГ либо транс-кетолазы. При этом установлено, что ложный кофермент включается in vivo в ТК только по мере синтеза белка de novo. Для гиало-плазмы митохондрий и эритроцитов доказано наличие двух пулов ТРР — свободного и белковосвязанного. Внутримитохоццриальный пул ТРР не возрастает даже после инъекций тиамина, что объясняется наличием системы транспорта, одним из компонентов которой является тиаминсвязывающий белок. Этот белок был впервые выделен из мембран эритроцитов методом аффинной хроматографии.

Доказано, что ТРР не цроникает через клеточные мембраны и преимущество этого соединения перед тиамином при клиническом применении заключается лишь в более пролонгированном действии. Инъекции тиаминтрифосфата, в свою очередь, приводят к быстрому накоплению и длительному удерживанию ТРР в организме.

Установлено, что при Bj авитаминозе апоформа ТК в гиало-плазме печени и эритроцитах не накапливается, и поэтому ТРР-эффект (увеличение активности фермента после добавления ТРР) ши-рокоприменяемый в клинике тест при обследовании населения на предмет тиаминовой недостаточности, не отражает истинную картину тиаминового статуса. В качестве высокочувствительного теста на развитие Bj гипои авитаминоза предлагается определение свободного или белковосвязанного ТРР.

Результаты выявленных закономерностей комплексного исследования по изучению кинетических характеристик Т-киназы и ТРР-киназы, тиаминсвязыващего белка, механизмов проницаемости, депонирования и включения в соответствующие ферментные системы тиамина и его антиметаболитов не только углубляют и дополняют наши знания о структуре, свойствах, механизме действия фосфо-трансфераз, внося тем самым определенный вклад в науку о ферментах, но и в значительной мере способствуют развитию такого нового направления, как молекулярная витаминология.

ОСНОВШЕ ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫНОСЯТСЯ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработанные методы выделения и очистки Т-киназы из печени крыс и пивных дрожжей до гомогенного состояния.

2. Новые данные по молекулярно-кинетическим параметрам ти-аминпирофосфокиназы, функциональным группам активного центра, четвертичной структуре, регуляторным особенностям и механизму реакции.

3. Практические рекомендации по избирательному блокированию ТРР-зависимых ферментов окситиамином.

4. Результаты о содержании двух пулов (свободного и белко-восвязэнного) ТРР в гиалоплазме, митохондриях и эритроцитах, и использование определения концентрации свободного ТРР в тканях в качестве тест-системы на тиаминовую недостаточность.

5. Постулирование наличия тиаминсвязывающего белка в мембранах митохондрий, как одного из компонентов транспортной системы тиамина и выделение этого белка из эритроцитов биоспецифической хроматографией.

6. Данные об отсутствии проницаемости тиаминпирофосфата через клеточные мембраны.

7. Доказательства преимущества инъекций тиаминтрифосфата вместо тиаминпирофосфата для насыщения кокарбоксилазой различных органов и тканей.

8. Разработка метода определения и очистки ферментной системы, обеспечивающей биосинтез тиаминтрифосфата.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны методы выделения и очистки тиаминпирофоофо-киназы из пивных дрожжей и печени крыс. Оба препарата на последней стадии очистки были гомогенными по данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что первый фермент является тетрамером, а второй димером с молекулярной массой 90 000 и 56 000 дальтон, соответственно. Ни тиаминмонофосфат, ни ДДР не могут служить в качестве одного из субстратов Т-киназы -—реакция протекает вследствие одноэтапного переноса пирофосфа-тной группировки на тиамин. Рассчитаны кажущиеся значения Km для фермента из обоих источников, а также KL для ряда антиметаболитов тиамина.

2. Различными методами доказано наличие у Т-киназы пространственно разделенных центров для связывания активаторов (Мд2} и субстрата (АТР^~). Таким образом, Т-киназу можно отнести к классу регуляторных диссоциирующих ферментов. Регуляция одним из конечных продуктов реакции (AMP) осуществляется по принципу обратной отрицательной связи, которая не является основной из-за низкой константы диссоциации комплекса Е’АМР. Второй продукт реакции —ТРР (как это было показано на примере Т-киназы из печени) является мощным ингибитором ферментативной реакции с KL 3*10 М. Такой механизм регуляции обуславливает незначительный прирост уровня кофермента в тканях даже при инъекциях высоких доз тиамина.

3. Определена субстратная специфичность тиаминпирофосфоки-назы. В качестве доноров-субстратов помимо АТР могут служить различные нуклеозвдтрифосфаты, причем наилучшим субстратом является U Т Р. На этом основании предлагается более корректное номенклатурное название фермента: NTР: тиаминпирофосфотрансфераза.

В качестве акцепторов-субстратов (исследовано 40 аналогов) могут быть использованы различные производные тиамина. Характерно, что некоторые из них фосфорилируются лучше природного витамина. Для эффективного взаимодействия тиамина с активным центром фермента решающим моментом является структура и свойства тиазолового компонента: гидрогенизация цикла, замена ти-азола на имидазол или оксазол, замещение или модификация 5-оксиэтильного радикала блокируют Т-киназную активность. Роль других участков тиазолового кольца менее существенна, а удаление или введение оцределенных радикалов в положение 2 или 4 лишь изменяет сродство новых соединений к ферменту. Изучение роли функционально активных радикалов, ответственных за фос-форилирование в Т-киназной реакции, а также за связывание с соответствующими ТРР-зависимыми ферментами дает возможность целенаправленно осуществлять синтез различных производных тиамина с заранее заданными свойствами.

4. Показано, что Т-киназная реакция протекает с образованием тройных фермент-субстратных комплексов: если в случае фермента из печени присоединение субстратов строго детерминировано (АТР присоединяется первым), то для Т-киназы из дрожжей оно неупорядоченно.

Методами химической модификации исследованы функциональные группы активного центра фермента. Установлена важная роль имвдазольного остатка гиствдина в связывании субстратов в активном центре Т-киназы. Цдентифицированы две SHгруппы. Модификация уже одной из них приводит к полной потере фермента^ тивной активности. Диеульфвдные связи не обнаружены. Предполагается, что тиаминпирофоофокиназа относится к группе SHферментов.

5. На основании изучения кинетических параметров Т-киназы и механизмов депонирования кокарбоксилазы в тканях даются практические рекомендации относительно доз и сроков для создаг ния насыщающих концентраций ТРР в клетке, а также для моделирования антиметаболитных авитаминозов (окситиаминовый, пирити-аминовый) с целью блокрфования ТРР-зависимых ферментов. б. Проведено оцределение белковосвязанной и свободной кокарбоксилазн в гиалоплазме и митохондриях гепатоцитов, а также в эритроцитах. Показано, что в гиалоплазме печени крыс содержание связанного с белком ТРР постоянно и не повышается даже после многократных инъекций тиамина. Концентрация свободной формы подвержена значительным колебаниям в зависимости от диеты и времени суток. При В|-авитаминозе элиминируется в первую очередь свободная форма ТРР. Протеидизация ТРР в гиалоплазме осуществляется только на транскетолазе, которая существует исключительно в виде холофермента. В случае тиаминовой недостач точности апоформа ТК не накапливается.

В митохондриях содержание связанного с белком ТРР как в норме так и после инъекций тиамина постоянно и составляет 20% от общего цула кокарбоксилазы. Уровень протеидизировэнного ко-фермента начинает падать только на 20 рутки пищевого авитаминоза, когда количество свободной формы уже не детектируется. С этого момента начинает снижаться активность дегидрогеназ оСкетокислот.

В эритроцитах также удаление (авитаминоз) 80% ТРР (свободная форма) существенным образом не сказывается на активности транскетолазы. При этом установлено отсутствие связывания ТРР с белками эритроцитов тиаминдефицитных крыс, что указывает на невозможность накопления апоформы ТК при Вравитаминозе. Таким образом, активация этого фермента в гемолизатах крови после дополнительного внесения в среду инкубации кокарбоксилазы (ТРР-эффект) не может рассматриваться как количественная оценка глубины развития тиаминовой недостаточности. В этой связи и определение активности соответствующих ТРР-зависимых ферментов, как тест на тиаминовый статус, является малочувствительным. Более объективным критерием, моментально реагирующим на недостаток тиамина, является определение концентрации кокарбоксилазы в крови.

7. Изучено распределение и включениеС-тиамина в ТРР-зависимые ферменты субклеточных фракций печени белых крыс. Показано, что основным депо тиамина является гиалоплазма и митохондрии. Методами гельфильтрации доказано, что в гиалоплазме ТРР включается только в транскетолазу, а в митохондриях в де-гидрогеназы оСкетокислот. На этом основании предложен метод очистки ТРР-зависимых ферментов, когда выход искомого белка детектируется по наличию метки или по содержанию белковосвяза-нной кокарбоксилазы. Из печени свиньи, таким образом, был получен высокоочищенный «меченый» препарат транскетолазы. Установлено, что связь между коферментом и белком не является ко-валентной и ТК из печени свиньи не является исключением в ряду тиаминовых ферментов, как на это указывалось ранее.

8. Исследована проницаемость тиамина и его фосфорных эфи-ров через биологические мембраны при разных вариантах инъекций. Достоверных отличий по количественному содержанию кокарбоксилазы в тканях белых крыс при насыщении организма тиамином и ТРР не выявлено. Основным продуктом, детектируемым в тканях после введения ТРР, является TMP. Внутривенные инъекции (50 мкг/100 г веса) синтезированного нами ТРР с двойной меткой показали, что прямого транспорта ТРР через цито-плазматические мембраны не происходит. Трансмембранный перенос связан с деградацией фосфатных группировок.

Установлено, что после инъекций тиаминтрифосфата гидролиз терминального фосфора приводит к резкое накоплению и длительному удерживанию ТРР во всех тканях и органах белых крыс. Постулируется предположение о том, что ТТР является транспортной (депонируемой) формой кофермента для дегидрогеназ оСкетокис-лот митохондрий, где собственный биосинтез кокарбоксилазы отсутствует. Подкожное введение трифосфорных эф! фов окситиамина и тетрагвдротиамина, в свою очередь, резко снижает уровень ТРР в тканях, что свидетельствует о их высокой антивитаминной активности, которая характеризуется ещё и выраженным пролонгированным действием. Предлагается применение тиаминтрифосфата в качестве лечебного препарата, обеспечивающего быстрое накопление кокарбоксилазы в тканях и длительное её удерживание. Три-фосфорные эфиры антаганистов тиамина можно использовать в лабораторной практике для быстрого и эффективного моделирования тиаминовой недостаточности.

9. В связи с непосредственным участием лиг ацц связывающих белков в процессах трансмембранного переноса витаминов проведем, но выделение тиаминевязывающего белка. Методами аффинной хроматографии на тиамин-4-азобензоилглицилглицингидразидосефарозе из мембран эритроцитов крысы выделен гомогенный при электрофорезе белок, обладающий высокой тиаминсвязывающей активностью. При этом достигнута очистка в 2300 раз с выходом 50%. Показана важная роль ионов двухвалентных металлов и рН среды в связывании тиамина с полученным белком.

10. Разработан радиометрический метод определения активности и произведена очистка из печени крыс ферментной системы осуществляющей биосинтез ТТР* Установлено, что экзогенно внесенный в инкубационную смесь ТРР в присутствии ТРР-киназы превращается в ТТР и, следовательно, высказанное ранее утверждение, что субстратом в данной реакции может служить какой-то гипотетический белок, связанный с ТРР, и по этой причине очистка данного фермента из гомогенатов печени невозможна, не соответствует действительности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Принимая во внимание кардиотропную и нейротропную активности тиамина следует, тем не менее, подчеркнуть, что главный путь реализации его биологической активности обусловлен кофер-ментными функциями ТРР, который синтезируется в Т-киназной реакции. Изучение этого фермента по классической схеме — выделение, очистка, определение молекулярно-кинетических параметров, структуры, механизма реакции, идентификация групп активного центра с параллельным выявлением функционирования Т-кинаг-зы in vivo представляет собой значительный интерес не только с точки зрения энзимологии и физиологии обмена тиамина, но и вносит значительный вклад в развитие молекулярной витаминологии. При исследовании транспорта, депонирования и протеидизации ТРР в соответствующих ТРР-зависимых ферментах также предпринята попытка не только охарактеризовать эти процессы, протекающие ir" vivo, но и выделить ферментные системы, принимающие непосредственное участие в протеидизации ТРР, Сказанное выше касается и тиаминсвязывающего белка, одного из компонентов транспортной системы витамина Bj. Проделанная работа объединяет два аспекта изучения метаболизма тиамина — органный и молекулярный уровни исследования, что дает более полное и информативное разрешение поставленной задачи.

Научно-практическая ценность работы.

Впервые из пивных дрожжей и печени крыс выделен электрофорети-чески гомогенный препарат тиаминпирофосфокиназы и изучены его кинетические параметры. Показано, что фермент обладает четвертичной структурой и доказано наличие его аллостерической регуляции путем взаимодействия активных и аллостерических центров. Представлены новые данные о механизме Т-киназной реакции, которая протекает через образование тройного фермент-субстратного комплекса. Рассчитано количество центров связывания и значения кажущихся констант связывания для каждого из субстратов. При этом разработан радиометрический метод определения активности фермента, который помимо применения в системе in vitro дает возможность изучать динамику образования фосфатных эфиров тиамина in vivo. Исследования показали, что тиаминпирофосфо-киназа имеет широкую субстратную специфичность и номенклатурное название АТР: тиаминпирофосфотрансфераза не соответствует действительности. Правильнее было бы именовать энзим как NTP: тиаминпирофосфотрансфераза или нуклеозидтрифосфат: тиаминпиро-фосфотрансфераза, исходя из широкой субстратной специфичности.

На основании разработанного нами метода количественного определения фосфорилированных аналогов тиамина путем прямого спектрофотометрирования проведено исследование по акцептор-субстратной специфичности Т-киназы, изучена роль отдельных атомов и группировок в молекуле витамина для взаимодействия с ферментом. Выяснение роли функционально активных радикалов, ответственных за фосформирование в Т-киназной реакции, а таг кже за связывание с соответствующими ТРР-зависимыми ферментами позволяет целенаправленно осуществлять синтез различных аналогов витамина с заранее предполагаемыми свойствами. Использование таких аналогов дает, в свою очередь, возможности для расшифровки строения, функционирования и пространственной организации активного центра киназы. Синтезированы новые биоспецифические адсорбенты, содержащие в качестве лиганда тиамин, тиаминпирофосфат или имидозол, не имеющих катионного заряда в месте присоединения вставки к носителю и раз дичащихся степенью гидрофобности. Установлено, что гидрофобные и электростатические взаимодействия существенно не влияют на связывание Т-киназы с матрицей. Разработан метод получения электро-форетически гомогенного препарата тиаминпирофосфокиназы, включающего на начальной или заключительной стадиях аффинную хроматографию на тиаминпирофосфатN-4-азобензоилглицилглицинсе-фарозе с выходом 89 или 72% и степенью очистки 58 или 1200 раз. Впервые для Т-киназы из печени крыс показано, что ТРР даже в области физиологических концентраций является активным ингибитором и, таким образом, может контролировать механизм собственного биосинтеза. Для Т-киназы из обоих источников различными методами доказана функциональная значимость остатков гисти-дина. Показано наличие 2-х SH-групп в молекуле Т-киназы. Модификация одной из них приводит к инактивации фермента, что позволяет отнести Т-киназу в группу SH-энзимов. Результаты комплексного исследования по изучению кинетических характеристик дрожжевой и печеночной Т-киназы не только углубляют и дополняют наши знания о структуре, свойствах, механизме действия фосфотрансфераз, внося тем самым определенный вклад в науку о ферментах, но и способствует развитию такого нового направления как молекулярная витаминология. Сравнительная оценка моле-кулярно-кинетических параметров трех тиаминовых ферментов: Т-киназы, пируватдегидрогеназы и транскетолазы в связи с изучением действия окситиамина в условиях целостного организма животного показала, что только два первых фермента подчиняются закономерностям, установленных на очищенных белках in vitro, конкурентно взаимодействуя с витамином, антивитамином или их пирофосфорными эфирами. Антикоферментное действие ОТРР в отношении транскетолазы не проявляется in vivo при максимальной концентрации антикофермента в тканях в связи с включением ложного кофермента только при de novo синтезе транскетолазы. Апоформа этого фермента в тканях при авитаминозе не накал лив аетоя. На этом основании предлагаются рекомендации по методике применения окситиамина в опытах на животных для преимущественного блокирования пируватдегидрогеназы либо транскетолазы.

Предпринятые нами опыты по определению накопления ТРР в зависимости от концентрации введенного тиамина показали, что ранее применяемые дозы значительно завышены, а данные по антивитаминному действию некоторых антиметаболитов тиамина полностью согласуются с молекулярно-кинетическими параметрами Т-киназы.

Проведенные исследования по определению количества связанного с белком и свободного ТРР в гиалоплазме печени крыс показали, что количество связанной формы в норме постоянно и не повышается при гипервитаминизации. Уровень свободной формы кофермента подвержен значительным колебаниям и при Bj авитаминозе элиминируется в первую очередь. В растворимой фракции клеток печени ТРР связан только с белком транскетолазы. Этот фермент существует исключительно в холоформе. На основании изучения механизмов фосфорилирования ОТ в киназной реакции и включения антикофермента в белок только при de novo синтезе транскетолазы предложена новая модель, совмещения пищевой и антиметаболитной недостаточности тиамина, характеризующаяся резким уменьшением обоих форм ТРР и следовательно угнетением ТРР-зависимых ферментов. Проведенные нами исследования по депонированию *4С-тиамина в субклеточных фракциях белых крыс показали, что витамин накапливается лишь в гиалоплазме и митохондриях. Наличие метки в ядрах и микросомах, установленное в ряде работ, следствие загрязнения гиалоплазмой. В гиалоплазме включение ТРР идет только в белок транскетолазы, в митохондриях исключительно в дегидрогеназы oiкетокислот. На этом основании предложена методика выделения «меченой транскетолазы». Получение меченой транскетолазы из печени свиньи позволило доказать, что связь между коферментом и белком не является кова-лентной, как на это указывалось ранее. Кипячение выделенной и очищенной нами транскетолазы в течение 2-х минут или обработка 10% ТХУ приводили к полному отрыву метки от белка. Тем самым было доказано, что транскетолаза из печени свиньи не является исключением в ряду тиаминовых ферментов. Показано наличие в митохондриях свободной и связанной форм ТРР. При этом количество белковосвязанной кокарбоксилазы составляет 20% от общего пула ТРР. При авитаминозе элиминируется в первую очередь свободная форма, а снижение активности соответствующих ТРР-зави-симых ферментов отмечается только при уменьшении количества протеидизированного тиаминпирофосфата. Концентрация внутрими-тохондриального цула ТРР не возрастает даже после инъекций высоких доз тиамина, что указывает на наличие системы жестко контролирующей его поступление. Изучены трансмембранные механизмы транспорта тиамина. Установлено, что этот процесс связан с наличием специфического белка-переносчика, который впервые нами выделен из животных тканей. Из эритроцитов этот белок получен разработанным нами методом аффинной хроматографии. Сравнительное изучение проницаемости тиамина и ТРР в различные ткани и органы показало, что ТРР не проникает через клеточные мембраны. Преимущество последнего при клиническом применении заключается, вероятно, в более пролонгированном действии. Основным продуктом при инъекции ТРР в клетках являются ТМР и тиамин, Нами впервые показано, что при инъекции тиаминтрифосфата отщепление одной фосфатной группировки от ТТР приводит к транспорту остальной части молекулы в виде ТРР по схеме:

ТТР — ТРР + Р.

Введение

этой формы витамина (TIP) Bj приводит к быстрому накоплению ТРР в тканях и более длительному удерживанию высокого уровня кокарбокеилазы в организме. В этой связи в клинике целесообразнее применять ТТР или неочищенную смесь тиаминфоо-фатов, получаемую на производстве при синтезе ТРР, а не чистый препарат кокарбоксилазы. Аналогично этощ использование трифосфорных антиметаболитов тиамина в лабораторной практике дает возможность для создания быстрых и удобных моделей Bj авитаминоза.

Определено содержание свободной и связанной форм ТРР в эритроцитах. Количество свободного ТРР составляет 80% от общего пула. Характерно, что и в крови отсутствует прямая корреляция между содержанием ТРР и активностью транскетолазы при Bj авитаминозе. Установлено также, что при тиаминовой недостаточности апоформа транскетолазы в эритроцитах не накапливается. В этой связи утверждается, что так называемый ТРР-эффект, тест широко применяемый в клинике при обследовании различного контингента населения, на предмет тиаминовой недостаточности, не соответствует истинному положению вещей. Кроме того, тот факт, что удаление до 80% ТРР из гиалоплазмы* митохондрий эритроцитов не приводит к уменьшению активности соответствующих ТРР-зависимых ферментов указывает на малопригодность определения активности этих ферментов как чувствительного теста на тиами-новый статус. Предлагается в качестве тест-системы на обеспеченность организма тиамином находить общее количество ТРР или концентрацию белковосвязанной кокарбоксилазы.

Разработан радиометрический метод определения активности ТРР-киназы и впервые из гиалоплазмы печени крыс этот фермент получен в частично очищенном состоянии. На основании полученных результатов предполагается, что синтезирующийся в гиалоплазме TIP является депонируемой формой витамина для обеспечения митохондрий ТРР, где биосинтез кокарбоксилазы не обнаруживается.

Показать весь текст

Список литературы

  1. С.М., Краснова В. И. Реакция диэтилпирокарбона-та с имвдозолом и производными гиствдина. — Биоорган, химия, 1975, т. I, № 11, с. 1600−1605.
  2. Арцукевич И. М, Нуклеотидная специфичность тиаминпиро-фосфокиназы из печени щэыс. Биохимия, 1979, т. 44, в. 3, с. 543−547.3.глыгина Е.Р., Телепнева В. М. Выделение НДД-киназы из сердца голубя. Биохимия, 1980, т. 45, в. II, с. 2019−2027.
  3. М.Г. Взаимосвязь пирувата и лактата печени различных видов грызунов-опухоленосителей с гиповитаминозом Bj. В кн: Теоретические и практические аспекты изучения питания человека. Тез. докл. М., 1980, с. 124.
  4. М.Г., Петушок В. Г., Горбач З. В., Требухина Р. В., Островский Ю. М. Уровень лактата в тканях животных с опухолью при введении окситиамина и некоторые свойства лактатдегидроге-назы. Вопр, мед. химии, 1981, № 5, с. 594−600.
  5. В.В. К вопросу о функциональных пулах тиа-минди|юсфата в печени. Известия АН ВХР, Серия биол. нзук, 1976, № 2, с. 74−77.
  6. В.В., Струмило С. А., Мандрик К. А., Островский Ю, М. Изучение тиамин и тиаминдифосфатсвязыващей способности гиалоплазматической фракции печени крыс. Вопр. мед. химии, 1978, т. 24, в. 3, с. 383−389.
  7. Виноградов В. В, Струмило С. А, Механизм активации тиаминпирофоофокиназы печени крыс ионами магния. Биохимия, 1979, т. 44, в, I, с. 50−56.
  8. Г. А., Кобылянская К. П. Природа и функция аминокислотных остатков транскетолазы существенных для проявления ее активности. Биохимия, 1970, т. 35, в. I, с. 3−11,
  9. Г. А., Минин A.A. Выделение транскетолазыиз печени крыс и некоторые ее свойства. Биохимия, 1978, т. 43, № 9, с. I631−1635.
  10. H.A., Забродская G.B., Доста Г, А., Островский D. M" Антивитаминная активность фосфорилированных производных окситиамина. Вопр" питания, 1974, в. I, с. 40−43.
  11. Г. В., Гойло Т, А., Колотилова А, И., Пецке К. Ю. Водорастворимые ядерные и митохондриальные формы дегвд-рогеназ, трансфераз пентозофосфатного пути и нуклеаз в печени нур, Биохимия, 1976, т. 41, в. 2, с. 363−367.
  12. .И. Кинетическое поведение аллостерических ферментов. В сб. «Аллостерические ферменты». Итоги науки и техники, Серия Биологическая химия. Ред. В. Л. Кретович. Изд-во «ВИНИТИ», М, 1975, т, 8, с. 157.
  13. .И. Аллостерические ферменты. Изд-во «Наука», М., 1978,
  14. .И., Поляновский О. Л. Четвертичная структура и аллостерическая регуляция активности ферментов. Журн, Всесоюз. хим. об-ва им, Д. И. Менделеева, 1971, т.16, с. 421−427.
  15. Леус И.§-. Роль митохондрий в обмене фосфорных эфиров тиамина в клетках печени. В сб. «Митохондрии, биохимические функции в системе клеточных органелл». «Наука» М., 1966, с. I5I-I55.
  16. Н.Ф. Уровень синтеза и распада тиаминдифосфата в субклеточных фракциях белых крыс. Укр. биохим, журн, 1967, т. 39, с. 308−312.
  17. Н.Ф. Интенсивность обмена фосфорных эфиров тиамина в субклеточных структурах печени. Витамины, 1974, т. 7, с. ?7−93.
  18. В.И. Стабильность ферментов при очистке. Тезисы Всесоюзного совещания «Кристаллические ферменты, методы получения, их характеристика и использование», Вильнюс, 1975, с. 22,
  19. А.И. К вопросу о взаимоотношениях между тиамином, дифосфотиамином и АКТГ. Труды 1-й биохимической конференции Прибалтийских республик и Белоруссии, Тарту, 1961, с. 110−120.
  20. К., Клибанов A.M., Чернышева A.B., Березин И. В. Основные принципы стабилизации ферментов. Повышение термостабильности оС -химотрипсина при иммобилизации в геле по-лиметакриловой кислоты. Докл. АН БССР, 1975, т. 223, № I, с. 233−236.
  21. Э. Биофизическая химия. Изд-во «Мир», Москва, 1981, с. 142.
  22. Нгуен Ван Тхиет, Телепнева В. И. Четвертичная структура НАД-киназы. Биохимия, 1981, т. 46, в. 3, с. 435−443.
  23. Ю.М. Тиамин. Изд-во «Белорусь», Минск, 1971.
  24. Островский Ю. М, Кокарбоксипаза и другие тиаминовые ферменты. Изд-во «Наука и техника», Минск, 1974, с. 63.
  25. Ю.М. Активные центры и группировки в молекуле тиамина. Изд-во «Наука и техника». Минск, 1975, с. 47.
  26. Ю.М., Мосолов Н"Н., Степуро И. И., Гриневич В. П. Факторы, обуславливающие характер взаимодействия тиамин-ди$осфата с субстратом и апоферментным белком. Витамины, 1974, т. 7, с. 140−146.
  27. Ю.М., Ульрих И., Хольцер X. Молекулярный вес тиаминкиназы из печени крыс. Докл. АН БССР, 1971, т. 15, с. 755−757.
  28. Ю.М., Черникевич И. П., Воскобоев А. И., Шелленбергер А, Взаимодействие аналогов тиамина с дрожжевой тиаминпирофосфокиназой. Биоорган, химия, IS77, т. 3, № 8,с. 1083−1089.
  29. Ю.М., Забродская C.B. Антивитаминная активность тетрагидротиамина и его фосформированных производных в опытах на белых мышах. Докл. АН ВХР, 1980, т. 24, № 6, с. 558−561.
  30. Ю.М., Рыбина A.C., Польщак Р. Б. Разделение фосфорных эфиров тиамина на катионообменном сефадексе. Укр, биохим. журн., 1976, т. 48, № 3, с. 381−38?.
  31. О.Л. Четвертичная структура и аллостери-ческие свойства ферментов. В сб. «Аллостерические ферменты». Итоги науки и техники. Сер, Биологическая химия. Ред. B.JI. Кретович. Изд-во «ВИНИТИ», 1975, т. 8. с, 5−18.
  32. А.Я. Метаболизм фосфорных эфиров тиамина S в животном организме. Биохимия, I960, т. 25, в. 6, с. 991−1000.
  33. Розанов А, Я. Динамика метаболизма тиамина, его биологическое значение и зависимость от функций пищеварительной системы. В сб. «Тиамин». Ред. А. А. Титаев. Изд-во «Наука», 1978, с. 27−81.
  34. A.C. Распределение тиамина в субклеточных фракциях печени крыс в норме и после дополнительного его введения. Укр. биохим. журн., 1969, т. 41, с. 475−479.
  35. A.C., Пархоменко Ю. М., Чаусовский Г. И. О внутриклеточной локализации и регуляции образования фосфорных эфиров тиамина, синтеза тиамиццифосфат содержащих ферментов и их активности. В сб. «Витамины», 1974, в. 7, с. 184−197.
  36. А.С., Халмурадов А. Г., Пархоменко Ю. М. Белки, специфически связывающие тиамин, и их биологическая роль., Укр. биохш. журн., 1980, т. 52, Р 5, с. 652−667.
  37. Г. Новые методы исследования четвертичной структура белков. В кн.: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Ред. Ю. А. Овчинников. Изд-во «Мир», М., 1974, с. 419−423.
  38. Северин С. Е, Цейтлин Л. А., Бойко С. С. Содержание тиамина и активность тишиндифосфат содержащих ферментов при адреналиновом миокардите. Вопросы мед" химии, 1968, т. 14, Р 6, е. 622−627.
  39. Г. В., Ливанова Н. Б., Курганов Б.1. Аллосте-ржческое ингибирование фосфорижазы Б из мыщ кролика. Молекул, биол., 1979, т. 3, с. 768−771.
  40. Е.Ф., Хмелевский Ю. В. Некоторые вопросы клинической витаминологии. Врачебное дело* 1964, т. 2, с. 3−8.
  41. Ю.Е. Сера в белках. Мзд-во «Наука», Москва, 1964, с. 229.
  42. В.Н., Хал^урадов А.Г. Биохимические аспекты транспорта тиамина. Укр. биохим. журн., 1980, т. 52, Р I, с. ИО-122.
  43. ПЛ., Тихомирова Н. К., Котеров А. А., Шестакова И. К., Кочетов Г, А. Транекетолаза из печени свиньи: кова-лентная евязь между коферментом и белком* Биохимия, 1980, т. 45, в. 2, с. 305−310.
  44. Т.Н., Островский Ю. М. Обмен пирувата у 1фыс при пищевом Bj авитаминозе. Вопросы питания^ 1978, Р б, с. 5 О- 54.
  45. Anderson I.A., Kunitz G.P., EvansH.H., Swift T.I. Preferential interaction of manganous ions with the guanine moiety in nucleosides, dinucleoside monophosphates and deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1971, v. 10, Ж 24, p. 4368−4374.
  46. Andrews P., Folley S.J. Estimation of the molecular weights of proteins by Sephadex-gel filtration. Biochem.
  47. J., 1964, v. 91, I 1, p. 222−228.
  48. Andrews P. Gel-filtration behaviour (c)f proteins related to their molecular weights over a wide range. Biochem. J., 1965, v. 96, p. 595−603.
  49. Apps D.K. Pigeon liver HAD-kinase. The structural and kinetic basis of regulation by ЖАЖ. Bur. J. Biochem., 1975, v. 55, p. 474−483.
  50. Balagahi Ж., Pearson 1.Ж. fissue intracellular distribution of thiamine in normal and thiamine-deficlent rats. J. Hutr., 1966, v. 89, Ж 2, p. 123−134.
  51. Banga J, Ochoa S., Peters R.A. Pyruvate oxidation in «brain. The active form of vitamin B1 and the roleof C^ dicarboxylic acids. Biochem. J., 1939, v. 33, p. 11 091 116.
  52. Barachi P.Z., Braun P.E. Thiamine triphosphatase in the nervoud system. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 255, p. 402−407.
  53. Berman K., Fishman R.A. Thiamine phosphate metabolism and possible coenzyme-independent functions of thiamine in brain. J. Neurochem., 1975, v. 24, N 3, p. 457−465.
  54. Binet Z., Minz B. Sur les reactions biochimiques do nerf an repos et an cours d’une exitation electrique. Arch. Intern. Physiol., 1936, v. 42, p. 281−300.
  55. Boyer P.D. Spectrophotometric study of the reaction of protein sulphydryl groups with organic mercurials. J.Amer. Chem. Soc., 1954, v. 76, ET 17, p. 4331−4337.
  56. Brin M., Tai M., Ostashever A.S., Kalinsky H.J. The effect of thiamine deficiency on the activity of erythrocyte hemolysate transketolase. J. Uutr., 1960, v. 71, N 3, p. 273−280.
  57. Butterworth P.H., Baum H., Porter J.W. A modification of the Ellman procedure for the estimation of protein sulf-hydryl groups. Arch. Biochem., 1967, v. 118, U 3, p. 716−723.
  58. Camiener G.W., Brown G.M. The biosynthesis of thiamine fractionation of enzyme system and identification of thiasole monophosphate and thiamine monophosphate as intermediates. J. Biol. Chem., 1960, v. 235, p. 2411−2417.
  59. Chen C.P. Active transport of thiamine freshly isolated rat hepatocytes. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1978, v. 24, IT 4, p. 251−362.
  60. Chen C.P., Coch M., Shank R.E. Leucocyte transketo-lase activity as an indicator of thiamin nutriture in rats. -J. Hutr., 1976, v. 106, H 11, p. 1678−1685.
  61. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. Biochim. Biophys. Acta, 1963, v. 67, p. 104−137.
  62. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. Inhibition, nomenclature and theory. Biochim. Biophys. Acta, 1963, v. 67, p. 173−187.
  63. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reac -tions with two or more substrates or products. Prediction of initial velocity and inhibition, patterns by inspection. -Biochim. Biophys. Acta, 1963, v. 67, p. 188−201.
  64. Coates M.E. In: Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl. Bell D.J. and Freeman B.M. eds. Academic Press. London and Hew York, 1971, v. 1, p. 337−392.
  65. Cominciolo V., Reggiani C., Patrini C., Rindi G. A preliminary approach to the study of thiamine phosphorylation and dephosphorylation in some rat nervous regions and the liver. Brain. Res., 1980, v. 199, N 2, p. 482−487.
  66. Cooper J.R., Kalyanpur S.G. Subcellular distribution of thiamine pyrophosphokinase activity in nervous tissue. -Pharmacologist, 1963, v. 5, p. 263−267.
  67. Cooper J.R., Roth R.H., Kini M.M. Biochemical and physiological function of thiamine in nervous tissue. nature, 1963, v. 199, p. 609−610.
  68. Cooper J.R., Itokawa Y., Pincus J.H. Thiamine triphosphate deficiency in subacute necrotizing encephalomyelo-pathy. Science, 1969, v. 164, p. 72−73.
  69. Cooper J.R., Pincus J.H., Itokawa Y., Piros K. Experience with phosphoryl transferase inhibition in subacute necrotizing encephalomyelopathy. Uew Engl. J. Med., 1970, v.283, p. 793−795.
  70. Cuatrecasus P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and poliacrylamide beads. J. Biol. Chem., 1970, v. 245, p. 3059−3065.
  71. Cuasaro G., Rindi G., Sciorelli G. Subcellular distribution of thiamine pyrophosphokinase and thiamine pyrophosphatase activities in isolated enterocytes. Inter. J. Vitamin. Hutr. Res., 1977, v. 47, IT 2, p. 99-Ю6.
  72. Datta A.G., Racker E. Mechanism of action of trans-ketolase. I. Properties of the crystalline yeast enzyme. J. Biol. Chem., 1961, v. 236, П 3, p. 617−623.
  73. Datta A.G., Racker E. Mechanism of action of trans-ketolase. II. The substrate enzyme intermediate. J. Biol. Chem., 1961, v. 236, N 3, p. 624−629.
  74. Davis B.I. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964, v. 121, p. 404−406.
  75. Davis B.I., Ornstain L. A new high isolation electrophoresis method. Deliv. at the Soc. for the Study Blood at the Hew York Acad. Med. 1959.
  76. Eichenbaum J.W., Cooper J.R. Relation by thiamin of the action potential in ultraviolet irradiated nerves. Brain Research, 1971, v. 32, p. 258−260.
  77. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem, and Biophys., 1959, v. 82, N1, p. 70−77.
  78. Euler H.V., Vestin R. Enzymic synthesis of cocarbo-xylase from vitamin B^ and phosphate. Natur Wissenschaften, 1937, v. 25, p. 416−422.
  79. Ferrari G., Ventura U., Rindi G. Transporto intestinale in vitro della thiamina in fluenza del lia. Boll. Soc. Ital. Biol. Sper., 1969, v. 45, p. 1546−1549.
  80. Ferrari G., Ventura U., Rindi G. The Ua+ -dependence of thiamine intestinal transport in vitro. Life Sci. (Oxford) 1971, v.1, p. 67−75.
  81. Ferrari G., Rindi G., D1Andrea G. The action of inorganic phosphate on thiamine transport by rat everated Jejunal sacs. Pflugers Arch., 1978, v. 376, N 1, p. 47−53.
  82. Fites R.C., Molin W.T. Thiamin stabilisation of thiamin pyrophosphotransferase against: inactivation by thermal and low pH treatments. Plant Sci. Left, 1979, v. 14, N 4, p.381−386.
  83. Fisher I.R. Guide for interpreting substrate nonlinear steady-state enzyme kinetics data using random models.- Arch. Biochem. and Biophys., 1972, v. 152, H 6, p. 638−646.
  84. Florini J.R., Vestling C.S. Graphical determination of the dissociation constants for two substrate enzyme systems.- Biochim. Biophys. Acta, 1957, v. 25, H 4, p. 575−578.
  85. Forsander 0. Studies on the phosphorylation of thiamine by thiaminokinase from baker’s yeast. Comment, phys.-math., Helsingfors, 1956, v. 19, H 2, p. 3−42.
  86. Fujiwara M., Watanabe H., Matsui V. Allithiaminea newly found derivative of vitamin B^. Discovery of allithiamine. J. Biochem., 1954, v. 41, N 1, p. 29−39.
  87. Gassmann B., Keitz H.A., Haence H. Vitamin B^ im Magen-Darmtrakt der Ratte Esorption and Excretion. Biochem.
  88. Z., 1961, v. 334, I 3, p. 245−254.
  89. Greif S., Hochegger M., Bermanl M. Brenztraubensaure und Gocarboxylase bei Herzdekompensation. Wiener Klin. Wo-chenschr., 1957″ v. 69, Ж1, p. 33−38.
  90. Griffith, S.W., Garrawag C., beach f.I. Vitamin transport in I. coli. Pederat. Proc., 1971, v. 30, S3, p. 115−116.
  91. Haba G., beder I.G., Backer E.J. Crystalline trans-ketolase from baker*s yeast- isolation and properties. J. Biol. Chem., 1955″ t. 214, H 1, p. 419−426.
  92. Hamada M. Studies on thiamine pyrophosphokinase from pig heart muscle. J. Jap. Biochem. Soc., 1969, v. 41, p.837−842.
  93. Hamada M. Purification and properties of thiamine pyrophosphokinase from pig heart. Seikigaku, 1970, v. 41, p. 310−324.
  94. Homaond G. BV !0he effect of freezing liver tissue on its thiamine pyrophosphate comtent. Biochim. Biophys.
  95. Acta, 1952, v. 8, IT 1, p. 103−110.
  96. Hashimoto S., Seo T. On dynamic equilibrium of „bound thiamine. Localization of phosphorylating activity of thiamine in liver cells. Vitamins, 1959, v. 16, p. 93−98.
  97. Heinrich C.P., Wiss 0. Subunut size of transketola-se from baker’s yeast. PEBS Lett., 1971, v. 14, N 12, p.251−253.
  98. R.M., Leike C.L., Suelter C.N. 5'-Adenosine monophosphate aminohydrolase. Evidence for anomalous substrate saturation kinetics at low enzyme concentrations. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, p. 7237−7242.
  99. Henderson G.B., Zevely E.M. Binding and transport of thiamine by Lactobacillus casei. J. Bacterid., 1973, v. 133, N 3, p. 1190−1196.
  100. Henderson G.B., Zevely E.M., Kadner R.J., Huennekes P.M. The folate and thiamine transport protein of thiamine transport proteins of Lactobacillus casei. J. Supranid. Struct., 1977, v. 6, N 2, p. 239−247.
  101. Henderson G.B., Zevely E.M., Huennekes P.M. Mechanism of folate transport in Lactobacillus casei. Evidence for a component shared with the thiamine and transport system. -J. Bacterid., 1979, v. 137, N 3, p. 1308−13H.
  102. Hoyampa A., Middleton A., Wilson P., Shenker S. Thiamine transport across the rat liver intestine. I. Normal Characteristics. Gastroenterology, 1975, v. 68, N 5, p. 12 181 227.
  103. Iakahashi K., Nakamura A., Nose Y. Effect of thiamine deficiency and thiamine administration on the thiamine diphosphate dependent enzymes in rat liver. J. Vitaminol., 1971, v. 17, N 8, p. 207−214.
  104. Iveda К., Itokawa J., Fujiwara M. The transport mechanism of thiamine propyl disulfide into human blood cell membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 249, TI 3, p. 373 379.
  105. Isao Т., Saiton S., Ishikawa M. Purification and properties of transketolase from pig liver. I. An attempt to resolve the enzyme into apoenzyme and cofactors. J. Hutr. Sci. Vitaminol., 1979, v. 25, H 2, p. 175−184.
  106. Itokawa J. Is calcium deficiency related to thiamine dependent neuropathy in pigeon? Brain Research, 1975, v.94,1. N 5, p. 475−484.133″ Itokawa J. Thiamine and nerve membrane. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1976, v. 22, N1, p. 17−19.
  107. Itokawa J., Cooper J.R. The enzymatic synthesis of triphosphothiamin. Biochim. Biophys. Acta, 1968, v. 158, N 2, p. 180−182.
  108. Itokawa J., Cooper J.R. On relationship between ion transport and thiamine in nervous tissue. Biochem. Pharmacol., 1959, v. 18, p. 545−547.
  109. Itokawa J., Cooper J.R. Ion movements and thiamine in nervous tissue. II. The release of the vitamin from membrane fragments, o- Biochim. Biophys. Acta, 1970, v. 196, П 3, p. 274−284.
  110. Itokawa J., Schulz R.A., Cooper J.R. Thiamine in nerve membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 266, N 3, p. 293−299.
  111. Iwashima A., Nishino H., Nose J. Conversion of thiamine to thiamine monophosphate by cell-free extracts of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 258, p. 333−340.
  112. Iwashima A., Nishino H., Hose J. Carrier-mediated transport of thiamine from baker’s yeast. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 330, p. 222−234.
  113. Iwashima A., Wakabayashi J., Hose J. Thiamine transport mutants of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 413, N 2, p. 243−247.
  114. Kabak H.R. Transport studies in bacterial membrane vesicles. Science, 1977, v. 186, N 4167, p. 882−886.
  115. Kawasaki T., Iwashima A., Nose Y. Regulation of thiamine biosynthesis in Esherichia coli. J. Biochem., 1968, v. 65, N 3, p. 407−416.
  116. Kaziro Y. Quantitative determination of thiamine pyrophosphate using apocarboxylase and alcohol dehydrogenase. -J. Biochem., 1957, v. 44, N 7, p. 827−838.
  117. Kaziro Y. Studies on thiaminokinase from baker’s yeast. Purification and properties. J. Biochem., 1959a, v. 46, N11, p. 1523−1539.
  118. Kaziro Y. Studies on thiaminokinase from baker’s yeast. Nucleotide specificity. J. Biochem., 1959b, v. 46, N 12, p. 1587−1596.
  119. Kiessling K.H. Thiamine triphosphate in baker’s yeast. Nature, 1959, v. 172, N 6, p. 1187−1188.
  120. Kiessling K.H. Thiamine triphosphate. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v. 20, N 2, p. 293−298.
  121. Kiessling K.H. Cocarboxylase activity of thiamine. triphosphate in yeast transketolase. Acta Chem. Scand., 1958, v. 12, p. 663−665.
  122. Kiessling K.H. Thiamine triphosphate in liver and brain of the rat. Biochim. Biophys. Acta, 1961, v. 46, U 3, p. 603−604.
  123. Kiessling K.H., Ludquist C.J. Thiamine diphosphate in growing tissues. Pyruvate oxidation in liver mitochondria from young and from thiamine diphosphate deficient adult rats.- Exp. Cell. Res., 1962a, v. 26, 11, p. 189−197.
  124. Kiessling K.H., Ludquist C.J. Pyruvate oxidation in muscle mitochondria from young rats and in mitochondria from maligmant tissues. Exp. Cell. Res., 1962b, v. 26, N 1, p.198−204.
  125. Kimura M., Itokawa Y. Separation and determination of thiamine-binding protein in rats by high performance liquid chromatography. J. Chrom., 1982, v. 211, U 1, p. 290−294.
  126. Kishi H., Hiraoka E. Studies on deoxythiamine. The effects of deoxythiamine on enzymes related to thiamine. Vitamins, 1967, v. 35, IT 2, p. 146−151.
  127. Kyosen B., Sigurd H., Seim M. The transketolase assay of thiamine in some diseases. Am. J. Clin. Nutr., 1977, v.30, U 10, p. 1591−1596.
  128. Koedam J.C., Stein-Parve E. Pyrithiamine as an antagonist of thiamine in mice. Konkl. Med. Acad. Wetenshap. Proc. Ser. C., 1959, v. 62, U 3, p. 400−403.
  129. Koedan J.C., Stein-Parve E. The action of thiamine antagonists upon some enzymes involved in thiamine metabolism.- Konkl. Med. Acad. Wetenshap. Proc. Ser. C., 1960, v. 63, IT 3, p. 318−334.
  130. Kohno K., Noda K., Misole M., Utsumi I. Enzymatic reduction of disulfide type thiamine derivatives. Biochem.
  131. Pharmacol., 1969, v. 18, N 4, p. 1685−1671.
  132. Kohibe N., Yusa Т., Hagaski K. Occurrense of thiamine triphosphate in higher plants. Plant. Cell. Physiol., 1963, v. 4, N 2, p. 239−242.
  133. Komai Т., Shindo N. Structural specificities for the active transport system of thiamine in rat. Small intestine. J. Nutr. Sei. Vitaminol., 1972, v. 18, N 1, p. 55−62.
  134. Komai Т., Shindo H. Transport of thiamine into red blood cells of rat. J. Nutr. Sei. Vitaminol., 1974, v. 20, N 1, p. 189−196.
  135. Lasarov Y., Bohorov 0., Doncheva A. Effect of Land D-tyrosine on in vitro transport and phosphorylation of thiamine in rats. Comp. Biochem. Physiol., 1979, v. 66, N 2, p. 145−147.
  136. Leach F.R., Garraway A.C. Thiamine transport in E-scherichia coli crooks. In: Methods in Enzymol., New York,
  137. San Francisko, London, Acad. Press, 1979, v. 62, p. 76−93″
  138. Lechaf P. Pharmakologie des Vitamins B1. Wienar klin. Wsch., 1961, Bd. 73, S. 42−47.
  139. Lee Kai-Lin, Darke P.L., Keimey F.T. Role of coenzyme in aminotransferase turnover. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, N 14, p. 4958−4961.
  140. Leigh S. Substrate necrotizing encephalomyelopathy in an infant. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat., 1951, v. 14, N 3, p. 216−221.
  141. Leuthardt F., Nielsen H. Phosphorylation biologique de la thiamine. Helv. Chim. Acta, 1952, v. 35, p. 1196−1209.
  142. Lodigiani E. Repeto di iperpicuvicemia nella dis -trofia muscolare progressiva. Minerva Med., 1955, v. 1, N 18, p. 725−729.
  143. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1953, v. 193, N 1, p. 265−275.
  144. Luck G., Limmer Ch. Conformational aspects and reactivity of DNA effects of manganese and magnesium ions on interaction with DNA. Eur. J. Biochem., 1972, v. 29, N 3, p. 528 537.
  145. Lumeng L., Edmondson J.W., Schenker S., Tiny-Kai Li.
  146. Mehaneho H., La Yell M., Henderson G.B. Transport and accumulation of pyridoxine and pyridoxal by erythrocytes. -J. Biol. Chem., 1980, v. 255, H 24, p. 1901−1907.
  147. Melehior W.B., Fahney D. Ethoxyformylationof proteins. Reaction of exthoxgrformic „anj^-dride with L-chimotrypsin, pepsin, and pancreatic ribohuelease at pH-4.0. Biochemistry, 1970, v. 9, 12, p. 251−258.
  148. Middleton E.J., Morrison A.B. Vitamin absorption studies. 2. The utilization of riboflavin and thiamine given orallyor parenterally at periodic intervals. J. ITutr., 1962, v. 77, N 1, p. 115−118.
  149. Middleton E.J., Griece H.C. Vitamin absorption studies. Site of absorptiob of -riboflavin andS-thiamine in the rat. Canad. J. Biochem., 1964, v. 42, IT 4, p. 353−358.
  150. Miller W.I. Ehglish patent IT 1 288 438, 1970.
  151. Minz B. Sur la liberation de la vitamine B^ par le tronc isole de nerf pneumogastrique soumits a llexcitation electrique. C.r. Soc. Biol., 1938, v. 127, N 9, p. 1251−1253.
  152. Mitsuda H., Tanaka T., Kawai P. Biosynthesis of thiamine in plants. Enzymic formation of thiamine from pyrithiamine and thiasole moieties. J. Vitaminol., 1970, v. 16, N 14, p. 263−268.
  153. Mitsuda H., Tanaka T., Takii P., Kawai P. Biosynthw-sis of thiamine in plants. Biosynthetic pathway of thiamine monophosphate from pyrimidine and thiasole moieties. J. Vitaminol., 1971, v. 17, N 2, p. 89−95.
  154. Mitsuda H., Takii Y., Iwami K., Yasumoto K. Enzymic formation of thiamine pyrophosphate in plants. J. ITutr. Sci. Vitaminol., 1975a, v. 21, IT 1, p. 16−20.
  155. Hutr. Sci. Vitaminol•, 1975c, v. 21, IT 3, p. 189−198.
  156. Muniyappa K., Adiga R.P. Nature of the thiamine-bin-ding protein from chicken egg yolk. Biochem. J., 1981, v.193, N 3, p. 679−685.
  157. Muralt A. The role of thiamine (vitamin B1) in nerve excitation. Exp. Cell. Res. Suppl. S., 1958, v. 24, N1, p. 72−79.
  158. Murdock D.5., Gubler C.J. Effect of thiamine deficiency and treatment with the antagonist oxythiamine and pyri-thiamine on the levels and distribution of thiamine derivatives in rat brain. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1973, v. 19, N 4, p. 237−244.
  159. Murphy J., Craig L., Clev B. Leigh disease. Arch. Neurol., 1974, v. 31, N 4, p. 220−227.
  160. Murphy J., Furman F., Hodach A. Characteristics of an acid active thiamine diphosphatase from beet brain. Neu-rochem. Res., 1980, v. 5, N 2, p. 145−147.
  161. Myer Y.P., Shellman J.H. The interaction of ribo-nuclease with pyrine and pyrimidine phosphates.0 Binding of adenosine 5-monophosphate to ribonuclease. Biochim. et Biophys. Acta, 1962, v. 55, N 3, p. 361−373.
  162. Neyjar H.J. Transport of B1-vitamins in microorga35nisms. I. Permeability of lactobacillus-fermenti to -^S-thia-mine. Acta Chem. Scond., 1963, v. 17, N7, P- 1902−1906.
  163. Neyjar H.J. Transport of B1-vitamins. II. Factors affecting the uptake of labelled thiamine by nonproliferating cells of Lactobacillus fermenti. Acta Chem. Scand., 1966, v. 220, H 3, p. 771−776.
  164. Neumann C.G., Swendseid M., Jacob M., Sheim E.R., Dirige O.V. Biochemical evedence of thiamine deficiency in young chanain children. Amer. J. Clin. Nutr., 1979, v. 32, K 1, p. 99−104.
  165. Ilewell P.C., Tucker R.G. The control mechanism of thiamine biosynthesis. A model for the study of control of converging pathway. Biochem. J., 1966, v. 100, U 2, p. 517−524.
  166. Nishimune T., Hayashi R. Thiamine-binding protein and thiamine uptake by Escherichia coli. Biochim. et Biophys. Acta, 1971, v. 244, N 3, p. 573−583.
  167. Uishimune T., Hayashi R. Purification and some properties of thiamine-binding protein of Escherichia coli. Biochim. et Biophys. Acta, 1973, v. 328, N 1, p. 124−132.
  168. Uishimune T., Hayashi R. A rapid assay procedure for thiamine-binding protein of Escherichia coli. Anal. Biochem., 1973, v. 53, N 1, p. 282−287.
  169. Uishimune T., Hayashi R. Mg2+ ATP-ase defective mutant of Escherichia coli and thiamine transport. — Experi-entia, 1979, v. 35, N 10, p. 1318−1320.
  170. Hishino H. Partial purification and some propertiesof thiamine monophosphate kinase.
  171. Hishin© H.“ Iwashima A., lose I. Regulatory properties of thiamine monophosphate kinase. J. Ifutr. Sei. Tita-minol., 1973, v. 19, 16, p. 505−511.
  172. Nishino A., Mshino H., Iwashima A. Presence of a thiamine-Mnding protein in rice bran. J. Hutr. Sei. Vitami -nol“, 1980, v. 26, IT 6, p. 415−418.
  173. O’Brien T.A., Schrock H.L., Russel P., Blake R.I., Gennis R.B. Preparation of Escherichia coli pyruvate oxidase utilizing a thiamine pyrophosphate affinity column. Biochim. et Biophys. Acta, 1976, v. 452″ H 1, p. 13−29.
  174. Ochoa S. Enzyme synthesis of cocarboxylase in animal tissues. Biochem. J., 1939, v. 33, N 9, p. 1262−1270.
  175. Ochoa S., Peters R.A. Enzymic mechanisms of C02 assimilation. Hature, 1946, v- 158, p. 107−111.
  176. Okazaki K. Evidence for existence and a tentative identification of coenzyme in geast thiamine pyrophosphokina-se. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 64, Ii 1, p. 2027.
  177. Okuda K., Kurashige M., Takamatsu A. Intestinal ab-35sorption of -^S-labelled thiamine and its carboxyl derivative in man and animals. Intern. J. Vitaniinforsh., 1968, v. 38,1. N 1, p. 86−96.
  178. Ozawa T., Sation S., Pomita J. The coenzyme activities of 2'-substituted thiamine derivatives. The activities of 2' northiamine and 21 ethylthiamine as coenzyme for apotrans-ketolase. Vitamins, 1971, v. 44, N 5, p. 303−307.
  179. Patrini C., Rindi G. An improved method for the elec-trophoretic separation and fluorometric determination of thiamine and its phosphates in animal tissues. Internat. J. Vit. Nutr. Res., 1980, v. 50, Iff 1, p. 10−18.
  180. Patrini C., Cusaro G., Perrari G., Rindi G. Thiamine transport by rat small intestine in vitro: Influence of endogenous thiamine content of? jejunal tissue. Acta Vitaminol. En-zymol., 1981, v. 3, N 1, p. 17−26.
  181. Penttinen H.K., Utiola L. The relation of the soluble thiamine triphosphatase activity of various rat tissues to nonspecific phosphatases. Medical Biology, 1981, v. 59, p. 177−184.
  182. Peterson J.W., Gubler C.J., Kuby S.A. Partial purification and properties of thiamine pyrophosphokinase from pig brain. Biochim. et Biophys. Acta, 1975, v. 397, N 2, p. 377 394.
  183. Petropolus S.P. The action of an antimetabolite of thiamine on single myelinated nerve fibres. J. Cell. Comp. Physiol., 1960, v. 56, H1, p. 7−13.
  184. Phillips E. Adenosine and adenine nucleotides. Ionisation metal complex formation and conformation in solution, Chem. Reviews, 1966, v. 66, p. 501−527.
  185. Pincus J.H., Itokawa Y., Cooper J.R. Enzyme-inhibiting factor in subacute necrotizing encephal (c)myelopathy. Jfeu-rology, 1969, v. 19, p. 841−845.
  186. Pincus J.H., Cooper J.R., Itokawa Y., Gumbinas M. Subacute necrotizing eneephalomyelopathy. Effects of thiamine and thiamine propyl disulfide. Arch, leurol., 1971, v. 24, ® 4, p. 511−517.
  187. Pincus J. H», Cooper J.R., Itarphy J.Т., Rabe E.E., Lonsdale D., Вшт E.G. .Thiamine derivatives in subacute necrotizing encephalomyelopathy. Pediatrics, 1973, v. 51, Ж 9, p. 716−721.
  188. Pincus J.H., Solitare G.B., Cooper J.R. Thiamine triphosphate levels and hist (c)pathology. Correlation in Leigh disease. Arch. Neurol., 1976, v. 33, I 6, p. 759−763.
  189. Piatt B.S. Thiamine deficiency in human beriberi and in Wernicke’s encephalopathy. In: Wdlsterholmi G.E.W. and O’Connor M. Thiamine Deficiency. Boston, Little Brown, 1967, p. 135−143.
  190. Polin D., Lonkides M., Wynosky E., Porter C. Studies on thiamine absorption. Proc. Soc. Exj). Biol. a. Med., 1964* v. 115, Я 3, p. 735−740.
  191. Reed b.6″, Pettif Т.Н., Roche T.C., Butterworth P. Regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex by phosphorylation and dephosphorylation. In: Protein Phosphorylation in Control. Mechanisms. — lew York, 1973, p. 83−87.
  192. Reinauer H., Grassow G., Hollman S., Activitats an-derungen der Pyruvatdehydrogenase im Thiaminmangel. Hoppe
  193. Seyl. Zeitschr. Phys. Chem., 1968, M. 349, S.251* Reynafarue B., Lehninger A.L. An alternative membrane transport for phosphate and adenine nucleotides in mitochondria and possible function" Proc. nat. Acad. Sci., USA, 1978, v. 75, N 10, p. 4788−4792.
  194. Rindi 6., Guiseppe L. The content (c)f thiamine and its mono-, di-, and tri-phosphoric esters in different biological materials. International Review of Vitamin — Research, 1961, v. 31, K 3, p. 321−326.
  195. Rindi G., Perri V., De C&ro L, The uptake of pjrrithiamine by cerebral tissue. Experientia, 1961, v. 17, H 8, p. 541−551.
  196. Rindi G., Giuseppe L., Garo L. Taux d’esters phos-phoriques de thiamine dans les tissues de rats traiter a la thiamine. Intern. :Ztsch. Vitaminforsch., 1962, v. 32, N 2, p. 142−148.
  197. Rindi G., Guiseppe L., Ventura U. Distribution and phosphorylation of (c)xythiamine in rat tissues. J. Mutr., 1963″ v. 81, 12, p. 147−154.
  198. Rindi G., Ventura U., Guiseppe L., Sciorelli G. Phosphorylation (c)f thiamine in the intestinal wall during absorption in vivo. Experientia, 1966, v. 22, U 7, p. 473−478.
  199. Rindi G., Ventura U. Phosphorylation and uphill intestinal transport of thiamine in vitro. Experientia, 1967, v. 23, 12, p. 175−176.
  200. Rindi G., Ventura U. Thiamine intestinal transport. Physiol. Rev., 1972, v. 52, I 4, p. 821−827.
  201. Ruenwongsa P., Cooper J. The role of bound thiamine pyrophosphate in the synthesis of thiamine triphosphate in rat liver. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 482, Jf 1, p. 64−70.
  202. Rybbins W.J., Kavanagh F. Pyrimidine and thiasole intermediates as substrates for vitamin B^, Proc. Natl. Acad. Sci., 1937, v. 23, p. 499−507.
  203. Ryoko Y., Masaru K., Hiroo A., Akihiro J. Biochemical analysis of vitamin B-j metabolism in normal subjects. -Vitamins, 1978, v. 52, N 2, p. 89−95.
  204. Sanemory H., Yoshida S., Kawasaki T. Studies on the binding of thiamine pyrophosphate to apoenzyme of yeast pyruvate decarboxylase. J. Biochem., 1974, v. 75, N 1, p. 123−129.
  205. Sanemory H., Egi Y., Kawasaki T. Pathway of thiamine pyrophosphate synthesis in micrococcus denitrificans. J. Bacteriol., 1976, v. 126, IT 3, p. 1030−1036.
  206. Sanemory H., Kawasaki T. Purification and properties of thiamine pyrophosphokinase in paracoccus denitrificans. J. Biochem., 1980, v. 88, U 1, p. 223−230.
  207. Sanemory H., Ucki H., Kawasaki T. Reversed-phase high-performance liquid chromatographic analysis of thiamine diphosphate esters at subpicomole levels. Anal. Biochem., 1980, v. 107, N 2, p. 451−455.
  208. Sasa M., Takemoto I., Nishino K., Itokawa Y. The role of thiamine excitable membrane of kraybism giant axon.-J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1976, v. 22, N1, p. 21−24.
  209. Segre A. Cocarboxylase. Arsnemittel Forsch., 1959, v. 9, N 1, p. 8−16.
  210. Seijo L., Arnaiz R.L. Subcellular distribution of thiamine pyrophosphatase in rat cerebral cortex. Biochim. et Biophys. Acta, 1970, v. 211, IT 3, p. 555−561 .
  211. Sempuku K., Nishimura H., Iwashima A. Photoinactiva-tion of the thiamine transport system in Saccharomyces cerevi-siae. Biochim. et Biophys. Acta, 1981, v. 645, IT 1, p. 226 228.
  212. Shaler K, Holler H. Thiamine absorption in the rat. Intestinal alkaline phosphatase activity in vitro and in vivo.- Int. J. Vitamin and Hutr. Res., 1975, v. 45, N1, p. 30−38.
  213. Shaler K., Holler H. Thiamine absorption in the rat.- Intern. J. Vit. Nutr. Res., 1974, v. 44, IT 6, p. 443−450.
  214. Scharma S.K., Quastel J.H. Transport and metabolism of thiamine in brain. Biochem. J., 1965, v. 94, U 3, p. 770 800.
  215. Shimazono IT., Mano Y., Tanaka R., Kaziro Y. Mechanism of transpyrophosphorylation with thiaminokinase. J. Biochem., 1959, v. 46, IT 7, p. 959−961.
  216. Sluyterman L.A. Photooxidation, sensitized by proflavine of furfuryl alcohol, IT-allyl thiourea and histidine. -Recueil. trav. chim., 1961, v. 80, IT 10, p. 989−998.
  217. Soodak M., Cerecedo L.R. Studies on Oxythiamine. -J. Am. Chem. Soc., 1944, v. 66, IT 11, p. 1988−1993.
  218. Spande T.F., Witkop B. Reactiviting toward N- Beom-succinimide as a criterion for buried and exposed tryptophan.- Method Enzymol•, 1967, v. 9, p. 528−532.
  219. Stein-Parve E.P. Partial purification and properties of thiaminokinase from yeast. Biochim. Biophys. Acta, 1952, v. 8, IT 1, p. 310−324.
  220. Suzuoki Z. Thiamine uptake by yeast cells. J. Biochem., 1955, v. 47, N1, p. 27−39.
  221. Suzuoki L., Furuno K., Murakami K., Fujita T, Matsu-oka T., Takeda K. Antithiamine activity of dimethialium and its mode of action. J. Nutr., 1968, v. 94, N 4, p. 427−436.
  222. Thoai N., Chevillard L. Purification of thiamine phosphorylation proteins. Bull. Soc. Chem. Biol., 1949, v. 31,1. N 1, p. 204−212.
  223. Thome-Bean, Loen L.T., Olomucki A., Thoai N. L’ATP: Thiamine pyrophosphotransferase. Purification et etude du me-chanisme de reaction. Biochim. Biophys. Acta, 1969, v. 182, N 1, p. 111−121.
  224. Tokudo Y. Studies on thiamine biosynthesis. Enzymatic synthesis of thiamine diphosphate from thiamine monophosphate. Vitamins, 1964, v. 29, N 1, p. 40−46.
  225. Tomita I., Saiton S., Ishikawa M. Purification and properties of transketolase from pig liver. I. An attempt to resolve the enzyme into apoenzyme and cofactors. j. Nutr. Sci. Vitaminol., 1979, v. 25, N 2, p. 175−184.
  226. Ullrich J., Wittorf J.H., Gubler C.J. Molecular weight and coenzyme content of pyruvate decarboxylase from brewer yeast. Biochim. et Biophys. Acta, 1966, v. 113, N 3, p. 595−604.
  227. Ventura U., Ferrari G., Tagliatue R., Hindi G. A ki-netical study of thiamine intestinal transport in vitro. Life Sci., 1969, v. 8, N 5″ p. 699−705.
  228. Victor M., Adams R.D., Collins G.U. The Wernicke-Korsakoff syndrome: A clinical and pathological study of 245 patients, 82 With postmorten examinations. In: Contemporary Neurology, Philadelfia, eds. Davis S.A., 1971, p. 1−206.
  229. Wakabayashi Y. Some properties of the purified thiamin pyrophosphokinase from pig brain. Vitamins, 1978, v.52, N 5−6, p. 229−236.
  230. Warburg 0., Christian W. Isolierung und kristallisation der Garungsfermentsenolase. Biochem. Z., 1941, Bd 310, S. 384−390.
  231. Warnock Z.G., Prudhomme C.R., Wagner C. The determination of thiamine pyrophosphate in blood and other tissues and its correlation with erythrocyte transketolase activity.-J. Nutr., 1978, v. 108, N 5, p. 421−427.
  232. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determination by dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem., 1969, v. 244, N 6, p. 44 064 411.
  233. Weil-Mulherbe H. The enzymic phosphorylation of vitamin B^. Biochem. J., 1939, v. 33, p. 1997−2007.
  234. Westerbrink H.G.K., Stein-Parve E.P., Goldmit J.
  235. On the aneurin metabolism of animal tissues, in vitro. Enzy-mologia, 1942−1943, v. 11, p. 26−45.
  236. Westhead E.W. Photooxidation with rose bengal ofa critical histidine residue in yeast enolase. Biochemistry, 1965, v. 4, N 10, p. 2139−2144.
  237. White H.B., Dennison B.A., Ferra M.H., Whitney C.J., Mc-Guire J.C., Mesler H.W., Sammelwitz P.H. Biotin-binding protein from chicken egg yolk. Assay and relationship to egg-white avidin. Biochem. J., 1976, v. 157, N 2, p. 395−400.
  238. Wittorf J.H. Doctor Thesis. Provo (U.S.A.), 1968.
  239. Wittorf J.H., Gubler C.J. Coenzyme binding in yeast pyruvate decarboxylase. Kinetic studies with thiamine diphosphate analogues. Eur. J. Biochem., 1971, v. 22, N 4, p. 544 550.
  240. Wolley D.W., White A.G.C. Production of thiamine deficiency disease by the feeding of pyridine analog of thiamine. J. Biol. Chem., 1949, v. 149, N 1, p. 285−294.
  241. Wood В., Gigsbers A., Goode A., Stefen D., Mulholland J., Brin К. A studi of partial thiamin restriction in human volunteers. Am. J. Clin. Hutr., 1980, v. 33, N 4, p. 848−861.
  242. Yamada K., Kawasaki T. Properties of thiamine transport system in Escherichia coli. J. Bacterid., 1980, v. 141, H 1, p. 254−261.309″ Yusa T. Thiamine triphosphate in yeasts and some plant materials. Plant Cell. Physiol., 1961, v.2, N 3, p. 471−474.
  243. ДеВИИСКОГд -.эмсоиоли| 1Ы, 3−01-Сй, В-^2−24 /1. АКТ ВНЕДРЕНИЯ
  244. Зав. кафедрой госпитальнойтерапии доктор мед. наук, профе ссор1. Волков Н.Ф.1. Зав. кардиологическимотделением1. Технирядов В.И.1. ФОРМА № Р 2адешш медицинских v^ k1. J xcvufi cV> --я ,•¦ -, 480 124, А.ь., с-Лта, К. ", иг
  245. УТВЕРВДЕНА ЦСУ СССР 14/12.1972 № 8161. Et
  246. ДИРЕКТОР КАЗАХСКОГО ФИЛИАЛА ИНСТИТУТА ПИТАНИЯ АМН СССР, АЛМА-АТА АКАДЕМИК АМН СССР, ПРОФЕССОР
  247. ШАРМАНОВ Т.Ш. 15 марта 1983 г.
  248. АКТ О ВНЕДРЕНИИ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 15 марта 1983 года
  249. Предложение автора ст. научн. сотрудн. Отдела регуляции обмена веществ АН БССР Воскобоева А. И., изложенное в докторской диссертации «Ферменты биосинтеза, протеидизация и механизмы транспорта фосфорных эфироз тиамина».
  250. Краткое содержание предложения: предложен высокочувствительный, ферментативный метод определения концентрации кокарбоксилазы в биологических тканях, а также продуктах питания.
  251. После проведенного испытания признано годным к использованию и применяется с 15 февраля 1980 года.
  252. Внедрено в лаборатории обмена веществ Казахского филиала института питания АМН СССР.
  253. Ответственность за дальнейшее использование предложения возлагается на мл. научн. сотр. Шомаева A.A.
  254. Члены комиссии: Зав. лабораторией обменавеществ, канд. мед. наук1. Тажибаев Ш. С
  255. Ответственный за использование мл. науч. сотр.1. Шомаев A.A.
  256. Подписи к.м.н. Тажибаев, а Ш. С. и Шомаева A.A. Удостоверяю1. УТВЕЩЦАЮ"ектор Института ши им. А .В .Палладина СР, академик АН УССР1. В.К.ЛИШКО «ф^г^фЦ 1982 г1. АКТ ВНЕДРЕНИЯ
  257. Зав. отделом биохимии коферментов, доктор биологических наук, профессор2912.1982 г. 1. УССР
  258. Министерство высшего и среднего специального образования. Одесский государственный университет им. И. И. Мечникова. 270 000, Одесса, Шампанский пер., 2. 29 декабря 19Ш года
  259. Утверждаю » ?§-ктор Одесского го-гаенного универ-И.И.Мечникова1. В. Сердюк1. Справка
  260. Материалы диссертации используются при, чтении студентам Одесского государственного университета курса лекций по биохимии.
  261. Зав. кафедрой би Одесского госу- доктор мед. 'гп р о ф е с1. Розанов А.Я.
  262. Подпись зав. кщедрщ^Ш^мии ОГУ профессора заверяю: Зав. канцелярией
  263. ФОРМА № Р 2 УТВЕРЖДЕНА ЦСУ СССР 14.12.1972 Ш16
  264. TiMTpCci, проспект i>DvnaeяеЛ¡- .ПРОФЕССОР ?jl^® м.г.иАЧКК
  265. РЕКТОР ВШБСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО1. МЕДЩИНСКОГО ИНСТИТУ""1. УТВЕРХЩАЮ1inянзаря j983 г.
  266. АКТ О ВНЕДРЕНИИ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 15 января 1983 года
  267. Предложение автора ст. научн. сотр. Отдела регуляции обмена веществ АН БССР Воскобоева А. И., изложенное в докторской диссертации «Ферменты биосинтеза, протеидизации и механизмы транспорта фосфорных эфиров тиамина».
  268. Краткое содержание предложения: информация о путях регуляции ферментов обмена тиамина позволяет проводить коррекцию уровня ко-карбоксилазы в тканях при различных 'патологических состояниях, сопровождающихся угнетением фосфорилирования тиамина.
  269. После проведенного испытания признано годным к использованию в учебном процессе с 15 января 1983 года.
  270. Внедрено в лекционном курсе на кафедре биоорганической и биологической химии Витебского мединститута.
  271. Ответственность за дальнейшее использование предложения возлагается на доцента В. Д. Белиженко.
  272. Члены комиссии: И.о.зав. кафедрой1. А.А.Чиркин/1. В.Д.Белиженко/1. УТВЕРЖДАЮ"учебной работе1. УТВЕРВДАЮ'983 годаситета имени1. Е.П.Петряев
  273. АКТ об использовании (внедрении) НИР в учебном процессе
  274. Мы, нижеподписавшиеся, представители Белгосуниверситета имени
  275. B.И.Ленина: заведующий кафедрой биохимии, д.б.н. профессор А.Т.Пи-кулев- декан биологического факультета, к.б.н. доцент А.С.Щуканов- ученый секретарь НШ, Г. К.Кузичев- и.о. начальника учебного отдела
  276. Представители Белгосунивер- Представители Отдела регуситета им. В. И. Ленина: ляции обмена веществ АН БССР:
  277. Зав. кафедрой биохимии Ученый секретарь Отдела, д.б.н., профессор1. Декан биологического фа
  278. Руководитель патентно-лщен
  279. Зам. зав. Отдела организации и внедрения НИР1. Исполнитель к.б.н., ст. 1. Утверждаю" #5ав. Отделом ре^^ >бмена вей
  280. Утверждаю" Ректор Гродненского Государ--6елг^венного медицинского институ1. Л М/! О, ас луже нный деятель наук1. Г к" * •----1! -----1982г.?ь I ТТТ doдрофессор А. Маслаков----------1982г.1. АКТ о внедрении
  281. Преимущества данного метода исследования.
  282. Представитель Гродненского медицинского института Зав. кафедрой биологической химии, доцент, канд. мед. наук1. Н.К.
  283. Представители Отдела регуляции обмена веществ АН БССР ответственный исполнитель мл. науч., сотр.1. Гриценко Э.А.ст. науч. сотр., канд.биол.наук у&^О&рьэскобоев А.И.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!